Resumo não disponível.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a correlação entre parâmetros clínicos (TNM), graduação histopatológica, número de AgNORs por núcleo e expressão de Ki-67 na zona de invasão com o prognóstico de carcinoma espinocelular de língua. Foram selecionados dez casos de carcinoma espinocelular de língua e divididos em dois grupos: bom prognóstico (ausência de metástases á distância e/ou regionais, sobrevida livre de doença) e mau prognóstico (presença de metástases, recidiva, óbito). O material de biópsia foi submetido às técnicas de hematoxilina/eosina, de impregnação pela prata para evidenciação das NORs e de detecção imunohistoquímica do antígeno de proliferação nuclear Ki-67. Concluiu-se que T4 por si só já é um indicador de mau prognóstico e que nos tumores de grau II, a proliferação celular pode refletir o prognóstico do tumor.

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T05:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yonezawa_GiseleNunes_M.pdf: 5345722 bytes, checksum: 5bd69326a1dc0517c7d781dc121e6aa1 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A silicose é causada pela inalação de partículas de sílica resultando em doença inflamatória crônica, com formação de granulomas e fibrose pulmonar. Neste trabalho avaliamos a quimiotaxia , a fagocitose via CRI e CRJ e, a produção de ânion superóxido por monócitos de vinte e um indivíduos expostos cronicamente à sílica, e de quinze indivíduos normais. Observamos que a mediana da migração espontânea de monócitos foi de 27,90_; a migração de monócios estimulada com soro humano normal e soro de paciente incubados com LPS, , foi de 66,90µ e de 62,85µ respectivamente, no grupo de indivíduos expostos à sílica; no grupo controle, a migração espontânea de monócitos foi de 28,77µ (p=0,91), e a migração de monócitos estimulada com soro controle, incubados com LPS, foi de 61,20µ (p=0,77;p=0,57).O índice fagocitário para partículas de zimosan incubadas com meio, soro humano normal e soro de pacientes ou soro controle apresentaram medianas de 13,98,69,57 e 71,09 respectivamente, nos indivíduos expostos à sílica, e de 17,54, 68,49 e 68,49 no grupo controle. (p=0,34;p=0,40 e p=0,40). A mediana da capacidade fagocitária destes pacientes foi de 134,25; 385,25 e 390,0 para partículas de zimosan incubadas com meio, soro humano normal e soro de paciente, e no grupo controle foi de 128,25; 365,25 e 362,25 respectivamente.(p=0,83; p=0,52 e p=0,87).A produção espontânea de ânions superoxidos por monócitos apresentou mediana de 4,03 nos indivíduos expostos à sílica e de 3,30 no grupo controle (p=0,69) e de 9,24 nos pacientes e de 9,52 no grupo controle (p=0,71), quando estimulados com zimosan.Portanto não encontramos diferença significativa nas funções fagocitárias destes indivíduos em relação aos indivíduos normais. Também não observamos correlação entre estas funções estudadas e a classificação radiológica, tempo de exposição ou antecedente para tuberculose. Estes resultados sugerem que a sílica desencadeia uma resposta imune que é modulada e controlada no pulmão, resultando em discreta manifestação sistêmica / Abstract: The inhalation of silica partic1es leads to silicosis and the development of a chronic inflammatory disease involving granuloma formation and pulmonary fibrosis. In this work, we have evalueted the chemotaxis, CRI and CRJ mediated phagocytosis, and superoxide anion production of monocytes from 21 individuaIs who had experienced chronic exposure to silica and have compared the results with those from 15 unexposed individuals.In the former group, the median spontaneous monocyte migration distance was 27.9µ while that following stimulation by normal and patient's serum was 66.9 and 62.9µ in the presence of LPS, respectively. The corresponding values for monocytes from normal individuaIs were 28.8, 61.2 and 61.2µ. The monocyte phagocytic index in the presence of culture medium, normal serum and patient's serum was 14.0, 69.6 and 71.1, respectively, for the silica exposed individuaIs and 17.5, 68.5 and 68.5 for cells from unexposed persons. The median zymosan partic1e phagocytic capacity of patients monocyte in culture medium, normal serum and patient's serum was 134.3, 385.3 and 390.0, respectively, while the corresponding values for normal cells were 128.3, 365.3 and 362.3. The spontaneous production of superoxide anions was 4.0 and 3.3 nM/1O6cels/h in silica exposed and unexposed monocytes while in presence of zymosan these values were 9.2 and 9.5 nM/I06cels/h, respectively. ln none ofthe above monocyte function tests was there any significant difference between the cells fron silica-exposed and unexposed individuaIs. There was also no correlation between any of the tests results and the radilogical c1assification, length of exposure, or antecedents of tuberculosis. These results therefore suggest that silica initiates an immune response that is modulated and controlled within the lung although there may be subsequent discrete systemic manifestations / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Maria Luiza S. Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T03:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbisan_Luisfernando_M.pdf: 8010012 bytes, checksum: b999da798b8e914b384a9b5b7b8bcedb (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Alterações morfofisiológicas celulares enucleares foram investigadas através de métodos citoquímicos e de análise de imagem em células epiteliais mamárias humanas, MCF-IOF, transformadas com o benzo[a]pireno, e que expressam diferentes estágios da progressão tumoral (clones BPl, BPI-E e BPI-El), e, adicionalmente, num clone transfectado com o oncogene c-Ha-ras (BPl- Tras). Um aumento no índice mitótico foi observado com a progressão neoplásica. Por outro lado, um aumento em células apoptóticas, evidenciadas por uma variante do método de concentração crítica de eletrólitos, foi observado somente nas células BPI-Tras. Relocação de RNA durante a mitose, identificável por resposta metacromática, não diferiu quando se compararam células MCF-lOF transformadas e não transformadas, exceto com relação à presença de corpos semelhantes a nucléolos ("nucleolus-like bodies") encontrados próximos à placa cromossômica na metáfase ou ao fuso nas fases mitóticas subsequentes. Estes corpos não foram abundantes nas células MCF-lOF não transformadas e se tornaram mais escassos ainda nos clones celulares transformados, talvez por menores quantidades de RNA excedentes estarem envolvidas em tais condições. Pleomorfismo nuclear foi predominante nos clones celulares que expressam o fenótipo tumorigênico (BPI-E, BPI-El e BPI-Tras). Anormalidades nucleares tais como, cariorréxis, cariólise, multinucleação e micronúcleos foram mais freqüentes nas células BPl- Tras. Todos os clones exibiram células binucleadas e gigantes, mas nenhuma alteração nas suas frequências puderam ser detectadas quando os vários clones celulares foram comparados entre si. Alguns fenótipos nucleares puderam ser caracterizados nas células transformadas e não transformadas. Entretranto, estes poderiam estar associados com a progressão neoplásica, ou mesmo, com as diferentes fases do ciclo celular. Uma diminuição na área, perímetro e fator forma nucleares, mas um aumento na área e perímetro nucleolares foram encontrados com o avanço do processo tumorigênico nas células transformadas com o benzo[a]pireno. Estas alterações podem ser devidas a uma diminuição nas quantidades Feulgen-DNA (hipodiploidia) e/ou a um aumento nos estados de empacotamento cromatínico, embora um aumento na atividade transcripcional ocorra a nível nucleolar. Em particular, os tamanhos e perímetros nucleares das células BPl- Tras aumentaram quando comparados aos das células BP1, BPI-E e BPI-El, mas não diferiram dos valores para células MCF-IOF não transformadas. O aumento na área e no perímetro nuclear pode estar associado a uma certa aneuploidia promovida pela transfecção com o oncogene c-Ha-ras. Os tamanhos e número de nucléolos nas células BPI-E e BPI-Tras diferiram dos das outras células, e, um aumento da tamanho nucleolar com uma diminuição do número de nucléolos foi observado ocorrer nas células BPI-E e BPI-Tras. Fusão nucleolar e aumento em tamanho certamente refletem atividades metabólicas aumentadas nas células BPI-E e BP1 Tras quando comparadas aos outros clones celulares. Os dados de morfometria nuclear nos clones celulares transformados pelo benzo[a]pireno e transfectados com o oncogene c-Ha-ras indicam a existência de mecanismos morfofuncionais distintos e complexos que envolvem a progressão neoplásica de células MCF-lOF in vitro. O aumento na frequência de células micronucleadas e multinucleadas e aneuploidia nas células BP 1- Tras poderia estar relacionado à instabilidade genética induzida pela transfecção do oncogeneraso / Abstract: Cellular and nuclear morphophysiological changes were investigated by cytochemistry and image analysis in clones of human breast epithelial cells, MCF-I0F, transformed by benzo[a]pyrene and expressing different stages of progression to neoplastic transformation (BP1, BPI-E and BPI-El clones), and additionally transfected with the c-Ha-ras oncogene (BP 1- Tras). A mitotic index increase was observed with the neoplastic progression. On the other hand, an increase in frequency of apoptotic celIs, as identified by a critical electrolyte concentration method, was only observed in BP 1- Tras celIs. RNA relocation during mitosis, identified by a metachromatic response, was found to differ when comparing nontransformed and transformed MCF-lOF cells. The exception refers to the presence of nucleolus-like bodies found close to the chromosomal plate at metaphase or to the spindle in subsequent mitotic phases. These bodies were not abundant in nontransformed IvlCF-l OF celIs, and become much more scarce in the transformed celIs, possibly due to decrease in surplus RNA involved. Nuclear pleomorphism was predominant in the cell clones expressmg tumorigenesis phenotypes (BPI-E, BPI-El and BP1- Tras cells). Nuclear abnormalities such as karyorhexis, karyolysis, multinucleation and micronucleation were more frequent in BP 1- Tras celIs. AlI celI clones exhibited binucleate and giant celIs, but no change in their frequencies could be detected when comparing the various cell clones. Some nuclear phenotypes could be characterized in the nontrasformed and transformed cells. However, they may be associated with the neoplastic progression or even with different cell cycle phases. A decrease in nuclear area, perimeter and form fator, but an increase in nucleolar area and perimeter were found with advancing tumorigenesis process in the benzo[ a ]pyrene-transformed cells. These changes may be due to a decrease in Feulgen-DNA amounts (hypodiploidy) and/or increase in chromatin packing states, although an increased transcriptional activity occurs at the nucleolar leveI. In particular, the nuclear sizes and perimeter of BP 1- Tras cells increased as compared to those of BP1, BPI-E and BPI-El cells, but were not found to differ from values ofthe nontransformed MCF-I0F cells. The nuclear area and perimeter increase may be associated to a certain aneuploidy degree promoted by the rastransfection. Nucleolus sizes and numbers in BPI-E and BPI-Tras cells were found to differ from those ofMCF-lOF, BPl and BPI-El cells, and nucleolar sizes increasing with the decrease in nucleolus numbers were observed in BPI-E BP1 Tras cells. Nucleolus fusion and enlargement certainly reflect metabolic activities enhanced in BPI-E and BPI-Tras cells when comparing these to the other cell clones. The nuclear morphometry data on the benzo[ a ]pyrene-transformed cells and on those additionally transfected by the c-Ha-ras oncogene indicated the existence of complex and distint morphofunctional mechanisms involving of the in vitro transformation of the MCF-I0F cells. The increase in frequency of micronuclei and multinucleate cells and in aneuploidy in the BP 1- Tras cell clone could be related to the genomic instability induced by ras-transfection / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Leonilda Maria Barbosa Santos, Ilma Aparecida Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T08:08:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_AnaliaZuleikade_M.pdf: 5313468 bytes, checksum: 7ab49045ee18e55595dcf9f1515981c3 (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Maria Lucia Furlan Wada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T08:10:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SantosJunior_ArnaldoRodriguesdos_M.pdf: 16235737 bytes, checksum: 253e7da352aa44404b2c338171159327 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Células Vero foram cultivadas sobre géis 3D de colágeno tipo I ou em lamínulas de vidro por 48h com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após este tempo de cultivo as células passaram a ser mantidas em meio sem SFB, com 10 % de SFB, com 10 % de SFB mais dexametasona (DEX) e com 20 % de SFB. Amostras foram fixadas após 48h, 120h e 240h de cultivo. Os géis foram incluidos em paraplast e cortados com 7Jlm de espessura. As amostras foram coradas com hematoxilina-eosina (HE), cresil violeta (CV), azul de toluidina (A T) e xylidine ponceau (XP). Foi realizado também imunocitoquímcia para colágeno IV (CaL IV) e para fibronectina (FN). Com as células cultivadas sobre lamínulas foram obtidos os índices mitóticos e as curvas de crescimento da cultura. Células cultivadas em colágeno por 24h, foram analizadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Um ensaio em microplacas para a adesão celular com 24h de cultivo também foi realizado. As células que foram cultivadas sobre lamínulas e coradas com CV, em todos os casos analisados, mostravam morfologia irregular e com alguns prolongamentos, exceto nas regiões confluentes onde encontramos apenas células com formas poliédricas. Encontramos também a formação de grumos celulares nas amostras tratadas com DEX. Material bem corado com XP foi evidenciado tanto com 120h quanto com 240h de cultivo. Os grumos celulares nas amostras tratadas com DEX foram os pontos onde encontramos coloração mais intensa. O A T mostrou nas primeiras 48h células com citoplasma, núcleo e nucléolo metacromáticos. Com 120h de cultivo foram detectadas células com núcleos ortocromáticos, nucléolo basófilos e citoplasma levemente metacromático em quase todas as amostras, exceto nas tratadas com DEX, onde encontramos citoplasma intensamente metacromático. Com 240h de cultura encontramos células com citoplasma, núcleo e nucléolos metacromáticos (S/SFB e 10% SFB) e células com núcleos ortocromáticos, nucléolos e citoplasma metacromáticos (10% SFB+DEX e com 20% SFB). A imunocitoquímica mostrou a presença de CaL IV nas amostras mantidas S/SFB, com 10% SFB e com 20% SFB, mas não nas células cultivadas com DEX. Encontramos a presença de FN em todos os casos, porém foi encontrado um arranjo mais homogêneo nas células que cresceram na presença de 10% SFB+DEX e 20% SFB. Dados citoquímicos e imunocitoquímicos mostraram que o DEX interfere no padrão de crescimento de células sobre lamínulas. A MEV mostrou um grande espalhamento celular e deposição de material fibrilar, cuja deposição é estimulada pela variação da concentração dos componentes do SFB. O ensaio com microplacas mostrou que a adesão das células ao substrato também é estimulada pelo SFB. A análise morfológica feita com HE mostrou nos géis nas primeiras 48h uma monocamada de células achatadas, embora em alguns pontos as mesmas mostravam-se com duas ou três camadas de células arredondadas. Ambos os casos mostraram-se bem evidenciados pelo XP e as células apresentavam também metacromasia quando corado com AT. Com 120h e 240h em meio S/SFB ou com 10% de SFB, coradas com HE, foram observadas células formando um estrato com várias camadas arredondadas além de vários pontos de infiltração para o interior do substrato. Estas células apresentavam núcleos e citoplasma metacromáticos, quando corados com A T. Também encontramos granulações metacromáticas ao redor das células no interior do gel. Nesses experimentos o XP mostrou células bem coradas tanto no citoplasma como no núcleo. O gel também foi levemente corado pelo XP. As granulações presentes na matriz colagênica junto as células infiltradas também foram coradas pelo XP. A análise imunocitoquímica mostrou deposição de FN mas não de COL IV. Concluimos que nessas condições experimentais, S/SFB ou com 10% de SFB, as células cultivadas nos géis de colágeno, organizam uma estrutura semelhante a um tecido conjuntivo frouxo. Por outro lado, a HE mostrou que as células que foram tratadas com DEX (um inibidor da síntese de colagenases) e com 20% de SFB (que contém <X2-macroglobulina, um inibidor de atuação de colagenases) não invadiram a matriz colagênica, permanecendo com muitas camadas celulares, com forma arredondada na camada basal e achatada nas superiores. O A T mostrou células com núcleos e citoplasma metacromáticos, além de evidenciar uma camada acelular entre as células e o substrato. Todos as camadas celulares também foram bem coradas pelo XP. A imunocitoquímica mostrou que quando a infiltração foi bloqueada as células não produziram FN mas sim uma camada de COL IV. Os dados citoquímicos e imunocitoquímicos nos demonstraram que quando usamos inibidores de colagenases, as células Vero formam um tecido com características epiteliais e produzem uma estrutura semelhante à membrana basal / Abstract: The Vero celIs were cultured on a colIagen I gel or a glass coverslip with 10% fetal calf serum (FCS) for 48hs. After this incubation time, samples were cultured without FCS, or with 10% FCS, 10% FCS plus dexamethasone (DEX) or 20% of FCS. Samples were harvested after 48hs, 120hs, and 240hs and fixed. The gels were embedded in paraplast and 7J.lm thick sections were obtained. The samples were stained with hematoxilin-eosin (HE), cresil violet (CV), toluidine blue (TB) and xylidine ponceau (XP). Immunocytochemical tests were carried out for colIagen IV (COL IV) and fibronectin (FN). The mitotic index and the growth curve were obtained for celIs cultured on coverslip. The celIs cultured on colIagen gels for 24hs were studied with scanning electron microscopy (SEM). An assay for celIular adhesion during 24hs was also performed on 96 welIs microplate. The celIs cultured on coverslips, stained by CV, showed an irregular morphology with celIular processes, and a poliedric form on the confluent areas in alI the celIs studied. We also found the formation of many celIular aggregates in the samples treated with DEX. AlI samples were stained with XP, after 120hs or 240hs of culture. The celIular aggregates induced by DEX were stained by XP. The TB staining showed celIs with metachromatic cytoplasm, nuc1ei and nuc1eoli in the first 48hs. With 120hs of culture we found celIs with ortochromatic nuc1ei and light metachromasy in nuc1eoli and cytoplasm. With 240hs we found celIs with metachromatic nuc1ei, nuc1eoli and cytoplasm (without FCS and with 10% FCS) and celIs with ortochromatic nuc1ei, metachromatic nuc1eoli and cytoplasm (with 10% FCS + DEX or 20% FCS). The immunocytochemical experiment showed that COL IV was present in the samples cultured without FCS or with 10% FCS and 20% FCS, but it was not found in the celIs cultured with DEX. FN was present in alI samples but in the celIs cultured with 10% FCS + DEX or 20% FCS we found a more homogeneous arrangement. Cytochemical and immunocytochemical data showed that DEX modifies the growth of Vero celIs cultured on a coverslip. The SEM showed that celIular spreading and the synthesis of fibrillar material was stimulated by FCS. The microplate assay showed that celIular adhesion to the substratum is also stimulated by changes in concentration of the serum component. The morphological study of celIs cultured on a colIagen substratum was made with HE. In the first 48hs of culture we found a monolayer of flattened celIs on the colIagen substratum. We observed also the same celIs with a round morphology growing in 2-3 layers. These celIular layers were stained with XP and showed metachromatic cytoplasm when stained with TB. CelIs cultured during 120hs or 240hs without FCS or with 10% of FCS formed many layers of rounded cells capable of invading the collagen substratum. These cells showed a metachromatic cytoplasm and basophilic nuc1ei and nuc1eoli when stained with TE. We could see some metachromatic granulations surrounding the cells in the collagen gel. In these experiments XP staining showed cells with stained cytoplasm and nuc1ei. The collagen gel was also stained with XP. The granulations present in the matrix surrounding infiltrated cells stained with XP. The immunocytochemical tests showed the prodution of FN but not COL IV. We conc1uded that in these cases, the cells form a loose connective tissue like structure. On the other hand, cells cultured with 10% FCS + DEX, a collagenase synthesis inhibitor, or with 20% FCS, which contains a2­macroglobulin, a collagenase activity inhibitor, did not invade the collagen matrix and formed a multiple cell layers, where round cells occur on the basal layers and flattened cells on higher layers. All cells of these extracts were stained with XP. TB staining showed cells with cytoplasmatic metachromasy and basophilic nuc1ei and nuc1eoli. We could see also an acellular layer stained with TB between the cell and the substratum and with a immunocytochemical method we identified in the same areas a COL IV rich region. FN was not found. These cytochemical and immunocytochemical data showed that when we use collagenase inhibitors the Vero cells form a epitheliallike tissue and produce a structure similar to a basement membrane / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jose Butori Lopes de Faria / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T22:41:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_LiliaAikawada_M.pdf: 13028926 bytes, checksum: 60007686a1ea56bb40f0135ab7b921dd (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Com a finalidade de estudar se a genética da hipertensão modifica os eventos celulares renais observados no diabetes mellitus experimental, estudou-se a replicação celular renal e sua regulação por um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK), o p27Kipl,em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) em fase pré-hipertensão e seus controles geneticamente normotensos, os ratos Wistar Kyoto (WKY), com diabetes mellitus induzido por estreptozotocina. A injeção de estreptozotocina foi administrada nos animais com 4 semanas de idade e os estudos realizados apóslO dias de duração do diabetes. A replicação celular foi estimada pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), um análogo da timidina que liga-se ao DNA na fase de síntese, através da técnica de imunohistoquímica...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: To mvestigate if the genetics of hypertension modifies the renal cell events in experimental diabetes mellitus we studied the renal cell replication and its regulation by a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, p27KiPI, in pre-hypertensive spontaneously hypertensive rats (SHR) and their genetically normotensive counterparts, Wistar Kyoto (WKY) rats with streptozotocin induced diabetes mellitus. Animals received streptozotocin mjection at 4 weeks of age and the experiments were performed after 10 days of duration of diabetes. The number of replicating cells was assessed by incorporation of bromodeoxyuridIDe(BrdU), a thymidme analogue that incorporates to DNA m S phase, using immunohistochemistry technique...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Carmino Antonio de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:05:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Visentainer_JeaneElieteLaguila_D.pdf: 1194644 bytes, checksum: d07a083add30d2d7b71ee0a06824e08e (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo:O transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas é o tratamento de escolha para muitas doenças hematológicas e imunodeficiências primárias. A seleção de doadores é baseada na definição de moléculas HLA-A e B por sorologia, de alelos HLA-DRB1 e DQB1 por técnicas de biologia molecular e na cultura mista de linfócitos. Apesar disto, a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) é ainda uma grave complicação, que ocorre em aproximadamente 35% dos receptores de medula HLA-idênticos. O presente estudo teve por objetivo avaliar o poder prognóstico da ocorrência de rejeição e GVHD dos seguintes testes laboratoriais: (1) cultura mista de linfócitos clássica (CML) e potencializada com citocinas exógenas (CMLp); (2) tipagem de genes de citocinas, pela técnica de PCR-SSP e (3) seguimento do nível sérico de citocinas dos pacientes transplantados, empregando-se métodos imunoenzimáticos quantitativos. No estudo, foram avaliados 118 transplantes, com doadores HLA-idênticos, realizados no Centro de Hematologia e Hemoterapia e Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, de agosto de 1994 a fevereiro de 2002. Na CMLp, a resposta dos linfócitos do doador contra as células do receptor (DxR) foi aumentada 1,9 e 4,1 vezes, com a adição de IL-4 (100 hg/mL) e IL-2 (10 hg/mL), respectivamente. Todavia, a resposta do doador contra suas próprias células (DxD) também sofreu um incremento de 2,0 e 6,4 vezes, respectivamente. Como o tratamento avaliado também induziu aumento das respostas autólogas, o emprego da CMLp não trouxe vantagens adicionais ao método tradicional (CML), que mostrou correlação com a incidência de GVHD crônica. A análise do polimorfismo dos genes reguladores de citocinas mostrou que, os genótipos de TNF-a-308, IFN-g+874, IL-6-174, IL-10-1082, -819, -592 e TGF-b1+869, +915 não foram associados ao risco aumentado de GVHD aguda e rejeição, enquanto o fenótipo de baixo produtor de IL-6 mostrou associação com GVHD crônica. O acompanhamento da variação dos níveis séricos de sIL-2R, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-g e TGF-b1 dos receptores até 15 semanas pós-transplante revelou que, os níveis médios de sIL-2R e IL-10 foram maiores no grupo que desenvolveu GVHD aguda (776,4 ± 65,5 rg/mL e 10,9 ± 3,3 rg/mL) em relação ao grupo que não desenvolveu esta doença (541,1 ± 17,3 rg/mL e 2,5 ± 2,2 rg/mL). Os níveis de sIL-2R no período de ¿pega¿ do enxerto (1.165,0 ± 179,2 rg/ml vs. 578,0 ± 47,2 rg/ml) e ao tempo da GVHD aguda (926,4 ± 142,5 rg/ml vs. 496,5 ± 48,7rg/ml) também diferiram entre os grupos. A cinética destas citocinas também revelou que os níveis de TNF-a e TGF-b1 foram correlacionados com GVHD aguda. Nas primeiras semanas após o transplante, os níveis de TNF-a foram associados a GVHD aguda (72,7 ± 2,6 rg/mL vs. 38,1 ± 1,7 rg/mL). Nas últimas semanas, os níveis de TGF-b1 foram menores no grupo que desenvolveu a GVHD aguda (7,5 ± 1,4 hg/ml), comparado ao grupo sem a doença (17,0 ± 1,6 hg/ml). Assim sendo, o monitoramento dos níveis séricos de sIL-2R, IL-10, TNF-a e TGF-b1 poderia fornecer ao clínico um indicativo do risco de GVHD aguda, enquanto a genotipagem de IL-6-174 poderia oferecer um novo método para identificar pacientes ao risco de GVHD crônica / Abstract: Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the chosen treatment for many hematological diseases and primary immunodeficiency¿s. The donor¿s selection has been based on the serological definition of HLA-A and B, in the definition of HLA-DRB1 and DQB1 by DNA-based molecular method and in the standard mixed lymphocyte culture. Regardless, the graft-versus-host disease (GVHD) is still one of the several complications that occur in approximately 35% of HLA-identical bone marrow recipients. The objective of this study was to evaluate the prognostic power of rejection and GVHD development of laboratorial assays: (1) standard mixed lymphocyte culture (MLC) and potencialized (MLCp) with exogenous cytokines; (2) typing of cytokine genes, by PCR-SSP, and (3) following-up of serum level cytokines from transplanted patients, using quantitative enzyme-linked immunoassays. From August 1994 to February 2002, it was analyzed 118 transplants, with HLA-identical donors, who had been performed in the Hematological and Hemotherapy Center and Clinic¿s Hospital at Campinas State University. In the MLCp, the donor lymphocyte response versus receptor cells (DxR) was augmented 1.9 and 4.1 times with IL-4 (100 hg/mL) and IL-2 (10 hg/mL) supplementation, respectively. However, the donor response versus their selves-cells (DxD) also augmented, 2.0 and 6.4 times, respectively. Since this treatment also stimulated an increase of autologous responses, MLCp did not have advantages on relation to standard method (MLC) that showed a correlation with the incidence of chronic GVHD. Cytokine gene polymorphism analysis showed that TNF-a-308, IFN-g+874, IL-6-174, IL-10-1082, -819, -592, and TGF-b1+869, +915 genotypes were not associated to increased risk of acute GVHD and rejection, whereas the IL-6 low producer phenotype showed significant statistical association to chronic GVHD. The following-up of sIL-2R, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-g, and TGF-b1 recipient serum levels during 15 weeks post-transplant showed that sIL-2R and IL-10 average levels were higher in the group with acute GVHD (776.4 ± 65.5 rg/mL and 10.9 ± 3.3 rg/mL), than in the group without the disease (541.1 ± 17.3 rg/mL and 2.5 ± 2.2 rg/mL). Soluble IL-2 receptor levels at the engraftment and at onset of acute GVHD were also different between the groups with and without acute GVHD (1.165.0 ± 179.2 rg/ml vs. 578.0 ± 47.2 rg/ml and 926.4 ± 142.5 rg/ml vs. 496.5 ± 48.7rg/ml), respectively. The cytokine kinetics also showed that TNF-a and TGF-b1 levels were associated with acute GVHD. In the first weeks after the transplant, high TNF-a levels were associated with acute GVHD (72.7 ± 2.6 rg/mL vs. 38.1 ± 1.7 rg/mL). In the last weeks, TGF-b1 levels were lower in the group with acute GVHD (7.5 ± 1.4 hg/ml) than those in the group without the disease (17.0 ± 1.6 hg/ml). Therefore, the monitoring of sIL-2R, IL-10, TNF-a, and TGF-b1 serum levels after the transplant can provide to physician an indication of acute GVHD risk, while IL-6-174 genotype may offer a new method for identifying patients at increased risk of chronic GVHD / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Nora Marcela Haun Quiros, Patricia da Silva Melo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:32:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anazetti_MaristellaConte_M.pdf: 6470098 bytes, checksum: e8af921549af2ef3a2641ca1d869e984 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Atualmente, morte celular por apoptose é objeto de intensa pesquisa devido à susceptibilidade de células tumorais, incluindo linhagens de células de leucemia e de linfoma, a sofrerem este tipo de morte celular em resposta a determinados agentes anti tumorais. O estresse oxidativo induzido, entre outros fatores, pela diminuição dos níveis de glutationa intracelular, está envolvido no mecanismo de ação de vários compostos, sinalizando as células ao processo apoptótico, envolvendo eventos mediados por cisteino proteases (caspases). Neste estudo, nós examinamos a indução de diferenciação morfológica e morte celular por apoptose pela dimetilamida-crotonina (DCR) em células da leucemia promielocítica humana HL60. A DCR é um derivado sintético da desidrocrotonina (DHC), uma diterpeno lactona extraída das cascas de Croton cajucara, uma planta da região amazônica. A DCR apresentou um efeito inibitório similar ao composto original conforme avaliado por diferentes parâmetros de citotoxicidade e ambos os compostos induziram diferenciação fenotípica em células HL60. Em contraste, não foram observadas citotoxicidade ou alterações morfológicas associadas com apoptose em linfócitos de sangue periférico humano após tratamento com os compostos em estudo nas concentrações utilizadas (O - 400flM). Com base nas alterações morfológicas, no padrão de &agmentação de DNA e na análise de simetria de membrana de células marcadas com anexina V liodeto de propídeo por citometria de fluxo, DHC e DCR induziram apoptose em células HL60 com a mesma eficiência. Ambos os compostos promoveram a ativação de caspases-2, -6 e -9. A ativação de caspase-9 pela DHC e DCR em células HL60 sugere indução de apoptose através da via mitocondrial. Com o intuito de analisar o possível envolvimento do estresse oxidativo no mecanismo de toxicidade dos compostos, foram determinados os níveis de glutationa e ocorrência de peroxidação lipídica. O nível de GSH diminuiu cerca de 30% e a produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) aumentou 4 vezes após o tratamento com ambos os compostos em concentrações próximas ao ICso (250 JlM). A suplementação do meio de cultura com 15 mM de GSH protegeu as células da toxicidade induzida pelos compostos em estudo. Nossos resultados indicam que a DCR e a DHC induzem apoptose em células HL60 em parte pela conjugação com GSH e indução de estresse oxidativo, o qual seria responsável pela peroxidação lipídica e ativação da cascata de caspases através da via mitocondrial. Além disso, resultados de espectroscopia UV Nis sugerem a formação de conjugados entre a GSH e o grupamento O=CH-CH=CH2, presente na DHC e na DCR. Desta forma, os compostos estudados possuem características almejadas para quimioterápicos desencadeando indução de diferenciação morfológica e de apoptose em células da leucemia HL60 / Abstract: Apoptosis is subject of intense research due to the susceptibility of tumor cells, including leukemia and lymphom celllines that have been found to undergo this kind of cell death in response to antitumor agents. The oxidative stress induced, by others factors, by the decrease of glutathione levels is involved in the action mechanism of several compounds, signalIing the celIs to apoptotic process, involving events mediated by cystein proteases (caspases). In this study, we evaluated the morphological differentiation and celI death by apoptosis induction by dimethylamide-crotonin (DCR) in human HL60 promylocitic leukemia cells. The DCR is a synthetic derivative of dehydrocrotonin (DHC), a diterpene lactone isolated ftom the Croton cajucara, an Amazonian planto The dimethylamide crotonin presented a similar inhibitory effect that its parent compound evaluated by different endpoints of cytotoxicity and both compounds induced morphological differentiation on HL60 cells. In contrast, no cytotoxicity or morphological alterations associated with apoptosis were observed in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after treatment with these studied compounds in the concentrations used (0-400 flM). Based on morphological changes and the pattem of DNA ftagmentation and the symmetry analysis of cell membrane labelIed with annexin V /propidium iodide by flow cytometry, DHC and DCR induced apoptosis on HL60 cells with similar efficiency. Both compounds were effective in triggering the activation of caspase-2, -6 and -9. The caspase 9 activation by DHC and DCR on leukemic cells suggests apoptosis induction by the mitochondrial pathway. In attempt to analyse the possible involvement of oxidative stress on the toxicity action mechanism of these compounds, we determined the GSH levels and lipid peroxidation occurrence. The glutathione levels decreased around 30% and the thiobarbituric acid substance reactive (TBARS) increased 4 times after treatment with both compounds in concentrations around the IC50 value (250 1lM). The culture medium supplementation with 15-mM GSH protected the cells :tIom the toxicity induced by both compounds. The results indicate that DHC and DCR induce apoptosis on HL60 cells in part by conjugation with GSH and oxidative stress induction, which could be responsible for lipid peroxidation and caspases activation by the mitochondrial pathway. Moreover, the spectroscopic analyses of DHC or DCR in the presence of GSH 15 mM suggest the conjugate formation between GSH and O=CH-CH=CH2 of DHC or DCR In this way, the studied compounds have the desirable hemotherapic characteristics, triggering cell differentiation and apoptosis / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Selma Candelaria Genari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:31:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_NailaFrancisPaulode_M.pdf: 3107927 bytes, checksum: ddd1703cab1bc79c091cc502cc1e0f07 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Alguns fármacos apresentam potencial quimioterápico contra neoplasias, por inibirem a proliferação celular e induzirem a morte celular. Muitos desses agentes podem apresentar efeitos citotóxicos em tecidos normais como linfopenia, devido à indução de apoptose com diminuição das células T CD4, podendo levar a implicações na resposta imune. O tamoxifeno (T AM) é um agente não esteróide antiestrógeno utilizado como quimioterápico coadjuvante no tratamento de câncer de mama. Trabalhos recentes têm demonstrado que o T AM pode causar câncer endometrial em pacientes pós-menopausa, como sério efeito colateral. O presente trabalho objetivou investigar a capacidade do T AM de induzir apoptose em linfócitos humanos cultivados in vitro. Para tanto, amostras de sangue de voluntárias jovens (grupo A= 25 a 30 anos;n=3) e idosas (grupo B= 58 a 77 anos;n=3), foram centrifugadas em gradiente de densidade de Percoll (percoll-50%) para separação de linfócitos e monócitos. Os monócitos foram excluídos por cultura dependente de adesão por 2 horas. O sobrenadante contendo linfócitos controle foram cultivados em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino por 24 e 48 horas, enquanto linfócitos, denominados tratados, receberam 20J.1M de T AM no meio de cultura. Após a cultura, as células foram: 1) contadas em hemocitômetro, sendo estipulado a porcentagem de células viáveis para o total de células analisadas, utilizando-se o método de exclusão pelo Azul Tripan; 2) incubadas com anexina-biotina, que possui alta afinidade pela fosfatidilserina, seguido de incubação com anti-biotina conjugada à fluoresceína, para marcação das células em apoptose e analisadas ao microscópio de fluorescência; 3) fixadas em formaldeído e coradas com Leishman para estudos em microscopia de luz (ML); 4) depositadas em lamínulas, fixadas em glutaraldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV); 5) fixadas em solução de glutaraldeído, ácido pícrico e formaldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão (MET); 6) a análise estatística foi realizada a partir de análise de variância one-way ANOV A com p< 0,05. As culturas tratadas demonstraram menor viabilidade celular e maior índice apoptótico que seus controles. Ainda, culturas controle e tratadas de linfócitos de mulheres idosas apresentaram maior porcentagem de células em apoptose quando comparadas com linfócitos de mulheres jovens. Os estudos em ML e MET revelaram maior condensação cromatínica e redução do volume celular, e ainda, ao MET foram observados vacúolos autofágicos no citoplasma. A MEV revelou células com perda de microvilosidades e perda da morfologia arredondada após 48 horas de tratamento. Conclui-se, então que os linfócitos foram afetados pelo tratamento com o TAM em ambos os grupos, embora o grupo de mulheres idosas se mostrou mais susceptível a apoptose / Abstract: Some drugs have a chemotherapic potential against neoplasms, through inhibition of proliferation and cell death induction. Many of these agents can display cytotoxic effects in normal tissues such as lymphopeny due apoptosis induction with a consequent decrease of T CD4 cells and its implications in the immune response. Tamoxifen is a synthetic non steroidal antiestrogenic drug which is currently being widely employed in the treatment of female breast cancer. Recent studies have shown that TAM can cause endometrial cancer in postmenopausal patients, considered a serious side effect. The purpose of this work was to investigate the capacity of T AM to induce apoptosis in human lymphocytes cultivated in vitro. Samples of peripheral blood were obtained from young (group A= 25-30 years 0Id;n=3) and old (group B= 58-77 years 01d;n=3) women and centrifuged in a Percoll density gradient, to separate lymphocytes and monocytes (percoll-50%). Monocytes were excluded by culturing for 2 hours. The supernatant with control lymphocytes was cultivated in RPMI containing 10% fetal bovine serum, for 24 and 48 h as controls, whereas treated lymphocytes received TAM (20JlM) added to the culture medium. After the culture, the cells were: 1) counted in a hemocytometer, and the viable cell number for each sample was obtained through an exclusion test of intact cells by using 1 % Tripan Blue and establishing the percentage of unstained, alive cells for the total of ressuspended cells; 2) incubated with annexin-biotin, which has high affinity for phosphatidilserine (PS), followed by incubation with FITC conjugated anti-biotin, to target apoptotic cells and examined by fluorescence microscopy; 3) fixed in formaldehyde and stained with Leishman and examined by light microscopy (LM); 4) placed on coverslips, where the cells were fixed, post fixed in osmium tetroxide and examined with the scanning electron microscope (SEM); 5) fixed in in glutaraldehyde, formaldehyde and picric acid, post fixed in osmium tetroxide, and examined in a transmission electron microscope (TEM); 6) statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOV A) with p< 0.05. The treated cultures showed less viable cells and more apoptotic cells than control cultures. Moreover, group B showed more apoptotic cells in comparison with group A, in both control and treated cultures. LM and TEM showed treated cells with more condensed chromatin and reduction of cell volume. In TEM some autophagic vacuoles in the cytoplasm were observed. SEM showed loss of microvilli and loss of spherical shape at 48 h, when compared with the controls. Thus, a response to TAM was observed in both groups, although group B was more susceptible to apoptosis / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural