Breast cancer is the most common cancer in Canadian women. The choice of treatment is based on the expression of markers such as the estrogen receptor (ER), the membrane receptor HER2 and the proliferation marker KI-67, detected by immunohistochemistry (IHC). Although some breast tumors may be heavily infiltrated by immune cells, the expression of immune checkpoint inhibitors (ICIs) by both immune and cancer cells promotes tumor growth. In particular, tumor expression of B7H4 has been associated with a high rate of metastasis and an inverse correlation with CD8+ T cells. In order to better characterize B7H4 expression patterns, levels of this protein as well as markers of immune infiltrate, immune checkpoint and EMT were characterized by IHC using six tissue microarrays constructed from 123 FFPE samples from the Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM). B7H4 expression (% positive cells) was quantified by QuPath software (version 0.2.0 m9), while EMT was assessed semi-quantitatively by Khadri et al. (2020). Our results show that B7H4 is highly expressed exclusively by tumor cells in all subtypes (mean 22.5% to 43.3%), with lower levels in luminal B (LB) and HER2-positive (HER2+) tumors. Multivariate analysis of the Metabric cohort of breast tumor transcriptome profiles (1980 tumors) further showed that B7H4 RNA levels are inversely associated with those of Ecad (p=0.0001), the same trend was observed in our cohort, and are strongest in lobular tumors (Ecad-). Furthermore, analysis of a TCGA cohort (754 tumors) revealed a positive correlation of B7H4 transcripts with YAP, TAZ, VGLL1 and TRIM29 (Pearson correlation coefficient >0.4), inducers of TEAD transcription factors repressed by the Hippo signaling pathway. In particular, YAP has a similar expression pattern to B7H4, higher in basal and luminal subtypes. These results suggest that the role of B7H4 in the progression of these tumors may be linked to the Hippo pathway, which controls the growth, proliferation and migration of mammary tumor cells. Capturing the intertumoral and intratumoral tumor heterogeneity necessitates new detection methods enabling higher multiplexing than IHC or immunofluorescence (IF). Nanoparticles (NP) such as carbon-nanotubes (CNT) or gold nanoparticles (AuNPs), which can be functionalized with antibodies and detected without fluorescent labels, are promising to become powerful tools in bioimaging. We have explored the capacity of PEGylated CNT linked to anti-KRT19 and anti-Ecad antibodies to detect the corresponding proteins in breast cancer T47D (ER+/Ecad+/KRT19+) and MDA-MB-231 (ER-/Ecad-/KRT19-) cell lines. NP-Ecad and NP-KRT19 with internalized -sexithiophene and β-carotene dyes, respectively, present specific Raman signature upon excitation with 532 nm laser. Dynamic light scattering detected a shift in the size of functionalized NP and immunogold labeling confirmed the antibodies are in the right orientation. Although NPs remained in cluster, both bound the surface of T47D cells while only background was observed in MDA-MB-231 cells, as expected. In an alternative approach, PEGylated gold-NP were conjugated to anti-HER2 and anti-CD44 antibodies and detected by scattered light in dark-field microscope. NP-HER2 were incubated with HER2+ SKBR3 and MDA-MB-453 cells in increasing concentration and time. Results show an average of 48 NP per cell in SKBR3 and 8 NP-HER2/cell in MDAMB453, consistent with IF detection. NP-CD44 are highly sensitive, as we observed up to 1000 NP-CD44/cell in CD44+ cells versus 10 NP-CD44/cell in CD44- cells, with an average of 250 NP per cell in SKBR3, stratified as CD44+. These promising approaches both bear the potential of multiplexed biomarker detection in a rapid and quantitate manner. / Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les canadiennes. Le choix du traitement est basé sur l’expression de marqueurs tels que le récepteur des oestrogènes (ER), le récepteur membranaire HER2 et le marqueur de prolifération KI-67, détectés par immunohistochimie (IHC). Bien que certaines tumeurs mammaires puissent être fortement infiltrés par des cellules immunitaires, l'expression d’inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICI) à la fois par les cellules immunitaires et cancéreuses favorise la croissance de la tumeur. En particulier, l'expression tumorale de B7H4 a été associée à un taux élevé de métastases et à une corrélation inverse avec les cellules T CD8+ . Afin de mieux caractériser les patrons d’expression de B7H4, les niveaux de cette protéine ainsi que de marqueurs d’infiltrat immun, du point de contrôle immunitaire et de l’EMT ont été caractérisés par IHC à l’aide de six micropuces tissulaires construites à partir de 123 échantillons en FFPE provenant du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CHUM). L’expression de B7H4 (% de cellules positives) a été quantifiée par le logiciel QuPath (version 0.2.0 m9), tandis que l’EMT a été évaluée semi-quantitativement par Khadri et al. (2020). Nos résultats montrent que B7H4 est fortement exprimé exclusivement par les cellules tumorales dans tous les sous-types (moyenne de 22,5% à 43,3%), avec des niveaux plus faibles dans les tumeurs de type luminal B (LB) et HER2-positive (HER2+ ). L'analyse multivariable de la cohorte Metabric de profils transcriptomiques de tumeur mammaires (1980 tumeurs) a de plus montré que les niveaux d’ARN de B7H4 sont inversement associés à ceux de Ecad (p=0.0001), la même tendance a été observée dans notre cohorte, et sont plus forts dans les tumeurs lobulaires (Ecad- ). En outre, l’analyse d’une cohorte TCGA (754 tumeurs) a révélé une corrélation positive des transcrits de B7H4 avec YAP, TAZ, VGLL1 et TRIM29 (coefficient de corrélation Pearson >0.4), des inducteurs des facteurs de transcription TEAD réprimés par la voie de signalisation Hippo. En particulier, YAP a un patron d’expression similaire à celui de B7H4, plus élevé dans les sous-types basal et luminal. Ces résultats suggèrent que le rôle de B7H4 dans la progression de ces tumeurs pourrait être lié à la voie Hippo, qui contrôle la croissance, la prolifération et la migration des cellules tumorales mammaires. L’hétérogénéité inter- et parfois intra-tumorale du cancer du sein nécessite de nouvelles méthodes afin d’identifier simultanément une plus grande variété de marqueurs lors du diagnostic que par IHC ou immunofluorescence (IF). Les nanoparticules (NP) telles que les nanotubes de carbone (CNT) ou les nanoparticules d'or (AuNPs) peuvent être détectées sans besoin d’étiquette fluorescence et deviennent des outils puissants pour la bio-imagerie. Nous avons exploré la capacité de CNT PEGylés fonctionnalisés avec des anticorps anti-Keratin19 (KRT19) et anti-Ecad à détecter les protéines correspondantes dans les lignées cellulaires de cancer du sein T47D (ER+ /Ecad+ /KRT19+ ) et MDA-MB-231 (ER- /Ecad- /KRT19- ). Les NP-Ecad et NPKRT19, avec les colorants α-sexithiophène et β-carotène internalisés, respectivement, présentent une signature Raman spécifique lors de l'excitation avec un laser de 532 nm. La technique de diffusion dynamique de la lumière a montré un changement de taille des NP fonctionnalisées et le marquage immunogold a confirmé que les anticorps sont dans la bonne orientation. Bien que les NP soient restées agrégées, les deux NP se sont fixées à la surface des cellules T47D, alors que seul du bruit de fond a été observé dans la lignée MDA-MB-231, tel qu’attendu. Dans une approche alternative, des NP d'or PEGylées ont été conjuguées à des anticorps anti-HER2 et antiCD44 et détectées par la lumière diffusée dans un microscope à champ sombre. Les NP-HER2 ont été incubées avec des cellules HER2+ SKBR3 et MDA-MB-453 (HER2+ ) à des différentes concentrations et temps. La quantification montre une moyenne de 48 NP par cellule dans les SKBR3 et 8 NP-HER2 par cellule dans les MDA-MB-453, en accord avec les niveaux observés par IF. Les NP-CD44 permettent une détection très sensible, puisque nous avons observé plus de 1000 NP-CD44 par cellule dans les cellules CD44+ versus 10 NP-CD44 parcellule dans les CD44- , avec une moyenne de 250 NP par cellule dans la lignée SKBR3 stratifiée comme CD44+ . Ces approches prometteuses ont toutes deux la capacité d’être utilisées en multiplex pour la détection rapide et quantitative de marqueurs mammaires.

L’avènement des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICIs) ciblant l’axe PD-1/PD-L1 a révolutionné le traitement des patients avec un carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC). Ce mémoire consolide les conclusions de trois études distinctes visant à analyser et à améliorer l'efficacité des ICIs en monothérapie chez le CPNPC. La première section explore les bénéfices associés au durvalumab suivant une chimioradiothérapie chez les patients présentant un CPNPC localement avancé, confirmant le bénéfice de survie associé aux ICI et élargissant les perspectives émises depuis l'étude PACIFIC, y compris au niveau de la valeur prédictive du PD-L1. Dans l’optique de caractériser de nouveaux biomarqueurs d’efficacité, la deuxième section souligne le rôle crucial du microbiome intestinal dans la modulation de la réponse aux ICIs, spécifiquement au niveau de la dysbiose intestinale liée aux antibiotiques. La méta-analyse proposée confirme l’impact délétère des antibiotiques sur la survie des patients traités avec un ICI, tout particulièrement lorsque l’antibiothérapie précède l’inhibition du PD-1/PD-L1. Dans le domaine des stratégies immunomodulatrices émergentes, la troisième section explore l’impact de la cryoablation chez les patients présentant un CPNPC avec PD-L1≥50% et traités avec le pembrolizumab. Sans relever un signal d’efficacité supérieure, cette étude de phase I/II confirme la faisabilité et l’innocuité de la cryoablation, une technique permettant la libération d’antigènes tumoraux en circulation sans dénaturation thermique. Ultimement, ce mémoire propose un survol des bénéfices de survie, biomarqueurs prédictifs et stratégies immunomodulatrices liés à l’utilisation des ICIs chez les patients avec un CPNPC avec l’espoir d’optimiser les paradigmes thérapeutiques existants. / The advent of immune checkpoint inhibitors (ICIs) targeting the PD-1/PD-L1 axis has revolutionized the therapeutic landscape for patients diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC). This thesis consolidates the findings of three distinct studies aiming to analyze and enhance the efficacy of ICI monotherapy in NSCLC. The first section delves into the real-world use of durvalumab following chemoradiotherapy in stage III NSCLC, confirming the survival benefit associated with ICI administration in this context and broadening the insights derived from the PACIFIC study, particularly regarding the predictive value of PD-L1. With the aim of characterizing new biomarkers of efficacy, the second section sheds light on the crucial role of the gut microbiome in modulating responses to ICIs, particularly intestinal dysbiosis related to antibiotics. The meta-analysis confirms the detrimental impact of antibiotics on the overall survival of patients with advanced cancer treated with ICI monotherapy, especially when antibiotic therapy precedes PD-1/PD-L1 inhibition. In the realm of emerging immunomodulatory strategies, the third section explores the impact of cryoablation in patients with NSCLC and PD-L1≥50% treated with pembrolizumab. Although the procedure did not translate into a signal of superior efficacy, the proposed phase I/II study confirms the feasibility and safety of cryoablation, a technique allowing the release of circulating tumor antigens without heat-related denaturation. Ultimately, this thesis presents a contemporary overview of survival benefits, predictive biomarkers, and immunomodulatory strategies associated with the use of ICIs in monotherapy in patients with NSCLC, with the hope of optimizing existing therapeutic paradigms.