Le but de cette étude était d’évaluer si la bone morphogenetic protein (BMP)-2 pouvait aider à contrôler le phénotype de chondrocytes humains dans des conditions de culture à long terme nécessaires pour la transplantation de chondrocytes autologues (TCA). Nous avons aussi évalué le potentiel de la BMP-2 comme facteur de réparation du cartilage, en combinaison avec un biomatériau à base de collagène, pour étendre la technique aux lésions arthrosiques. Des chondrocytes humains ont été cultivés selon la procédure utilisée pour la TCA. Nous avons évalué la réponse des chondrocytes à la BMP-2 en culture monocouche ou dans les éponges de collagène par des analyses par PCR en temps réel, par Western blotting et Immunohistochimie.L’ajout de BMP-2 améliore le caractère chondrogénique des chondrocytes humains amplifiés en monocouche. L’effet stimulateur de la BMP-2 sur l’expression du collagène de type II a été observé au niveau des gènes mais aussi des protéines, ce qui est une propriété essentielle pour la reconstruction d’une matrice cartilagineuse. Nos résultats ont aussi montré que dans des chondrocytes tout d’abord amplifiés en monocouche puis cultivés en éponges de collagène en présence de BMP-2, la BMP-2 est capable de restaurer l’expression du gène COL2A1 et la synthèse de collagène de type II qui avaient été perdues pendant l’amplification. De manière importante, aucun signe de maturation hypertrophique ou d’induction ostéogénique n’a été détecté. Cette étude est la première à révéler le bénéfice de l’ajout de BMP-2 à des chondrocytes humains comme un agent thérapeutique pour la réparation du cartilage. / The aim of this study was to investigate if bone borphogenetic brotein (BMP)-2 could help to control human chondrocytes phenotype in long-term culture conditions necessary for autologous chondrocyte implantation (ACI). We also evaluated the potential of BMP-2 as a repair factor in combination with collagen-based biomaterials, to extend the technique to osteoarthritic lesions. Human chondrocytes were cultured independently, according to the procedure used for ACI. We evaluated the responsiveness of chondrocytes to BMP-2 when cultured in monolayer or within collagen sponges using Real-time PCR, Western blotting and Immunohistochemistry. Exogenous BMP-2 improved the chondrogenic character of human chondrocytes when amplified in monolayer. The stimulatory effect of BMP-2 on type II collagen expression was observed not only at the mRNA level but also at the protein level, and this is crucial for cartilage matrix reconstruction. Our data with human chondrocytes first amplified in monolayer then cultured in collagen sponges in the presence of BMP-2 have revealed that BMP-2 is able to restore COL2A1 gene expression and type II collagen synthesis that were lost during the amplification step. Importantly, no sign of hypertrophic maturation or osteogenic induction was detected beside the chondrogenic stimulatory effect of BMP-2. This study is the first to reveal the benefit of adding exogenous BMP-2 to human chondrocytes as a therapeutic agent for cartilage repair.

Parmi les facteurs de risque environnementaux de l'arthrose, la consommation de tabac occupe une place importante, mais reste encore controversée. Parmi les 4000 composés présents dans la cigarette, la nicotine est l'une des molécules les plus actives physiologiquement. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'impact de la nicotine sur les chondrocytes humains et la prolifération et la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton (CSM-GW). Nous avons trouvé que la nicotine aux concentrations utilisées n’a pas d’effet sur la prolifération cellulaire, mais induit une augmentation de l’expression de la métalloproteinase matricielle (MMP13) dans les chondrocytes humains. Ces données suggèrent que la nicotine a un effet pro-catabolique sur les chondrocytes humains, en stimulant la dégradation des composants matriciels. Chez des patients arthrosiques fumeurs, les voies de synthèse et de dégradation des composants matriciels sont plus activées dans les chondrocytes par rapport aux non fumeurs. De plus, la nicotine inhibe la prolifération et la migration cellulaire de CSM-GW, et présente un effet délétère sur la chondrogénèse de CSM-GW. Elle stimule la réaction inflammatoire et la différenciation hypertrophique. Nous avons montré, pour la première fois, l'expression du nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), en particulier de la sous unité α7 dans les CSM-GW aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. L’effet délétère de la nicotine sur les CSM-GW serait probablement médiée par la sous unité α7 nAChR, De façon intéressante, l’α-Bungarotoxin (α-BTX), inhibiteur spécifique de α7 nAChR, peut réverser cet effet partiellement. En conclusion, nous suggérons que la nicotine pourrait altérer l’ontogenèse du cartilage, et induire potentiellement l’augmentation de la prévalence de l’arthrose chez l’adulte / Among the environmental risk factors for osteoarthritis (OA), tobacco consumption features prominently but is still controversial today. Among the 4,000 compounds present in cigarette smoke, nicotine is one of the most physiologically active molecules. The aim of the study is to measure the impact of nicotine on human chondrocytes and on the proliferation and chondrogenic differentiation of Wharton’s Jelly stem cells (WJ-MSC). We found that nicotine at the concentrations used had no effect on the proliferation of primary human OA chondrocytes, but induced an increase in the expression of matrix metalloproteases (MMP13). It unravels the catabolic effects of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. This result suggests a pro-catabolic effect of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. In smokers, the synthesis as well as the degradation pathways in chondrocytes are stimulated, when compared to no smokers. In addition, the cell proliferation and migration of WJ-MSC were significantly impaired by nicotine, and it also had an adverse effect on the chondrogenesis of WJ-MSC by stimulating the inflammatory response and hypertrophic differentiation. We have shown, for the first time, the expression of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), in particular that of the α7 subunit in the WJ-MSC at the transcriptional and translational levels. The adverse effect of nicotine on WJ-MSC was probably mediated by α7 nAChR. Interestingly, α-Bungarotoxin (α-BTX), a specific inhibitor of α7 nAChR, could partially reverse this effect. In conclusion the results show that nicotine has an adverse effect on the ontogenesis of cartilage, and potentially induces an increase in the prevalence of osteoarthritis in adults

La spondyloarthrite (SpA) est une pathologie rhumatologique caractérisée notamment par une inflammation et par des ossifications excessives se formant au niveau des enthèses. Il s’agit de zones de fortes contraintes mécaniques où les tendons et ligaments sont ancrés dans l’os via une zone fibrocartilagineuse. La sphingosine 1-phosphate (S1P) est un lipide bioactif qui joue un rôle important à la fois dans le remodelage osseux et la réponse inflammatoire. Notre objectif était donc d’explorer le rôle de la S1P dans l’ossification excessive de la SpA. Nous avons observé que les taux sériques de S1P des patients atteints de SpA sont significativement supérieurs à ceux de donneurs contrôles. Nous avons utilisé comme modèle des cultures primaires murines d’ostéoblastes, de chondrocytes et de ténocytes et des cultures organotypiques d’enthèse de souris. Nous avons observé que les enzymes de synthèse de la S1P, les sphingosine kinases 1 et 2, contribuent à la minéralisation des ostéoblastes et des chondrocytes. L’effet pro-minéralisant de la S1P est partiellement médié par deux de ses récepteurs (S1P1 et S1P3). De plus, la production de S1P est stimulée suite à un étirement cyclique dans les ostéoblastes et les chondrocytes, et après un traitement avec les cytokines TNF-α et IL-17 dans les chondrocytes. Finalement, l’inhibition générale du métabolisme de la S1P par le Fingolimod conduit à une diminution de la minéralisation dans les ostéoblastes et encore davantage dans les chondrocytes. Ces résultats suggèrent que le métabolisme de la S1P participe à l’ossification excessive de la SpA. Des études in vivo sont maintenant nécessaires pour valider cette possibilité / Spondyloarthritis (SpA) is a rheumatic disease characterized in particular by enthesis ectopic ossification and inflammation. Enthesis is a zone of concentration of mechanical stresses where ligaments and tendons attach to bone through fibrocartilaginous connections. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive lipid that plays an important role in both bone remodelling and in inflammatory response. Our aim was to explore the role of S1P in SpA excessive ossification. We observed that serum S1P concentrations in SpA patients are significantly higher compared to control donors. We used primary mouse osteoblasts, chondrocytes and tenocytes as cellular models and organotypic cultures of mice enthesis. We observed that S1P synthetizing enzymes, sphingosine kinases 1 and 2, stimulate osteoblasts’ and chondrocytes’ mineralizing process. S1P pro-mineralizing effect was partially mediated by two of the S1P receptors (S1P1 and S1P3). Moreover, S1P production was enhanced by cyclic strain in osteoblasts and chondrocytes and by pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-17) in chondrocytes. Finally, the inhibition of S1P metabolic pathway by Fingolimod reduced the mineralization in cultured osteoblasts and even more in chondrocytes. These results suggest that S1P metabolism participates in SpA excessive ossification. In vivo studies are now needed to validate this possibility

Chez les patients souffrant d'insuffisance rénale chronique, les calcifications vasculaires représentent la première cause de mortalité. Elles résultent de la trans-différenciation des cellules musculaires lisses (CMLs) en cellules de type ostéoblastique et/ou chondrocytaire, en réponse à des cytokines inflammatoires ou à une hyperphosphatémie. Les CMLs forment alors des cristaux par l'activité de la phosphatase alcaline non-spécifique du tissu (TNAP). A la lumière de résultats récents, nous avons émis l'hypothèse que la TNAP module la trans différenciation des CMLs. Nos objectifs étaient donc de déterminer l'effet de la TNAP dans la trans-différenciation des CMLs, et d'étudier les mécanismes impliqués dans son induction, avec un intérêt particulier pour les microRNAs. Nous avons observé que l'ajout de phosphatase alcaline purifiée ou la surexpression de TNAP stimule l'expression de marqueurs chondrocytaires en culture de CMLs et de cellules souches mésenchymateuses. De plus, l'inhibition de la TNAP bloque la maturation de chondrocytes primaires. Nous excluons un rôle des cristaux formés par la TNAP, puisque l'ajout de cristaux seuls ou associés à une matrice collagénique n'a pas reproduit les effets de la TNAP. Nous suspectons que la TNAP agit en hydrolysant le pyrophosphate inorganique (PPi). En effet, c'est la TNAP qui hydrolyse le PPi en culture de CMLs et de chondrocytes, et le PPi mime les effets de l'inhibition de TNAP en culture de chondrocytes. Enfin, nous rapportons le profil de microRNA des artères cultivées en conditions hyperphosphatémiques. Ces résultats pourraient être particulièrement importants dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques / In patients with chronic kidney disease (CKD), vascular calcification represents the main cause of mortality. Vascular calcification results from the trans-differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) into cells similar to osteoblasts and/or chondrocytes, in response to inflammatory cytokines or hyperphosphatemia. Calcifying VSMCs form calcium phosphate crystals through the activity of tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). In light of recent findings, we hypothesized that TNAP also modulates VSMC trans-differentiation. Our objectives were therefore to determine the effect of TNAP activity on VSMC trans-differentiation, and secondly to investigate the molecular mechanisms involved in TNAP expression in aortas, with a particular interest in microRNAs. We first observed that addition of purified alkaline phosphatase or TNAP over-expression stimulates the expression of chondrocyte markers in culture of the mouse and rat VSMC lines, and of mesenchymal stem cells. Moreover, TNAP inhibition blocks the maturation of mouse primary chondrocytes and reduces mineralization. We exclude a role for crystals in TNAP effects, since addition of crystals alone or associated to a collagenous matrix fails to mimic TNAP effects. We rather suspect that TNAP acts through the hydrolysis of inorganic pyrophosphate (PPi). Indeed, PPi is hydrolyzed by TNAP in VSMCs and chondrocytes and addition of PPi mimics the effects of TNAP inhibition on chondrocyte maturation. Finally, we report microRNA signature of aortic explants treated under hyperphosphatemic conditions that induce vascular calcification. These results could be of particular importance in patients with CKD

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O desenvolvimento da articulação do quadril tem sido de intenso interesse devido à escassa informação acerca dos aspectos morfológicos e ultraestruturais em fetos humanos de diferentes faixas etárias. Pretende-se avaliar os aspectos morfofuncionais e ultraestruturais do desenvolvimento da cartilagem articular da epífise da cabeça do fêmur. Foram utilizados 20 fetos humanos de idades compreendidas entre 16 a 31 semanas de vida intra uterina (VIU), fixados em solução de formol a 10% e conservados em glicerina. Os fetos foram divididos em 4 grupos (n=5): grupo 1 (G1): 16-19 semanas VIU; grupo 2 (G2): 20-23 semanas VIU; grupo 3 (G3): 24-27 semanas VIU e grupo 4 (G4): 28-31 semanas VIU. Os espécimes foram divididos em uma metade anterior e outra, posterior através de um corte frontal em sua parte média. Os antímeros direitos foram processados através da microscopia de luz para análise quantitativa a fim de determinar a área, a densidade dos condrócitos e de matriz extracelular (MEC), e o volume e para análise qualitativa a fim de determinar a distribuição e organização das fibras colágenas na MEC através da coloração da Safranina-O e do Picro-sirius. Os antímeros esquerdos foram submetidos à microscopia eletrônica de varredura. Foram encontradas diferenças significantes entre os grupos com o aumento da área e do volume de condrócitos com a avanço das idades de forma gradativa. Quanto maior a faixa etária, menor o número de condrócitos, e maior a densidade percentual de matriz extracelular. Através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), na superfície da epífise, a organização e orientação das fibras de colágeno mudaram nos diferentes grupos, de uma orientação irregular no grupo de fetos mais jovens, para uma organização pantográfica no grupo de fetos mais desenvolvidos. Conhecer a organização e o desenvolvimento normal cartilagíneo da cabeça do fêmur contribui com conhecimentos morfológicos para entender melhor a maturação do colágeno nos locais de reparo dos tecidos e embasar aspectos relacionados a doenças e malformações da articulação. / The development of the hip joint has been of intense interest due to the scarce information about the morphological and ultrastructural aspects in human fetuses of different age groups. It is intended to evaluate the morphofunctional and ultrastructural aspects of the development of the articular cartilage of the epiphysis of the femoral head. Twenty human fetuses aged between 16 and 31 weeks of intrauterine life (IUL), fixed in 10% formalin solution and preserved in glycerin, were used. Fetuses were divided into 4 groups (n = 5): group 1 (G1): 16-19 weeks VIU; group 2 (G2): 20-23 weeks VIU; group 3 (G3): 24-27 weeks VIU and group 4 (G4): 28-31 weeks VIU. The specimens were divided into an anterior half and a posterior one through a frontal cut in the middle part. The right antimers were processed by light microscopy for quantitative analysis to determine the area, chondrocyte density and extracellular matrix (ECM), and volume and for qualitative analysis in order to determine the distribution and organization of collagen fibers in MEC through the staining of Safranin-O and Picrosirius. The left antimers were submitted to scanning electron microscopy. Significant differences were found between groups with increasing area and volume of chondrocytes with advancing age gradually. The higher the age group, the lower the number of chondrocytes, and the higher the percentage density of extracellular matrix. Through scanning electron microscopy (SEM), on the surface of the epiphysis, the organization and orientation of the collagen fibers changed in the different groups, from an irregular orientation in the group of younger fetuses, to a pantographic organization in the group of more developed fetuses. Knowing the normal organization and development of the cartilaginous head of the femur contributes with morphological knowledge to better understand the maturation of collagen in the tissue repair sites and to support aspects related to diseases and malformations of the joint.