Submitted by Luiz Cesar Maranho (lc-maranho@bol.com.br) on 2018-10-11T20:16:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final.pdf: 1883342 bytes, checksum: 85a25606a3113b39d6d4354dcaa161d8 (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-10-15T12:39:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maranho_lc_me_sjrp.pdf: 5069791 bytes, checksum: 2501e6acc67bdd7103eb807f326a4c0b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T12:39:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maranho_lc_me_sjrp.pdf: 5069791 bytes, checksum: 2501e6acc67bdd7103eb807f326a4c0b (MD5) Previous issue date: 2018-08-20 / O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor responsável por diversas arboviroses como a dengue, a febre amarela, o vírus zika e a febre chikungunya. Devido a sua resistência, adaptabilidade e proximidade ao homem, o Aedes aegypti é atualmente um dos maiores problemas de saúde pública no Brasil e nas Américas. Mesmo com os avanços e investimentos em pesquisas com vacinas, monitoramento, campanhas educativas e diversos tipos de controle deste vetor, ainda não existe um método eficaz para controlar e erradicar o mosquito. Portanto, esse trabalho destina-se ao auxílio na criação de estratégias para controlar esse agente transmissor, mediante a análise do espaço de estados e a estabilidade assintótica de uma dinâmica não linear para controle populacional do Aedes aegypti via a técnica de linearização de Lyapunov, além de apresentação de formas de prevenção e combate aos criadouros do mosquito. A dinâmica não linear proposta é uma dinâmica simplificada obtida de um modelo não linear existente na literatura, proposto por Esteva e Yang em 2005 e se baseia no ciclo de vida do mosquito, que é dividido em duas fases: fase imatura ou aquática (ovos, larvas e pupas) e fase alada (mosquitos adultos). Na fase adulta, os mosquitos são divididos em machos, fêmeas imaturas e fêmeas fertilizadas, sendo que a dinâmica proposta nesta dissertação de mestrado é baseada nos estudos efetuados por Reis desde 2016, obtendo um modelo simplificado no qual a soma das densidades das populações de fêmeas imaturas e fêmeas fertilizadas serão consideradas como fêmeas adultas. / The mosquito Aedes aegypti is the main vector responsible for several arboviruses such as dengue fever, yellow fever, zika virus and chikungunya fever. Due to its resistance, adaptability and proximity to humans, Aedes aegypti is currently one of the major public health problems in Brazil and the Americas. Even with the advances and investments in research with vaccines, monitoring, educational campaigns and various types of control of this vector, there is still no effective method to control and eradicate the mosquito. Therefore, this work is intended to aid in the creation of strategies to control this transmitting agent by analyzing the state space and the asymptotic stability of a nonlinear dynamics for population control of Aedes aegypti via the Lyapunov linearization technique to present ways of preventing and combating mosquito breeding sites. The proposed nonlinear dynamics is a simplified dynamics obtained from a nonlinear model existing in the literature, proposed by Esteva and Yang in 2005 and based on the life cycle of the mosquito, which is divided into two phases: immature or aquatic phase (eggs, larvae and pupae) and winged phase (adult mosquitoes). In the adult phase, mosquitoes are divided into males, immature females and fertilized females, and the dynamics proposed in this dissertation is based on studies carried out by Reis since 2016, obtaining a simplified model in which the sum of the densities of the populations of females immature and fertilized females will be considered as adult females.

Zusammenfassung Yauhen Karliuk Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2022 52 Seiten, 7 Abbildungen, 116 Literaturangaben, 1 Publikation Schlüsselwörter: Chikungunya-Virus; 3′ UTR; direct repeats (DRs); CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante; Vektorkompetenz; Aedes vexans; Culex pipiens Einleitung: Arthropoden-übertragene Viren (Arboviren) spielen weltweit eine große Rolle für die Gesundheit von Menschen und Tieren. Das Chikungunya-Virus (CHIKV) wird v.a. durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Die Hauptvektoren sind Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Aedes albopictus (Ae. albopictus), wobei letzterer sich zunehmend auch in gemäßigten Breiten etabliert. Ziele der Untersuchungen: Zum einen sollte untersucht werden, ob auch die Stechmückenarten Aedes vexans (Ae. vexans) und Culex pipiens molestus (Cx. pipiens), die in gemäßigten Klimazonen vorkommen, als CHIKV-Vektoren fungieren können. Zum anderen sollte der Einfluss von Deletionen der Sequenzwiederholungen (DR) in der 3‘ nichttranslatierten Region (3‘ UTR) auf die virale Replikation in Zellkultur und in Stechmücken untersucht werden. Tiere, Material und Methoden: Zunächst wurde eine CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante mit einer Deletion von DR1a und DR2a in der 3́ UTR (CHIKV-ΔDR) hergestellt und diese bezüglich der Wachstumskinetik mit Chikungunya-Wildtyp-Virus (CHIKV-WT) in C6/36- und Aag2-Stechmückenzellen sowie in BHK-21/J- Wirbeltier-Zellen verglichen. Um die Vektorkompetenz von beiden Viren in Stechmücken zu untersuchen, wurden Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. vexans und Cx. pipiens in einem Insektarium gezüchtet. Bei den Infektionsexperimenten im S3-Labor wurden insgesamt 27 Ae. aegypti, 20 Ae. albopictus, 78 Ae. vexans und 62 Cx. pipiens Stechmücken verwendet. In diesen Experimenten wurden diese mit CHIKV-ΔDR und CHIKV-WT sowohl oral mit je 1x 10^6 PFU/ml über eine Fütterungsmembran als auch intrathorakal mit je 200 PFU (zur Umgehung der Mitteldarmbarriere) infiziert und an verschiedenen Tagen nach der Infektion und in verschiedenen Körperteilen sowie im Speichel auf virale RNA mittels Real-Time Reverser Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Unterschiede in der Virusreplikation wurden entweder mit Mann-Whitney- oder Fisher’s Exakt-Test überprüft. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Beide Viren, das CHIKV-WT und das CHIKV-ΔDR, zeigten ein vergleichbares Wachstum in Wirbeltier-Zellen (BHK-21/J) und erreichten einen Titer von 5x 10^8 PFU/ml. Das Wachstum beider Viren war auch in von Ae. albopictus abgeleiteten C6/36- Stechmückenzellen effizient, wobei CHIKV-WT ein um knapp eine Log-Stufe höheres Wachstum zeigte als CHIKV-ΔDR. In unseren Experimenten zeigte CHIKV-WT ein weniger effizientes Wachstum in von Ae. aegypti abgeleiteten Aag2-Stechmückenzellen, als in Ae. albopictus abgeleiteten C6/36-Stechmückenzellen, obwohl Ae. aegypti als Hauptvektor für CHIKV-WT gilt. In einer intrathorakalen und oralen Infektion konnten sowohl die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus als auch die einheimische Stechmückenarten Ae. vexans und Cx. pipiens erfolgreich infiziert werden. Bei einer intrathorakalen Infektion mit Umgehung der Mitteldarmbarriere wurde bei Ae. vexans oder Cx. pipiens eine effizientere Virusreplikation beobachtet als bei einer oralen Infektion. CHIKV-WT zeigte eine signifikant höhere Replikation in Ae. vexans im Vergleich zu CHIKV-ΔDR am Tag 7 und am Tag 14 nach der Infektion. Bei Cx. pipiens wurden signifikante Unterschiede für CHIKV-WT im Vergleich zu CHIKV-ΔDR nur am Tag 7 beobachtet. Schlussfolgerungen: Das beeinträchtigte Wachstum in C6/36- und Aag2-Zellen von CHIKV-ΔDR deutet darauf hin, dass die deletierten Sequenzwiederholungen spezifisch mit noch unbekannten Faktoren in Stechmückenzellen interagieren. Dennoch konnte CHIKV-ΔDR die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus problemlos nach intrathorakaler und oraler Infektion infizieren. Die Mitteldarm-Entweichungsbarriere scheint also nicht der einzige Faktor zu sein, der die Vektorkompetenz von Stechmücken beeinflusst. Auch die Replikationskinetik des Virus in den Sekundärgeweben scheint bei den verschiedenen Stechmückenarten unterschiedlich zu sein. Zwar umfassten unsere Studien zur oralen Infektion mit CHIKV nur einige einheimische Ae. vexans und Cx. pipiens Stechmücken, jedoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Stechmücken potenziell als Vektoren für CHIKV dienen können.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Alphaviren 2 2.1.1 Klassifikation 2 2.1.2 Virusmorphologie und Genomaufbau 2 2.1.3 Virusreplikation 4 2.2 Chikungunya-Virus 5 2.2.1 Übertragungszyklus 5 2.2.2 Epidemiologie 7 2.2.3 Genotypen und die 3′ UTR Region 9 2.2.4 Chikungunya-Fieber 12 2.3 Stechmücken 13 2.3.1 Taxonomie und Stechmückenarten in Deutschland 13 2.3.2 Allgemeine Morphologie, Biologie und Ökologie 14 2.3.2.1 Eiablage und Schlüpfen der Larven 15 2.3.2.2 Aquatische Entwicklungsstadien 16 2.3.2.3 Adulte 17 2.3.2.4 Flugverhalten und Überwinterungsstrategien 19 2.3.3 Arboviren in Deutschland 20 3 Publikation 26 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 26 3.2 Publikation 27 4 Diskussion 42 5 Zusammenfassung 49 6 Summary 51 7 Literaturverzeichnis 53 8 Danksagung 66

Ce travail de thèse s'attache à identifier des plantes et/ou molécules à activités cytotoxique, antioxydante, anti-inflammatoire et antivirale ciblant le virus du chikungunya (CHIKV) dans le but de trouver des alternatives thérapeutiques vis-à-vis du stress oxydatif et de l'inflammation, mécanismes impliqués dans les maladies chroniques non transmissibles (diabète, obésité…), et de la maladie du chikungunya, maladie vectorielle réémergente. La première partie de ces travaux présente les résultats obtenus lors d'un criblage d'activités biologiques réalisé sur une sélection de dix-huit plantes endémiques et indigènes de La Réunion. Les activités ciblées ont été les activités cytotoxiques sur une lignée cellulaire humaine (cellules THP-1), les activités antioxydantes évaluées par un test in cellulo d'hémolyse et par quatre tests chimiques (TEAC/DPPH/FRAP/ORAC) ainsi qu'une évaluation de la teneur en composés phénoliques (test FOLIN) et les activités anti-inflammatoires testées sur des macrophages murins (cellules RAW-BlueTM). Les résultats obtenus ont permis de mettre, plus particulièrement, en évidence les activités de différents extraits : cytotoxique pour Carissa spinarum, antioxydantes pour Agarista buxifolia et Dryopteris wallichiana et anti-inflammatoire pour Stillingia lineata et Indigofera ammoxylum. La deuxième partie du travail est consacrée à l'étude phytochimique d'une espèce indigène de La Réunion, Stillingia lineata, choisie en raison des résultats obtenus lors de ce criblage biologique préliminaire et de ceux du programme Phytochik. Un fractionnement bioguidé par un test antiviral, réalisé sur des cellules Vero (cellules rénales de singe vert Cercopithecus aethiops) contaminées par le CHIKV, a conduit à l'isolement de trois macrocycles diterpéniques rares de type tonantzitlolone dont l'un présente une structure non caractérisée jusque-là, et d'un pimarane de structure nouvelle. La 4'-acétoxytonantzitlolone a été identifiée comme molécule candidate contre le CHIKV (CE50 = 7 μM). Des relations structure-activité ont pu être définies ; la présence d'un groupement oxygéné sur la chaîne latérale des tonantzitlolones semble jouer un rôle important sur la réponse antivirale de ces squelettes diterpéniques. / The aims of this PhD work were to identify plants and/or molecules with cytotoxic, antioxidant, anti-inflammatory or antiviral (chikungunya virus , CHIKV) activities in order to find therapeutic alternatives towards oxidative stress and inflammation, mechanisms involved in chronic noncommunicable diseases (diabetes, obesity ...), and chikungunya disease, reemerging vector-borne disease. The first part of this work presents the results obtained from a biological screening carried out on a selection of eighteen endemic and indigenous plants of La Réunion. The targeted activities were cytotoxicity on a human cell line (THP-1), antioxidant activities evaluated using an in cellulo hemolysis assay and four chemical tests (TEAC / DPPH / FRAP / ORAC) together with an evaluation of the content of phenolic compounds (FOLIN test) and anti-inflammatory activity tested in murine macrophages (RAW cells-BlueTM). The results allowed to highlight activities of different extracts in particular : cytotoxic for Carissa spinarum, antioxidant for Dryopteris wallichiana and Agarista buxifolia and anti-inflammatory for Stillingia lineata and Indigofera ammoxylum.The second part of this work is devoted to the phytochemical study of Stillingia lineata, an indigenous species of La Réunion chosen because of the results obtained in this preliminary biological screening and those carried out in Phytochik programme. Bioassay-guided fractionation performed on Vero cells (green monkey kidney cells Cercopithecus aethiops) infected with CHIKV led to the isolation of three rare macrocycle-type diterpenes called tonantzitlolone and a new pimarane. The 4'-acetoxytonantzitlolone was identified as a candidate molecule against CHIKV (EC50 = 7 μM). Structure-activity relationships have been defined, the presence of an oxygenated group on the side chain of tonantzitlolones seems to play an important role in the antiviral response of the diterpene skeleton.