Neste trabalho, foi realizada a caracterização de ligninas de palha de cana-de-açúcar. O isolamento das ligninas se deu por acidólise branda e por polpação soda, precedida ou não por pré-tratamento com ácido diluído ou por explosão a vapor. A palha de cana e as ligninas foram caracterizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Espectrometrias no Infravermelho (FT-IR) e no Ultravioleta (UV), por Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (1H RMN), Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), Análise Termogravimétrica (TGA) e Calorimétrica (DSC), Análise Elementar e de Poder Calorífico Superior (PCS). A lignina técnica isolada por acidólise branda apresentou fórmula C9Har2,31Hal4,14O1,27(OH)ph0,58(OH)al1,19(OCH3)1,11 e relação H:G:S de 1 : 3,22 : 3,68, com 20% de condensação e massa molar média de 1908 Da. A cinética de termodegradação dessa lignina em atmosfera inerte se deu com energia de ativação de 13,90 kJ.mol-1, constante pré-exponencial 0,4799 min-1 e 42% em massa de carvão residual. Foram determinados, ainda, o coeficiente de extinção a 280 nm de 26,03 L.g-1 e o Poder Calorífico Superior de 23,72 kJ.g-1. A partir das informações obtidas em todas as análises, foi proposta uma estrutura para esta lignina. A deslignificação via polpação soda mostrou-se eficiente na remoção de lignina da matriz e foi verificado que, durante o processo, ocorre o rompimento de ligações entre a lignina e carboidratos, entretanto, algumas dessas ligações não são rompidas e o resíduo do processo, denominado lignina, contêm cerca de 17% carboidratos. A lignina soda apresentou poder calorífico superior de 25,14 kJ.g-1, 36% em massa de carvão residual e cinética de termodegradação com energia de ativação de 12,73 kJ.mol-1 e k0=0,4195 min-1. Foi verificado que as polpas soda que sofreram pré-tratamentos apresentaram um menor teor de lignina e maior solubilização de hemiceluloses. Estes tratamentos se mostraram eficientes na hidrólise dos complexos lignina-carboidrato e a ligninas obtidas apresentaram os menores teores de carboidrato residual e características estruturais diferentes das demais, mostrando-se mais condensadas em função das reações que ocorrem em meio ácido. Os coeficientes de extinção a 280 nm foram iguais a 24,2 L.g-1 e 23,3 L.g-1, respectivamente para as ligninas de explosão a vapor e pré-tratamento ácido e suas fórmulas estruturais determinadas por 1H RMN foram, respectivamente, C9Har1,59Hal4,12O0,84(OH)ph0,61(OH)al0,88(OCH3)1,51 e C9Har2,12Hal4,23O1,64(OH)ph0,83(OH)al0,58(OCH3)1,10. / In this work, the characterisation of lignins of sugarcane straw was made. The lignins were isolated by moderate acidolysis and soda process, preceded or not by either diluted acid or steam explosion pretreatments. The sugarcane straw and the lignins were characterised by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Infrared (FT-IR) and Ultraviolet (UV) Spectrometry, Proton Nuclear Magnetic Resonance (H1-RMN), Gel Permeation Chromatography (GPC), Thermogravimetrica analysis (TGA) and Differential Scattering Calormietry (DSC), Elemental Analysis and Heat Power (HP). The technical lignin isolated by moderate acidolysis has the formula C9Har2.31Hal4.14O1.27(OH)ph0.58(OH)al1.19(OCH3)1.11, H:G:S ratio of 1 : 3.22 : 3.68, is 20% condensed and its avarage molecular weight is 1908 Da. The thermal degradation kinetics analysis of this lignin in inert atmosphere was carried out, the results obtained were: activation energy of 13.80 kJ.mol-1, pre-exponential constant of 0.4799 min-1 and 42% residual char. The extinction coefficient obtained at 280 nm was 26.03 L.g-1 and the heat power 23.72 kJ.g-1. A structure was proposed for this lignin based on all the information obtained from these analyses. The delignification via soda process was efficient at removing lignin; during the process, the breaking of bonds between the lignin and carbohydrates was noticed, nevertheless, some of these bonds were not broken and the process residue, hereinafter called lignin, contains about 17% carbohydrates. The soda lignin has heat power of 25.14 kJ.g-1, 36% residual char and the thermal degradation kinetics ocurred with activation energy of 12.73 kJ.mol-1 and k0=0.4195 min-1. It was found that pretreated soda pulps have a lower lignin content and higher solubilisation of complexes, the lignins obtained had the lowest residual carbohydrates contents and different structural features from the untreated ones, being more condensed due to the reactions that occur in acid medium. The extinction coefficients at 280 nm obtained are 24.2 L.g-1 and 23.3 L.g-1, the structural formulas determined by 1H RMN are C9Har1.59Hal4.12O0.84(OH)ph0.61(OH)al0.88(OCH3)1.51 and C9Har2.12Hal4.23O1.64(OH)ph0.83(OH)al0.58(OCH3)1.10 for the steam explosion and acid pretreatment lignins, respectively.

A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose é responsável pela morte de ~2 a 3 milhões de pessoas/ano no mundo e nos próximos 15 anos cerca de 1 bilhão de pessoas deverão ser infectadas, e destas, aproximadamente 35 milhões deverão morrer. Apesar de existirem vários medicamentos sendo utilizados no tratamento da doença, constatasse o crescimento no número de casos devido, principalmente, às variedades resistentes do M. tuberculosis. Considerando-se o aparecimento de cepas resistentes em TB, recomenda-se que novos medicamentos e/ou alvos biológicos alternativos devam ser intensivamente pesquisados. A ribonucleotídeo redutase (RNR), por exemplo, é uma proteína de interesse, pois catalisa uma etapa importante e única na síntese de novo dos dNTPs, reduzindo o ribonucleosídeo 5\' -difosfato ao seu correspondente desoxirribonucleosídeo 5\' -difosfato. A RNR é importante na síntese do DNA, e portanto, na divisão das células. Esta enzima importante, que possuí 16% de homologia com a RNR de mamíferos, é um alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, com provável aplicação no tratamento do câncer, da malária e do tripanossoma. Sabe-se que diferentes classes de compostos, através de diferentes mecanismos de ação, inibem a RNR, incluindo as α-(N)-heterocíclicas carboxaldeído tiossemicarbazonas, um dos inibidores mais potentes da RNR. Sabe-se que alguns derivados da tiossemicarbazona, inibidoras da RNR de células tumorais, apresentam atividade frente o M. tuberculosis atuando provavelmente através do mesmo mecanismo, envolvendo a inibição da correspondente RNR. Neste contexto, nesta tese de doutorado, foram aplicadas diferentes abordagens de QSAR/QSAR-3D no estudo de 40 derivados da 2-piridino-carboxaldeído tiossemicarbazona, inibidores da RNR de células H.Ep.-2, retirados de literatura selecionada (French & Blanz-Jr. 1974). Estes compostos foram divididos em cinco séries, a saber: séries A, B, C, D, e E contendo, respectivamente, 40, 39, 30, 23 e 22 compostos, na tentativa de tornar estas séries estruturalmente mais homogêneas. Para cada série, foram criados três grupos de treinamento e os respectivos grupos de teste (I, II e III), visando-se avaliar o poder de predição dos modelos gerados através das análises de QSAR/QSAR-3D. Para as análises de QSAR clássico, foram utilizados como variáveis independentes, os descritores mais relevantes gerados através do programa DRAGON e, pré-selecionados por PLS. Considerando-se a ausência de informações sobre a estrutura cristalográfica da enzima RNR do M. tuberculosis, os estudos de QSAR-3D foram iniciados empregando-se metodologias propostas em CoMFA e, em CoMSIA, implementadas no programa SYBYL. Além destas, foi realizada a modelagem por homologia da RNR do M. tuberculosis, utilizando-se o programa WHATIF. Para as abordagens CoMFA e CoMSIA as geometrias otimizadas através do método semi-empírico AM1 foram alinhadas átomo-a-átomo e, através da similaridade dos respectivos campos estéricos e eletrostáticos, utilizando-se o programa SEAL. Nos dois procedimentos a geometria do composto não substituído, um dos mais ativos na série, foi utilizada como molde considerando-se a ausência de informações sobre a conformação bioativa. A modelagem da RNR por homologia foi realizada utilizando-se como molde as estruturas cristalográficas, respectivamente, do C. ammoniagenes (código PDB 1KGN) e da S. typhimurium (código PDB 1R2F), sambas apresentando valores de identidade superior a 65%. Mais recentemente foram publicados os dados cristalográficos para a cadeia beta (subunidade menor) da RNR do M. tuberculosis (código PDB 1UZR). Os modelos CoMFA e CoMSIA gerados apresentaram valores aceitáveis para os coeficientes de correlação de predição, com altos valores para os coeficientes de correlação ajustados e baixos valores para os erros padrões. Os melhores modelos CoMFA e CoMSIA foram obtidos considerando o grupo com substituintes apenas na posição 5 do anel piridínico. Razoáveis coeficientes de correlação de predição para os modelos CoMSIA com altos coeficientes de correlação de ajuste e baixos valores para os erros padrões forma obtidos. Os mapas de contorno gerados em CoMFA e CoMSIA sugerem que grupos aceptores de ligações de hidrogênio próximos ao nitrogênio do anel piridínico deverá aumentar o valor da atividade inibitória. Esta observação está em boa concordância com os dados da literatura, na qual a formação de um complexo entre a TSC e o íon Ferro foi sugerido para a inibição da RNR. Estes estudos deverão permitir um melhor entendimento sobre as características estruturais desta classe de TSC inibidoras da RNR, como agentes antitumorais, em termos dos campos estéricos, eletrostáticos, hidrofóbico, doador e aceptor de ligações de hidrogênio, bem como a contribuição para o desenvolvimento racional de novos inibidores para esta importante enzima. Adicionalmente, dois compostos preparados em nosso laboratório, demonstraram atividade frente o M. tuberculosis, em testes realizados in vivo. / Tuberculosis is an illness caused by Mycobacterium tuberculosis. Data from World Health Organization (WHO) estimates, that about 2-3 millions of human population died by Mycobacterium tuberculosis infection and that during the next 15 years about 1 billion will be infected and 35 million will certainly die. Although, in the clinic it was found several antiTBdrugs, these numbers will increase due several reasons including M. tuberculosis resistant strains. It has been stressed the importance of novel medicines and/or alternative biological targets research projects. It is known that Ribonucleotide reductase (RNR), is an enzyme that catalyses the rate limiting step in the de novo synthesis of dNTPs, reducing the ribonucleoside 5\'-diphosphates to the corresponding deoxyribonuc1eoside 5\' -diphosphates. RNR has a critical role in the DNA synthesis and, hence, cell division. This key enzyme, that shows 16% homology when compared with mammals RNR, is a potential target for drug design of cell growth inhibitors, with potential application in cancer therapy, antimalaria and trypanosome chemotherapy. It is known that different types of compounds or species by means of different mechanism pathways can show RNR inhibition, including α-(N)-heterocyclic carboxaldehydes thiosemicarbazones that are one of the most potent classes of RNR inhibitors. More than that, some of them, that shows activity against M. tuberculosis seems to follow the same mechanism pathways proposed to the thiosemicarbazones tumor cells activity that means, that they probably are RNR inhibitors. In this study, a series of 40 α-(N)-2-formyl-pyridine thiosemicarbazone derivatives tested against RNR of H.ep.-2-cells (human epidermoid carcinoma), taken from selected literature (French & Blanz-Jr. 1974), has quantitatively analyzed by means of several QSAR/3D-QSAR approaches. These compounds were divided into 5 individual subsets, namely A, B, C, D, and E, having 40, 39, 30, 23 e 22 compounds, respectively. This procedure has been done in order to achieve more structurally homogeneous subsets. For each set, three individual training and test sets (I,II and III) have been created in order to evaluate the predictivity power of the generated QSAR/3D-QSAR models. QSAR analysis have been done using descriptors generated by DRAGON program that have been further pre-selected by PLS procedures. Considering that crystallographic data of RNR M. tuberculosis are not available in the literature, 3D-QSAR studies have been done these applying, initially, CoMFA and CoMSIA approaches, implemented in SYBYL. Homology model studies have been performed with WHATIF program CoMFA e CoMSIA approaches used optimized geometry obtained by semi-empirical AM1 methods that have been aligned by two different methods. Rigid alignment, in which the compounds were fitted atom-by-atom onto a template, based on the root mean square fit. The N(l) and C(2) atoms of the pyridine moiety and the heavy atoms of thiosemicarbazone backbone of TSC were used as template structure. (2) Field based, in which the steric and electrostatic fields, generated by the SEAL program were considered in the alignment. In both procedures the unsubstituted 2-formylpyridine thiosemicarbazone in its syn conformation, has been taken as template. Homology RNR models were done using as template crystallographic data of ammoniagenes (1KGN) and S. typhimurium (1R2F) as template, respectively, with identity larger than 65%. More recent1y new crystallographic data have been published for the beta chain (smaller subunity) of RNR do M. tuberculosis (1UZR). CoMFA and CoMSIA generated models showed acceptable predictive correlation coefficients with high fitted correlation coefficients and low standard errors. Betler CoMFA and CoMSIA models have been derived considering a homogeneous subset of TSC substituted only at 5-position in pyridine ring. Reasonable predictive correlation coefficients for CoMSIA models with high fitted correlation coefficients and very low standard errors were obtained. The derived CoMFA and CoMSIA countour maps suggested that a hydrogen bond acceptor near the nitrogen pyridine ring could enhance inhibitory activity value. This observation is in good agreement with literature, in which a complex formation between TSC and iron ion has been suggested, to RNR inhibition. These studies are expected to enhance the understanding of the structural features of this class of TSC-RNR inhibitors as antitumor agents in terms of steric, electrostatic, hydrophobic and hydrogen donor and acceptor fields as well as to contribute to rational design of inhibitors of this key enzyme. Additionally, two compounds that have been prepared by us showed activity against M. tuberculosis using in vivo test system.

Bases de Mannich têm sido sintetizadas como pró-fármacos de cetonas α,β-insaturadas, 22, 20 sendo estas importantes no tratamento do câncer. 20 Assim, toma-se de interesse o desenvolvimento de estudos de QSAR envolvendo bases de Mannich com propriedades citotóxicas e/ou anticâncer, contribuindo-se, para o entendimento da(s) interação(ões) destes compostos (agentes alquilantes) no sistema biológico. 40, 5, 36, 53 Neste trabalho, destinado a dissertação de mestrado, foram preparadas e purificadas por métodos triviais descritos na literatura 8 47 duas séries de derivados de bases de Mannich, a saber: nove cloretos de 3-(dimetilamino)-propiofenonas-4-X-substituidas (série I, compostos I.1 a I.9), e seis dos correspondentes iodetos de 3-(trimetilamino )propiofenonas-4-X-substituídas (série II, compostos II.1 a II.6). Destes, quatro não estão descritos na literatura. A seleção dos substituintes foi feita visando obter intercorrelações não significativas entre os correspondentes valores dos parâmetros físico-químicos analisados (π, σp e MR4). 45 Outro critério considerado, se refere as faixas de variação para cada parâmetro físico-químico analisado. 62, 31, 15 Para a série II, estes critérios foram parcialmente contemplados. Em seguida, para cada composto preparado, foram determinados experimentalmente e/ou retirados da literatura 45 e/ou calculados parâmetros parâmetros fisico-químicos/estruturais descritores de propriedades, respectivamente: hidrofóbicas/lipofílicas (π, logPcalc e logP app (sendo os valores este último determinados somente para os compostos da serie I)); eletrônicas/polares (σp, σp+, σp-, σI, σR, T, R, γ13C=0 e νC=0) e, ainda aquela relativa à polarizabilidade (MR4). Como parâmetro biológico para os compostos das series I e II foram determinados os valores da potência citotóxica, expressos por log(1/IC50). A seguir, com o objetivo de se desenvolver estudos de QSAR, aplicando a abordagem tradicional 40 para os compostos respectivamente das séries I e II, e a abordagem mista, 62, 63, 53 que considera as duas séries conjuntamente, foram propostos respectivamente modelos expressos pelas equações IV.4 e IV.6: log(1/IC50)= -0,27(±0,23)δ13C=0 -0,48(±0,35)logPcalc + 56,32(±44,30) eq.IV.4 (n=9;r=0,87;s=0,17;F=9,23;Q2=0,36;SPRESS=0,28) log(1/IC50)=-0,56(±0,27)π+0,35(±0,29)MR4+0,23(±0,22)I[N(Me)3]+-I+1,53(±0,22) eq.IV.6 (n=15;r=0,82;s=0,18;F=7,64;Q2=0,43;SPRESS=0,24 Primeiramente, através da análise do modelo expresso pela equação IV.4 foi possível avaliar as naturezas e contribuições relativas dos parâmetros estruturais responsáveis pela citotoxicidade dos compostos da série I. Em seguida, através da análise do modelo expresso pela equação IV.6 foi possível avaliar a contribuição dos parâmetros físico-químicos, bem como a contribuição da variação estrutural existente entre as séries I e II, responsáveis pela citotoxicidade dos compostos. A interpretação e significado de I[N(Me)3]+I-, que assume valor 0 para os compostos da série I e valor 1 para os compostos da série II, foi discutida em termos estruturais. Nenhum modelo com significado estatístico foi obtido para os compostos da série II. E, tanto para a série I, bem como para as séries I e II, a aplicação dos modelos tanto parabólico como bilinear não resultou em correlações estatisticamente significativas. Pela análise dos modelos foi possível, pelo menos em parte, o entendimento da(s) interação(ões) dos derivados de bases de Mannich no sistema biológico. 40, 5, 36, 53. / Mannich bases have been used as prodrugs of α,β-unsaturated ketones that are important in the cancer therapy 80, 22. In this way, a QSAR study 20, 81 was performed with two sets of Mannich bases derivatives, namely: 3-(dimethylamine)-propiophenon-4-X-substituted hydrochlorides (set I, composed of nine derivatives) and 3-(trimethylamine)propiophenon-4-X-substituted iodines (set II, composed of six derivatives). The sets I and II were prepared by trivial methods described in the literature 58,8. For each compound the physicochemical/structural descriptors, hydrophobic/lipophilic (π, logPcalc and logP app (it was determined only for set I), electronic/polar (σp, σp+, σp-, σI, σR, T, R, γ13C=0 e νC=0) and the polarizability related (MR4), were determined experimentally and/or calculated and/or obtained from the literature 7. The biological parameter was the cytotoxic potency, expressed by values of log(1/IC50). In order to investigate 1he interaction of this class of compounds wi1h the biological system a QSAR study was performed 20, 81. The most significant QSAR models obtained for set I and sets I and II altogether, were expressed respectively by equations 1 and 2. log(1/IC50)= -0,27(±0,23)δ13C=0 -0,48(±0,35)logPcalc + 56,32(±44,30) eq.1 (n=9;r=0,87;s=0,17;F=9,23;Q2=0,36;SPRESS=0,28) log(1/IC50)=-0,56(±0,27)π+0,35(±0,29)MR4+0,23(±0,22)I[N(Me)3]+-I+1,53(±0,22) eq.2 (n=15;r=0,82;s=0,18;F=7,64;Q2=0,43;SPRESS=0,24 To equation 2 was included an variable indicator I[N(Me)3]+I- that assumed the value 0 for set I compounds and the value of 1 for set II compounds. The interpretation and meaning of I[N(Me)3]+I-, were discussed in structural terms. No significant models were obtained for the compounds of the set II. For set I and sets I and II altogether, the application of the parabolic and the bilinear models were verified and showed to be not statistically significant.

A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose é responsável pela morte de ~2 a 3 milhões de pessoas/ano no mundo e nos próximos 15 anos cerca de 1 bilhão de pessoas deverão ser infectadas, e destas, aproximadamente 35 milhões deverão morrer. Apesar de existirem vários medicamentos sendo utilizados no tratamento da doença, constatasse o crescimento no número de casos devido, principalmente, às variedades resistentes do M. tuberculosis. Considerando-se o aparecimento de cepas resistentes em TB, recomenda-se que novos medicamentos e/ou alvos biológicos alternativos devam ser intensivamente pesquisados. A ribonucleotídeo redutase (RNR), por exemplo, é uma proteína de interesse, pois catalisa uma etapa importante e única na síntese de novo dos dNTPs, reduzindo o ribonucleosídeo 5\' -difosfato ao seu correspondente desoxirribonucleosídeo 5\' -difosfato. A RNR é importante na síntese do DNA, e portanto, na divisão das células. Esta enzima importante, que possuí 16% de homologia com a RNR de mamíferos, é um alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, com provável aplicação no tratamento do câncer, da malária e do tripanossoma. Sabe-se que diferentes classes de compostos, através de diferentes mecanismos de ação, inibem a RNR, incluindo as α-(N)-heterocíclicas carboxaldeído tiossemicarbazonas, um dos inibidores mais potentes da RNR. Sabe-se que alguns derivados da tiossemicarbazona, inibidoras da RNR de células tumorais, apresentam atividade frente o M. tuberculosis atuando provavelmente através do mesmo mecanismo, envolvendo a inibição da correspondente RNR. Neste contexto, nesta tese de doutorado, foram aplicadas diferentes abordagens de QSAR/QSAR-3D no estudo de 40 derivados da 2-piridino-carboxaldeído tiossemicarbazona, inibidores da RNR de células H.Ep.-2, retirados de literatura selecionada (French & Blanz-Jr. 1974). Estes compostos foram divididos em cinco séries, a saber: séries A, B, C, D, e E contendo, respectivamente, 40, 39, 30, 23 e 22 compostos, na tentativa de tornar estas séries estruturalmente mais homogêneas. Para cada série, foram criados três grupos de treinamento e os respectivos grupos de teste (I, II e III), visando-se avaliar o poder de predição dos modelos gerados através das análises de QSAR/QSAR-3D. Para as análises de QSAR clássico, foram utilizados como variáveis independentes, os descritores mais relevantes gerados através do programa DRAGON e, pré-selecionados por PLS. Considerando-se a ausência de informações sobre a estrutura cristalográfica da enzima RNR do M. tuberculosis, os estudos de QSAR-3D foram iniciados empregando-se metodologias propostas em CoMFA e, em CoMSIA, implementadas no programa SYBYL. Além destas, foi realizada a modelagem por homologia da RNR do M. tuberculosis, utilizando-se o programa WHATIF. Para as abordagens CoMFA e CoMSIA as geometrias otimizadas através do método semi-empírico AM1 foram alinhadas átomo-a-átomo e, através da similaridade dos respectivos campos estéricos e eletrostáticos, utilizando-se o programa SEAL. Nos dois procedimentos a geometria do composto não substituído, um dos mais ativos na série, foi utilizada como molde considerando-se a ausência de informações sobre a conformação bioativa. A modelagem da RNR por homologia foi realizada utilizando-se como molde as estruturas cristalográficas, respectivamente, do C. ammoniagenes (código PDB 1KGN) e da S. typhimurium (código PDB 1R2F), sambas apresentando valores de identidade superior a 65%. Mais recentemente foram publicados os dados cristalográficos para a cadeia beta (subunidade menor) da RNR do M. tuberculosis (código PDB 1UZR). Os modelos CoMFA e CoMSIA gerados apresentaram valores aceitáveis para os coeficientes de correlação de predição, com altos valores para os coeficientes de correlação ajustados e baixos valores para os erros padrões. Os melhores modelos CoMFA e CoMSIA foram obtidos considerando o grupo com substituintes apenas na posição 5 do anel piridínico. Razoáveis coeficientes de correlação de predição para os modelos CoMSIA com altos coeficientes de correlação de ajuste e baixos valores para os erros padrões forma obtidos. Os mapas de contorno gerados em CoMFA e CoMSIA sugerem que grupos aceptores de ligações de hidrogênio próximos ao nitrogênio do anel piridínico deverá aumentar o valor da atividade inibitória. Esta observação está em boa concordância com os dados da literatura, na qual a formação de um complexo entre a TSC e o íon Ferro foi sugerido para a inibição da RNR. Estes estudos deverão permitir um melhor entendimento sobre as características estruturais desta classe de TSC inibidoras da RNR, como agentes antitumorais, em termos dos campos estéricos, eletrostáticos, hidrofóbico, doador e aceptor de ligações de hidrogênio, bem como a contribuição para o desenvolvimento racional de novos inibidores para esta importante enzima. Adicionalmente, dois compostos preparados em nosso laboratório, demonstraram atividade frente o M. tuberculosis, em testes realizados in vivo. / Tuberculosis is an illness caused by Mycobacterium tuberculosis. Data from World Health Organization (WHO) estimates, that about 2-3 millions of human population died by Mycobacterium tuberculosis infection and that during the next 15 years about 1 billion will be infected and 35 million will certainly die. Although, in the clinic it was found several antiTBdrugs, these numbers will increase due several reasons including M. tuberculosis resistant strains. It has been stressed the importance of novel medicines and/or alternative biological targets research projects. It is known that Ribonucleotide reductase (RNR), is an enzyme that catalyses the rate limiting step in the de novo synthesis of dNTPs, reducing the ribonucleoside 5\'-diphosphates to the corresponding deoxyribonuc1eoside 5\' -diphosphates. RNR has a critical role in the DNA synthesis and, hence, cell division. This key enzyme, that shows 16% homology when compared with mammals RNR, is a potential target for drug design of cell growth inhibitors, with potential application in cancer therapy, antimalaria and trypanosome chemotherapy. It is known that different types of compounds or species by means of different mechanism pathways can show RNR inhibition, including α-(N)-heterocyclic carboxaldehydes thiosemicarbazones that are one of the most potent classes of RNR inhibitors. More than that, some of them, that shows activity against M. tuberculosis seems to follow the same mechanism pathways proposed to the thiosemicarbazones tumor cells activity that means, that they probably are RNR inhibitors. In this study, a series of 40 α-(N)-2-formyl-pyridine thiosemicarbazone derivatives tested against RNR of H.ep.-2-cells (human epidermoid carcinoma), taken from selected literature (French & Blanz-Jr. 1974), has quantitatively analyzed by means of several QSAR/3D-QSAR approaches. These compounds were divided into 5 individual subsets, namely A, B, C, D, and E, having 40, 39, 30, 23 e 22 compounds, respectively. This procedure has been done in order to achieve more structurally homogeneous subsets. For each set, three individual training and test sets (I,II and III) have been created in order to evaluate the predictivity power of the generated QSAR/3D-QSAR models. QSAR analysis have been done using descriptors generated by DRAGON program that have been further pre-selected by PLS procedures. Considering that crystallographic data of RNR M. tuberculosis are not available in the literature, 3D-QSAR studies have been done these applying, initially, CoMFA and CoMSIA approaches, implemented in SYBYL. Homology model studies have been performed with WHATIF program CoMFA e CoMSIA approaches used optimized geometry obtained by semi-empirical AM1 methods that have been aligned by two different methods. Rigid alignment, in which the compounds were fitted atom-by-atom onto a template, based on the root mean square fit. The N(l) and C(2) atoms of the pyridine moiety and the heavy atoms of thiosemicarbazone backbone of TSC were used as template structure. (2) Field based, in which the steric and electrostatic fields, generated by the SEAL program were considered in the alignment. In both procedures the unsubstituted 2-formylpyridine thiosemicarbazone in its syn conformation, has been taken as template. Homology RNR models were done using as template crystallographic data of ammoniagenes (1KGN) and S. typhimurium (1R2F) as template, respectively, with identity larger than 65%. More recent1y new crystallographic data have been published for the beta chain (smaller subunity) of RNR do M. tuberculosis (1UZR). CoMFA and CoMSIA generated models showed acceptable predictive correlation coefficients with high fitted correlation coefficients and low standard errors. Betler CoMFA and CoMSIA models have been derived considering a homogeneous subset of TSC substituted only at 5-position in pyridine ring. Reasonable predictive correlation coefficients for CoMSIA models with high fitted correlation coefficients and very low standard errors were obtained. The derived CoMFA and CoMSIA countour maps suggested that a hydrogen bond acceptor near the nitrogen pyridine ring could enhance inhibitory activity value. This observation is in good agreement with literature, in which a complex formation between TSC and iron ion has been suggested, to RNR inhibition. These studies are expected to enhance the understanding of the structural features of this class of TSC-RNR inhibitors as antitumor agents in terms of steric, electrostatic, hydrophobic and hydrogen donor and acceptor fields as well as to contribute to rational design of inhibitors of this key enzyme. Additionally, two compounds that have been prepared by us showed activity against M. tuberculosis using in vivo test system.

Com o objetivo de buscar e identificar novo(s) inibidor(es) da cruzaína uma cisteíno-protease do Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas foram propostos, validados e, a seguir, aplicados sobre a biblioteca de compostos ZINC (3.294.714 compostos), dois modelos de virtual screening (Modelos I e II). Os modelos de virtual screening propostos, contendo seqüências de filtros físicoquímicos, farmacofóricos, de docking e de seleção por inspeção visual, foram construídos a partir de informações de 13 complexos da cruzaína e de 20 complexos de outras cisteínoprotease, cujas estruturas estão disponíveis no PDB. Numa primeira etapa, o reconhecimento detalhado das características estruturais da cruzaína foi realizado por inspeção visual; pelos campos de interação molecular, gerados pelo programa GRID; pela identificação das propriedades de interação molecular na superfície da cavidade, geradas pelo programa CA VBASE e; por simulações de dinâmica molecular. O Modelo I de virtual screeníng - obtido a partir do reconhecimento das estruturas dos 13 complexos da cruzaína depositadas no PDB - foi aplicado sobre o ZINC, selecionando 10 compostos, dos quais 6 compostos foram adquiridos e submetidos ao teste de inibição enzimática da cruzaína, para a validação experimental do modelo. Observou-se que 3 destes compostos (ZINC02470662, ZINC02682879 e ZINC03192044, respectivamente) não mostraram inibição significativa da cruzaína, nas condições experimentais utilizadas, até a concentração de 7 mM, enquanto que os 3 restantes (ZINC02663001, ZINC01936854 e ZINC03326243, respectivamente) apresentaram inibição enzimática inespecífica, sugerindo que estes últimos agem pelo mecanismo promíscuo. O mecanismo promíscuo de inibição enzimática, foi verificado pela adição de 0,1% Triton X-100 no ensaio enzimático, observando-se a correspondente perda de inibição da cruzaína. Para estes compostos, a confirmação do mecanismo promíscuo foi feita observando-se a perda de inibição da enzima, após o aumento em dez vezes da concentração da cruzaína no ensaio enzimático. O Modelo II - obtido a partir do reconhecimento das estruturas dos 13 complexos da cruzaína e dos 20 complexos de outras cisteíno-proteases, identificadas na busca por cavidades similares à cruzaína - foi aplicado sobre o banco de dados ZINC,selecionando 55 compostos dos quais 19 foram adquiridos e submetidos ao teste de inibição enzimática da cruzaína, para validação experimental do modelo. Observou-se que o composto ZINC01794422 apresentou inibição específica da enzima com constante de inibição no valor de Ki = 21 µM, enquanto que os demais 18 compostos não mostraram inibição significativa, nas condições experimentais utilizadas, até a concentração de 592 µM. O mecanismo promíscuo de inibição enzimática não foi observado, uma vez que todos os testes foram realizados com 0,1% de Triton X-100. O Modelo II identificou, ainda, mais dois inibidores da cruzaína (ZINC04899534 e ZINC01547017) que, por serem estruturalmente semelhantes aos utilizados na construção do modelo e já terem sido descritos na literatura, não foram adquiridos ou testados nos ensaios enzimáticos. Considerando apenas o novo inibidor identificado, o Modelo II apresentou uma taxa de acerto de 5,3%. Este valor esta de acordo com as taxas de acerto encontradas na literatura que variam entre 1 a 50% . / In order to search and identify new cruzain inhibitor(s) - a cysteine-protease of Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease - two virtual screening schemes(Models I and II) were proposed, validated- and applied to the ZINC database (3.294.714 compounds). The proposed virtual screening models, bearing a sequence of different physicalchemical, pharmacophore and docking filters, as well as a visual inspection filter, were built from information taken from 13 cruzain complexes and from 20 complexes of other cysteine proteases, having their structures available in PDB. In a first step, a detailed recognition of the cruzain structural features and characteristics was performed through visual inspection of the enzyme environment; followed by the analysis of GRID generated molecular interaction fields; through the identification of molecular interaction properties exposed at the enzyme cavity surface, generated by the CAVBASE program; and by molecular dynamics simulations. The virtual screening Model I, - generated from the structural characteristics recognized from 13 PDB cruzain complexes - when applied to the ZINC database selected 10 compounds. For the experimental validation ofthe model, six ofthese compounds have been acquired and were tested as cruzain inhibitors. It was observed that three of the tested compounds (ZINC02470662, ZINC02682879 and ZINC03192044, respectively) did not show any significant cruzain inhibition, up to 7 mM. Meanwhile the other three tested compounds (ZINC02663001, ZINC01936854 and ZINC03326243, respectively) showed an unspecific cruzain inhibition, suggesting that an enzyme inhibition by promiscuous mechanism occurred. This mechanism was verified by the addition of 0.1% Triton X-100 on the enzymatic assay with a concomitant loss of cruzain inhibition activity. For these compounds, the confirmation of the promiscuous mechanism was also done, observing the loss of enzyme inhibition, after a ten times increase in the cruzain concentration on the enzymatic assay. The virtual screenmg Model II - generated from the structural characteristics recognized from 13 cruzain complexes and 20 complexes of other cysteine proteases, that have been identified on a search for cavities similar to cruzain - selected 55 compounds, when applied to the ZINC database. In order to experimentally validate the model, nineteen compounds have been acquired and were tested as cruzain inhibitors. It has been observed that one compound, ZINC01794422, showed a specific cruzain inhibition (Ki = 21 µM), while the other eighteen showed no significant inhibition, up to 592 µM concentration. The promiscuous mechanism of enzymatic inhibition was not observed, since 0.1% of Triton X-100 was added in ali assays. Additionally, Model II identified two other cruzain inhibitors (ZINC04899534 and ZINC01547017). However, these compounds have not been acquired or tested, since they are known cruzain inhibitors - already described in the literature and are structurally similar to the inhibitors used in the construction of the mode!. Referring to new inhibitors found, Model II showed a hit rate of 5,3%. This value is in agreement with those found in the literature, which ranges from 1 to 50%.

Bases de Mannich têm sido sintetizadas como pró-fármacos de cetonas α,β-insaturadas, 22, 20 sendo estas importantes no tratamento do câncer. 20 Assim, toma-se de interesse o desenvolvimento de estudos de QSAR envolvendo bases de Mannich com propriedades citotóxicas e/ou anticâncer, contribuindo-se, para o entendimento da(s) interação(ões) destes compostos (agentes alquilantes) no sistema biológico. 40, 5, 36, 53 Neste trabalho, destinado a dissertação de mestrado, foram preparadas e purificadas por métodos triviais descritos na literatura 8 47 duas séries de derivados de bases de Mannich, a saber: nove cloretos de 3-(dimetilamino)-propiofenonas-4-X-substituidas (série I, compostos I.1 a I.9), e seis dos correspondentes iodetos de 3-(trimetilamino )propiofenonas-4-X-substituídas (série II, compostos II.1 a II.6). Destes, quatro não estão descritos na literatura. A seleção dos substituintes foi feita visando obter intercorrelações não significativas entre os correspondentes valores dos parâmetros físico-químicos analisados (π, σp e MR4). 45 Outro critério considerado, se refere as faixas de variação para cada parâmetro físico-químico analisado. 62, 31, 15 Para a série II, estes critérios foram parcialmente contemplados. Em seguida, para cada composto preparado, foram determinados experimentalmente e/ou retirados da literatura 45 e/ou calculados parâmetros parâmetros fisico-químicos/estruturais descritores de propriedades, respectivamente: hidrofóbicas/lipofílicas (π, logPcalc e logP app (sendo os valores este último determinados somente para os compostos da serie I)); eletrônicas/polares (σp, σp+, σp-, σI, σR, T, R, γ13C=0 e νC=0) e, ainda aquela relativa à polarizabilidade (MR4). Como parâmetro biológico para os compostos das series I e II foram determinados os valores da potência citotóxica, expressos por log(1/IC50). A seguir, com o objetivo de se desenvolver estudos de QSAR, aplicando a abordagem tradicional 40 para os compostos respectivamente das séries I e II, e a abordagem mista, 62, 63, 53 que considera as duas séries conjuntamente, foram propostos respectivamente modelos expressos pelas equações IV.4 e IV.6: log(1/IC50)= -0,27(±0,23)δ13C=0 -0,48(±0,35)logPcalc + 56,32(±44,30) eq.IV.4 (n=9;r=0,87;s=0,17;F=9,23;Q2=0,36;SPRESS=0,28) log(1/IC50)=-0,56(±0,27)π+0,35(±0,29)MR4+0,23(±0,22)I[N(Me)3]+-I+1,53(±0,22) eq.IV.6 (n=15;r=0,82;s=0,18;F=7,64;Q2=0,43;SPRESS=0,24 Primeiramente, através da análise do modelo expresso pela equação IV.4 foi possível avaliar as naturezas e contribuições relativas dos parâmetros estruturais responsáveis pela citotoxicidade dos compostos da série I. Em seguida, através da análise do modelo expresso pela equação IV.6 foi possível avaliar a contribuição dos parâmetros físico-químicos, bem como a contribuição da variação estrutural existente entre as séries I e II, responsáveis pela citotoxicidade dos compostos. A interpretação e significado de I[N(Me)3]+I-, que assume valor 0 para os compostos da série I e valor 1 para os compostos da série II, foi discutida em termos estruturais. Nenhum modelo com significado estatístico foi obtido para os compostos da série II. E, tanto para a série I, bem como para as séries I e II, a aplicação dos modelos tanto parabólico como bilinear não resultou em correlações estatisticamente significativas. Pela análise dos modelos foi possível, pelo menos em parte, o entendimento da(s) interação(ões) dos derivados de bases de Mannich no sistema biológico. 40, 5, 36, 53. / Mannich bases have been used as prodrugs of α,β-unsaturated ketones that are important in the cancer therapy 80, 22. In this way, a QSAR study 20, 81 was performed with two sets of Mannich bases derivatives, namely: 3-(dimethylamine)-propiophenon-4-X-substituted hydrochlorides (set I, composed of nine derivatives) and 3-(trimethylamine)propiophenon-4-X-substituted iodines (set II, composed of six derivatives). The sets I and II were prepared by trivial methods described in the literature 58,8. For each compound the physicochemical/structural descriptors, hydrophobic/lipophilic (π, logPcalc and logP app (it was determined only for set I), electronic/polar (σp, σp+, σp-, σI, σR, T, R, γ13C=0 e νC=0) and the polarizability related (MR4), were determined experimentally and/or calculated and/or obtained from the literature 7. The biological parameter was the cytotoxic potency, expressed by values of log(1/IC50). In order to investigate 1he interaction of this class of compounds wi1h the biological system a QSAR study was performed 20, 81. The most significant QSAR models obtained for set I and sets I and II altogether, were expressed respectively by equations 1 and 2. log(1/IC50)= -0,27(±0,23)δ13C=0 -0,48(±0,35)logPcalc + 56,32(±44,30) eq.1 (n=9;r=0,87;s=0,17;F=9,23;Q2=0,36;SPRESS=0,28) log(1/IC50)=-0,56(±0,27)π+0,35(±0,29)MR4+0,23(±0,22)I[N(Me)3]+-I+1,53(±0,22) eq.2 (n=15;r=0,82;s=0,18;F=7,64;Q2=0,43;SPRESS=0,24 To equation 2 was included an variable indicator I[N(Me)3]+I- that assumed the value 0 for set I compounds and the value of 1 for set II compounds. The interpretation and meaning of I[N(Me)3]+I-, were discussed in structural terms. No significant models were obtained for the compounds of the set II. For set I and sets I and II altogether, the application of the parabolic and the bilinear models were verified and showed to be not statistically significant.

Com o objetivo de buscar e identificar novo(s) inibidor(es) da cruzaína uma cisteíno-protease do Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas foram propostos, validados e, a seguir, aplicados sobre a biblioteca de compostos ZINC (3.294.714 compostos), dois modelos de virtual screening (Modelos I e II). Os modelos de virtual screening propostos, contendo seqüências de filtros físicoquímicos, farmacofóricos, de docking e de seleção por inspeção visual, foram construídos a partir de informações de 13 complexos da cruzaína e de 20 complexos de outras cisteínoprotease, cujas estruturas estão disponíveis no PDB. Numa primeira etapa, o reconhecimento detalhado das características estruturais da cruzaína foi realizado por inspeção visual; pelos campos de interação molecular, gerados pelo programa GRID; pela identificação das propriedades de interação molecular na superfície da cavidade, geradas pelo programa CA VBASE e; por simulações de dinâmica molecular. O Modelo I de virtual screeníng - obtido a partir do reconhecimento das estruturas dos 13 complexos da cruzaína depositadas no PDB - foi aplicado sobre o ZINC, selecionando 10 compostos, dos quais 6 compostos foram adquiridos e submetidos ao teste de inibição enzimática da cruzaína, para a validação experimental do modelo. Observou-se que 3 destes compostos (ZINC02470662, ZINC02682879 e ZINC03192044, respectivamente) não mostraram inibição significativa da cruzaína, nas condições experimentais utilizadas, até a concentração de 7 mM, enquanto que os 3 restantes (ZINC02663001, ZINC01936854 e ZINC03326243, respectivamente) apresentaram inibição enzimática inespecífica, sugerindo que estes últimos agem pelo mecanismo promíscuo. O mecanismo promíscuo de inibição enzimática, foi verificado pela adição de 0,1% Triton X-100 no ensaio enzimático, observando-se a correspondente perda de inibição da cruzaína. Para estes compostos, a confirmação do mecanismo promíscuo foi feita observando-se a perda de inibição da enzima, após o aumento em dez vezes da concentração da cruzaína no ensaio enzimático. O Modelo II - obtido a partir do reconhecimento das estruturas dos 13 complexos da cruzaína e dos 20 complexos de outras cisteíno-proteases, identificadas na busca por cavidades similares à cruzaína - foi aplicado sobre o banco de dados ZINC,selecionando 55 compostos dos quais 19 foram adquiridos e submetidos ao teste de inibição enzimática da cruzaína, para validação experimental do modelo. Observou-se que o composto ZINC01794422 apresentou inibição específica da enzima com constante de inibição no valor de Ki = 21 µM, enquanto que os demais 18 compostos não mostraram inibição significativa, nas condições experimentais utilizadas, até a concentração de 592 µM. O mecanismo promíscuo de inibição enzimática não foi observado, uma vez que todos os testes foram realizados com 0,1% de Triton X-100. O Modelo II identificou, ainda, mais dois inibidores da cruzaína (ZINC04899534 e ZINC01547017) que, por serem estruturalmente semelhantes aos utilizados na construção do modelo e já terem sido descritos na literatura, não foram adquiridos ou testados nos ensaios enzimáticos. Considerando apenas o novo inibidor identificado, o Modelo II apresentou uma taxa de acerto de 5,3%. Este valor esta de acordo com as taxas de acerto encontradas na literatura que variam entre 1 a 50% . / In order to search and identify new cruzain inhibitor(s) - a cysteine-protease of Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease - two virtual screening schemes(Models I and II) were proposed, validated- and applied to the ZINC database (3.294.714 compounds). The proposed virtual screening models, bearing a sequence of different physicalchemical, pharmacophore and docking filters, as well as a visual inspection filter, were built from information taken from 13 cruzain complexes and from 20 complexes of other cysteine proteases, having their structures available in PDB. In a first step, a detailed recognition of the cruzain structural features and characteristics was performed through visual inspection of the enzyme environment; followed by the analysis of GRID generated molecular interaction fields; through the identification of molecular interaction properties exposed at the enzyme cavity surface, generated by the CAVBASE program; and by molecular dynamics simulations. The virtual screening Model I, - generated from the structural characteristics recognized from 13 PDB cruzain complexes - when applied to the ZINC database selected 10 compounds. For the experimental validation ofthe model, six ofthese compounds have been acquired and were tested as cruzain inhibitors. It was observed that three of the tested compounds (ZINC02470662, ZINC02682879 and ZINC03192044, respectively) did not show any significant cruzain inhibition, up to 7 mM. Meanwhile the other three tested compounds (ZINC02663001, ZINC01936854 and ZINC03326243, respectively) showed an unspecific cruzain inhibition, suggesting that an enzyme inhibition by promiscuous mechanism occurred. This mechanism was verified by the addition of 0.1% Triton X-100 on the enzymatic assay with a concomitant loss of cruzain inhibition activity. For these compounds, the confirmation of the promiscuous mechanism was also done, observing the loss of enzyme inhibition, after a ten times increase in the cruzain concentration on the enzymatic assay. The virtual screenmg Model II - generated from the structural characteristics recognized from 13 cruzain complexes and 20 complexes of other cysteine proteases, that have been identified on a search for cavities similar to cruzain - selected 55 compounds, when applied to the ZINC database. In order to experimentally validate the model, nineteen compounds have been acquired and were tested as cruzain inhibitors. It has been observed that one compound, ZINC01794422, showed a specific cruzain inhibition (Ki = 21 µM), while the other eighteen showed no significant inhibition, up to 592 µM concentration. The promiscuous mechanism of enzymatic inhibition was not observed, since 0.1% of Triton X-100 was added in ali assays. Additionally, Model II identified two other cruzain inhibitors (ZINC04899534 and ZINC01547017). However, these compounds have not been acquired or tested, since they are known cruzain inhibitors - already described in the literature and are structurally similar to the inhibitors used in the construction of the mode!. Referring to new inhibitors found, Model II showed a hit rate of 5,3%. This value is in agreement with those found in the literature, which ranges from 1 to 50%.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Introduction: Regenerative endodontic therapy in immature teeth with necrotic pulps triggers continued root development, thereby improving the prognosis of these teeth. Disinfection of the canal is accomplished with an intracanal medicament, such as triple antibiotic paste (TAP) composed of metronidazole, ciprofloxacin, and minocycline. A modified triple antibiotic paste (MTAP) that replaces minocycline with clindamycin has recently been suggested to avoid the tooth discoloration and potential demineralization from minocycline. The effect these pastes have on radicular dentin is unknown. Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of two intracanal medicaments used during endodontic regeneration, TAP and MTAP, at concentrations of 1 g/mL and 1 mg/mL, on the microhardness and chemical structure of radicular dentin. Materials and Methods: Roots from extracted, unrestored, non-carious human premolar teeth were sectioned. An antibiotic paste (MTAP or TAP) or sterile water (control) was applied to treatment groups and stored for four weeks in 80-percent humidity at 37 °C. The effect of each paste on the microhardness of radicular dentin was measured using a Vickers Microhardness Tester (n = 17) to take three pretreatment and post-treatment measurements at both 500 µm and 1000 µm from the pulp-dentin interface. The chemical structure was assessed from dentin specimens treated with the same medicaments or sterile water for four weeks. After treatment, three measurements were taken on each specimen using Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy to measure the phosphate/amide I ratios of dentin (n = 7). Results: The 1 g/mL of TAP or MTAP and the 1 mg/mL methylcellulose-based TAP caused significant reduction in microhardness of roots compared with untreated control roots at 500 µm and 1000 µm from the pulp-dentin interface. Furthermore, the methylcellulose-based 1 mg/mL TAP and MTAP caused significantly less reduction in microhardness compared with 1 g/mL TAP and MTAP. The 1 g/mL of TAP and DAP caused significantly lower phosphate/amide I ratios compared with other groups. Conclusion: The use of methylcellulose based 1 mg/mL of TAP and MTAP may minimize the reduction in microhardness of roots compared with the currently used 1 g/mL concentration of these antibiotics.