Le projet international de synthèse des chromosomes de S. cerevisiae (projet Sc2.0) a débuté il y a une dizaine d'années en suivant des principes établis par le Pr. Jef Boeke. Les chromosomes synthétiques ont été conçus pour augmenter la stabilité du génome en supprimant toutes les séquences répétées (ARNt, éléments transposables...), tout en y ajoutant un système d'évolution inductible dépendant du système Cré/LoxP (système SCRaMbLE), permettant de générer rapidement des réarrangements chromosomiques. Bien que le design du projet Sc2.0 soit très conservateur en ce qui concerne le contenu des gènes, la suppression de plusieurs classes de séquences répétées peut affecter l'organisation du génome et potentiellement altérer les fonctions cellulaires. En utilisant la méthode de capture de conformation de chromosome couplée au séquençage de seconde génération (Hi-C), mon objectif a été de caractériser l'organisation 3D des génomes des souches synthétiques et évoluées. À ce jour, huit chromosomes (syn I, II, III, V, VI, IX-R, X et XII) ont été entièrement assemblés séparément. En utilisant les souches contenant un ou plusieurs de ces chromosomes, nous avons pu montrer que leur organisation génomique n'est globalement pas affectée par leur présence. Quelques exceptions subsistent, avec synIII dont les cassettes HML et HMR ont été retirées, et synXII d'où l'ADNr a été déplacé sur un autre chromosome. À ce stade, nous concluons que l'ADN répétitif dispersé ne conduit pas la conformation moyenne globale du génome de S. cerevisiae. Nous avons aussi exploité les cartes de contacts pour identifier les réarrangements dans les souches SCRaMbLE. / The international project Sc2.0 started 10 years ago by the Pr. Jef Boeke aims to build a fully synthetic genome of S. cerevisiae which increases the genome stability by removing all repeated sequences (tRNA, transposable elements, etc.), and implements SCRaMbLE (for Synthetic Chromosome Rearrangement and Modification by LoxP-mediated Evolution), an inducible, high-throughput chromosome rearrangement system. This design is highly conservative with respect to gene content, the deletion of several classes of repeated sequences and the introduction of thousands of designer changes. However, it may affect genome organization and potentially alter cellular functions. To determine wether those modifications affected the three-dimensional conformation of synthetic chromosmes, we investigated it using chromosomes conformation capture coupled to second generation sequencing method (Hi-C). Currently, eight synthetic chromosomes (synI, synII, synIII, synV, synVI, synIX-R, synX et synXII) have been fully assembled. Using these strains we observed that the large-scale genomic organization is globally unaffected by the presence of synthetic chromosome(s). Two exceptions are synIII, which lacks the silent mating-type cassettes, and synXII, specifically when the ribosomal DNA is moved to another chromosome. We also exploited the contact maps to detect rearrangements induced in these SCRaMbLE strains.

Le gène ALK code pour un récepteur à activité tyrosine kinase exprimé principalement dans le système nerveux central et périphérique au cours du développement chez le mammifère. Ces informations font suspecter un rôle développemental du récepteur ALK bien que ses fonctions précises ne sont pas connues. De la même manière, ses ligands et les voies de signalisation qui lui sont associés demeurent mal caractérisés. En 2008, des mutations ponctuelles du gène ALK ont été identifiées dans des formes sporadiques et familiales de neuroblastome. Deux hotspots de mutation sont situés dans le domaine tyrosine kinase. Ces travaux de thèse ont permis d'étudier l'implication du gène ALK dans l'oncogenèse du neuroblastome sous des aspects cellulaires, génomiques et fonctionnels. L'étude de la régulation de l'activation et de l'adressage de la protéine ALK a révélé qu'à la différence des récepteurs sauvages, l'activation constitutive conduit à une rétention intracellulaire associée à une maturation incomplète des récepteurs mutés. Par ailleurs, la caractérisation complète du locus ALK dans le neuroblastome a mis en évidence une fréquence élevée de réarrangements chromosomiques. Ce travail a notamment identifié un réarrangement chromosomique conduisant à l'expression d'un variant du récepteur ALK tronqué pour une partie du domaine extracellulaire. Ce variant, associé à l'agressivité tumorale, est activé de façon constitutive et présente des propriétés oncogéniques. Enfin, l'analyse de souris knock-in exprimant les mutations AlkF1178L et AlkR1279Q a révélé un rôle majeur du gène Alk dans le développement du système nerveux sympathique. En effet, ces souris présentent une hyperplasie des ganglions sympathiques mise en place chez l'embryon et associée à une augmentation de la prolifération cellulaire à la naissance. Ce travail a aussi mis en évidence la coopération oncogénique in vivo entre les mutations du gène Alk et la surexpression du gène MYCN dans le neuroblastome. Les tumeurs générées chez les souris partageant ces deux altérations se développent après une courte période de latence et avec une pénétrance complète. L'analyse des tumeurs a mis en évidence des propriétés conférées aux tumeurs par les mutations du gène Alk. En effet, ces tumeurs expriment des marqueurs cholinergiques et montrent des signes de différenciation. Ces animaux permettent de mieux comprendre le rôle du gène ALK dans l'oncogenèse du neuroblastome et constituent de bons modèles d'étude préclinique des neuroblastomes dépendants de ALK.

Chez les trypanosomatidés, on observe un double cycle cellulaire : karyokinèse et cytodiérèse sont synchronisées mais indépendantes. La membrane nucléaire persiste au cours de la mitose dite fermée. Les modalités de réplication de l'ADN et de sa régulation, de même que plusieurs étapes de la ségrégation des chromosomes, restent non élucidées : le kinétochore est composé de protéines très atypiques (KKTs), et il existe un déficit du nombre de kinétochores par rapport au nombre de chromosomes. D'autre part, la constitution des pôles du fuseau mitotique associés à la membrane nucléaire est totalement inconnue. Les nucléoporines sont des protéines conservées au cours de l'évolution, principalement impliquées dans la constitution des pores nucléaires et le trafic entre le noyau et le cytoplasme, mais également de plus en plus considérées comme des acteurs importants de la dynamique chromatinienne. En utilisant des vecteurs d'expression protéique sous forme fusionnée à la GFP, nous avons déterminé la localisation subcellulaire de 15 nucléoporines chez Leishmania major. Si la plupart de ces nucléoporines se localisent à la membrane nucléaire, plusieurs d'entre elles ont des localisations secondaires qui peuvent être prédominantes. Ainsi la nucléoporine Mlp2 est préférentiellement localisée au niveau du kinétochore et, en fin de mitose, à l'extrémité du fuseau mitotique chez les deux parasites Leishmania major et Trypanosoma brucei. En accord avec la localisation de TbMlp2 au kinétochore chez T. brucei, où les centromères sont identifiés, nous avons fréquemment détecté TbMlp2 à proximité des séquences centromériques, elles-mêmes détectées par FISH en périphérie du nucléole. Egalement grâce à la technique de FISH, nous montrons que l'inhibition de l'expression de TbMlp2 par ARN-interférence perturbe la distribution des chromosomes au cours de la mitose, conduisant à une aneuploïdie. Paradoxalement, cette inhibition n'a aucun effet sur la croissance des cellules. Nous présentons également le cas singulier de Mlp1, dont la localisation chez T. brucei dépend du site d'intégration choisi. Cette localisation sera discutée à la lumière des phénotypes observés lors de l'inhibition de son expression. / Trypanosomatid parasites exhibit two independent though coordinated (nuclear and mitochondrial) cell cycles, and a closed mitosis, of which many constituents and processes are unknown. In particular, most steps of the chromosome segregation remain elusive: the kinetochore is composed of atypical proteins called KKT and the number of kinetochores is deficient in relation to the number of chromosomes. Moreover, the constitution of the nuclear membrane-associated mitotic spindle poles is unknown. Nucleoporins are evolutionary conserved proteins mainly involved in the constitution of the nuclear pores and trafficking between the nucleus and cytoplasm, but are also increasingly viewed as main actors in chromatin dynamics. Using GFP-fused proteins, we determined the cellular localization of the 15 nucleoporins in Leishmania major. If most of these nucleoporins localized at the nuclear membrane, some of them exhibited secondary locations which are predominant in a few cases. Thus, the nucleoporin Mlp2 localized preferentially at the kinetochore and, at the end of mitosis, at the mitotic spindle poles in both parasites Leishmania major and Trypanosoma brucei. Consistent with the localisation of TbMlp2 to the kinetochore in T. brucei, where centromeres are identified, TbMlp2 was frequently detected in the vicinity of the centromeric sequences in the periphery of the nucleolus. The use of FISH allowed us to show that RNAi knockdowns of TbMlp2 disturbed the distribution of chromosomes during mitosis, leading to aneuploidy. Paradoxically RNAi knockdowns of TbMlp2 had no effect on cell growth. We will also present the singular case of Mlp1 whose location is dependent on the integration site in T. brucei. This location will be discussed in the light of the phenotypes observed after inhibition of its expression.

De nombreuses bananes cultivées et consommées sont des hybrides interspécifiques triploïdes entre Musa acuminata (génome A) et Musa balbisiana (génome B). L'amélioration de ces cultivars nécessite de mettre en place des stratégies complexes liées à leur faible fertilité et leur niveau de ploïdie. De plus, le génome M. balbisiana porteur de caractères agronomiques intéressants est malheureusement porteur de séquences intégrées de Banana streak virus (ou eBSV pour endogenous BSV). Ces eBSV sont capables de produire, dans un contexte de croisements interspécifiques et sous conditions de stress abiotiques, des génomes viraux responsables de l'infection systémique du bananier. L'activation spontanée de ces eBSV est la contrainte majeure des programmes d'amélioration du bananier plantain depuis plus de 10 ans. La ségrégation des chromosomes A et B chez les clones polyploïdes interspécifiques de bananiers est encore très peu connue. Nous avons au cours de cette thèse analysé la recombinaison et la ségrégation chromosomique chez 184 plantes issues de la descendance AAAB (CRBP39) x AA (Pahang_Carbap) au moyen de 38 marqueurs SSR distribués sur les 11 chromosomes Musa et de 6 marqueurs PCR spécifiques des deux espèces BSV présentes chez CRBP39 (eBSGFV-7 et eBSOLV-1). Nous avons observé qu'au cours de la formation des gamètes chez l'allotétraploïde CRBP39, la plupart des marqueurs du tétraploïde AAAB CRBP39 ont une ségrégation de type tétrasomique et que les génomes A et B recombinent au niveau de tous les segments de chromosomes pour lesquels nous pouvions suivre les allèles du chromosome B. D'autre part, nous avons montré que 50% des descendants ont reçu, à un ou quelques loci, un ou trois allèles du parent AAAB (CRBP39) au lieu de deux. La composition allélique de ces gamètes aneuploïdes, la cartographie génétique et l'analyse des corrélations entre marqueurs suggèrent que cette particularité résulte d'une variation structurale entre génomes A et B. Un des chromosomes B correspondrait à une partie des chromosomes 1A et 3A. Nous avons également observé une distorsion de ségrégation des loci eBSV avec une surreprésentation d'individus possédant au moins une intégration eBSV (86%). La régulation des eBSV semble très complexe et nécessitera des études complémentaires pour tenter d'identifier le ou les facteurs génétiques impliqués. Finalement, notre travail a montré que des croisements de type AAAB x AA peuvent générer des plantes possédant du génome B sans aucune intégration BSV (13%). Ce résultat est important car il ouvre une voie de contournement à la contrainte eBSV dans les programmes d'amélioration génétique. / Many cultivated and consumed banana are interspecific triploid hybrids between Musa acuminata (A genome) and Musa balbisiana (B genome). The genetic improvement of these cultivars requires the implementation of complex breeding strategies due to their low fertility and ploidy level. In addition, the B genome of M. balbisiana which bears interesting agronomic traits unfortunately carries endogenous Banana streak virus sequences (eBSV). Under certain conditions such as interspecific crosses and abiotic stresses, these eBSV are able to produce infectious viral genomes responsible for systemic infection of banana. The spontaneous activation of these eBSV is the major constraint of plantains improvement programs for more than 10 years. The A and B chromosomes recombination and segregation in interspecific polyploids banana are still poorly understood. We here analyzed chromosomes recombination and segregation in 184 offspring from the cross AAAB (CRBP39) x AA (Pahang_Carbap) using 38 SSR markers distributed on the 11 Musa chromosomes and 6 specific PCR markers of both BSV species integrated in CRBP39 (eBSGFV-7 and eBSOLV-1). We noticed that during CRBP39 meiosis most of the SSR markers have tetrasomic segregation and that A and B genomes recombine at all chromosomes segments where we were able to follow chromosome B alleles. Besides, we showed that 50% of the offspring received at one or several loci, one or three alleles of the CRBP39 parent instead of two. The allelic composition of these aneuploid gametes, the genetic map and the analysis of correlations between markers suggest that this peculiar observation is due to a structural variation between A and B genomes. One of the B chromosomes would be part of chromosomes 1A and 3A. We also noticed a distorted segregation of eBSV loci with an overrepresentation of individuals harboring at least one of the eBSV (86%). eBSV regulation seems very complex and requires additional studies to identify the genetic factor(s) involved. Finally, we also showed that AAAB x AA crosses can generate plants with B genome but without eBSV. This is the case for 13% of the offspring. This result is important because it shows that we can overcome eBSV constraint in banana breeding programs.

Les translocations chromosomiques sont associées à un grand nombre de cancers. Les translocations chromosomiques sont impliquées dans la tumorigenèse par différents mécanismes : elles conduisent soit à une dérégulation d’un oncogène, soit à la formation d’un nouvel oncogène de fusion. Cependant, le lien direct entre l'apparition d'une translocation chromosomique et la formation d'une tumeur n'est pas totalement établi. Par exemple, plusieurs translocations associées au cancer ont été détectées dans le sang d’individus sains voire dans le sang de cordon des bébés avec une prévalence bien supérieure à celle de la maladie. Ceci suggère que la seule formation de la translocation ne suffit pas toujours à induire l’oncogenèse. La plupart des travaux de recherche antérieurs reposaient sur la surexpression de la protéine de fusion, oncogène supposé. Ces approches présentent de nombreuses limites, la translocation chromosomique est alors absente de même que le contexte chromosomique natif du gène de fusion (promoteur endogène, statut de la chromatine, etc.) ou les éventuels effets d’haplo-insuffisance qui ne sont pas récapitulés. La molécule d’ADN étant organisée de manière non aléatoire dans le noyau, les réarrangements chromosomiques sont également susceptibles d’affecter le statut épigénétique, la réplication et la transcription du chromosome dérivatif entier, en plus des segments d’ADN nouvellement juxtaposés. Or la technologie CRISPR/Cas9, permet de reproduire la translocation chromosomique in situ, après avoir induit deux cassures double-brin simultanées. Ce travail de thèse a porté spécifiquement sur la translocation t(2,5) (p23, q35) qui induit l’expression de la protéine de fusion NPM1-ALK fréquemment rencontrée dans le lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Nous avons reproduit la t(2,5) à la fois dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules T primaires à la fin de ma thèse. Nous avons pu montrer des modifications significatives du timing de réplication des cellules qui portent la translocation en comparaison des cellules isogéniques de départ (par la méthode du Répli-seq) pouvant avoir un impact sur l’homéostasie des cellules tumorales. En parallèle, nous avons mis en évidence la formation d'ARN circulaires de fusion spécifiques, exprimés à partir du gène de fusion, spécifiques des lignées tumorales. Ces ARN circulaires pourraient donner naissance à de nouveaux biomarqueurs diagnostic/pronostic dans le futur. Ces travaux permettront de mieux comprendre les conséquences des translocations chromosomiques oncogéniques dans les cellules humaines et pourraient mener vers de nouvelles orientations thérapeutiques à l’avenir. / Chromosomal translocations are associated with a wide range of cancers. These chromosomal rearrangements are implicated in tumorigenesis by different mechanisms: either they lead to oncogene upregulation or tumor suppressor downregulation. However, the direct link between the appearance of one chromosomal translocation and tumor formation is not always clear. For example, several cancer translocations have been found in PBMCs or in cord blood cells from healthy individuals, suggesting that translocation formation alone is not always sufficient to drive oncogenesis. Most of previous research works on cancer translocation relied on studies using overexpression of the fusion protein. These approaches do not reproduce the chromosome arm translocation nor the chromosomal context of the fusion gene (endogenous promotor, chromatin status etc…) or do not recapitulate a potential haplo-insufficiency of the translocated cells. Because the DNA molecule is organized non-randomly in the nucleus, chromosomal rearrangements are also likely to impact the epigenetic, replication and transcriptional status of the whole rearranged chromosome in addition to the newly juxtaposed gene segments. Using CRISPR/Cas9 technology, we can recapitulate chromosomal translocation in situ, after inducing 2 concurrent double-strand breaks. In this work, we focus on t(2,5)(p23,q35) leading to NPM1-ALK fusion protein frequently found in Anaplasic Large Cell Lymphoma (ALCL). We could recapitulate t(2;5) in cell lines but more importantly in human primary T cells from healthy donors. We showed significant modifications on Replication Timing in model cell lines compare to isogenic non-translocated cells (using Repli-seq analysis). Importantly, these changes might have a direct impact on tumor cell homeostasis. In parallel, we also highlighted the formation of specific fusion circular RNAs expressed from the fusion gene also found in tumor cells. These circular RNAs could give rise to new diagnostic/prognostic biomarkers in the future. This work will lead to a better understanding of the consequences of cancer translocation in human cells and could give new directions for therapeutics in future.

Le projet de recherche sous forme d’intervention nutritionnelle dont fait l’objet ce mémoire de maîtrise avait pour principal objectif de comparer la réponse lipidique à une supplémentation en acides gras polyinsaturés oméga-3 chez des porteurs et des non-porteurs du polymorphisme PPAR L162V. Quatorze hommes porteurs et quatorze non-porteurs du polymorphisme PPAR L162V ont été appariés pour l’âge et l’indice de masse corporelle. Chaque sujet recevait une supplémentation quotidienne en acides gras oméga-3 de 5g d’huile de poissons, et ce, pour une durée de six semaines. Avant l’intervention, les variables anthropométriques et les concentrations de lipoprotéines/lipides n’étaient pas associées au polymorphisme. Indépendamment du génotype, la supplémentation en acides gras oméga-3 fut reliée à la diminution significative des taux de triglycérides plasmatiques, de la concentration de glucose à jeun, de la pression artérielle diastolique et finalement de l’augmentation du taux d’apolipoprotéine B. Une interaction gène-diète significative a également été observée pour la protéine C-réactive . Les résultats de cette étude suggèrent que des variations du gène PPAR puissent contribuer à la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques de la protéine C-réactive en réponse aux acides gras polyinsaturés oméga-3. / The main objective of this master degree project was to examine whether omega-3 polyunsaturated fatty acids induced changes in cardiovascular disease risks factors are influenced by the PPAR L162V polymorphism. A total of 14 men carriers of the V162 allele and 14 L162 homozygotes were matched according to age and body mass index. All men were supplemented daily with 5g of fish oil during a 6-week period. At screening, both genotype groups were similar for anthropometric indices and plasma lipoprotein/lipid concentrations. Independently of the genotype, the supplementation was associated with a significant decrease in plasma triglyceride and fasting glucose concentrations, diastolic blood pressure and with an increase in total Apolipoprotein B concentrations. A significant genotype-by-diet interaction effect was observed for plasma C-reactive protein concentrations. The PPAR L162V polymorphism may contribute to the interindividual variability in the cardiovascular disease risk factor response to omega-3 polyunsaturated fatty acids.

Des mutants issus de l'instabilité génétique chez Streptomyces ambofaciens appelés Pig-pap ont été caractérisés. L'analyse du chromosome de la souche 29C1 a révélé un nouveau type de réarrangement associé à la production d'un pigment vert. Les mutants Pig-pap dépigmentés et non sporulants sont issus de papilles sur les colonies. L'introduction du gène whiG codant un facteur sigma permet le retour à la sporulation et à la pigmentation. Ce gène n'est pas muté et est transcrit chez ces mutants. Le gène whiH dont la transcription dépend de WhiG n'est pas transcrit. WhiG ne serait pas fonctionnel et une modification post-transcriptionnelle de whiG aboutirait au phénotype Pig-pap. L'analyse de mutants issus d'un transconjugant a montré que le transgène whiG constitue une cible mutationnelle. De plus, la production de ces mutants est augmentée lors d'une carence en acides aminés et un mutant relA ne produit pas de papille, impliquant la réponse stringente dans ce phénomène.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer. / An interesting feature of Bcl-xL protein is the presence of an unstructured loop domain between its α1 and α2 helices, a domain not essential for its anti-apoptotic function and absent in CED-9, ortholog protein in Caenorhabditis elegans. Within this domain, Bcl-xL undergoes dynamic phosphorylation and dephosphorylation at Ser49 and Ser62 during G2 and mitosis in human cancer cells. When these residues are mutated and proteins expressed in cancer cells, cells harbor mitotic defects, including chromosome mis-attachment, lagging, bridging and mis-segregation, events associated with chromosome instability and aneuploidy. To further analyze the effects of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in normal cells, the present studies were performed in normal human diploid cells, and in vivo in Caenorhabditis elegans. First, we studied normal human diploid BJ foreskin fibroblast cells expressing Bcl-xL(wild type), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) and the dual (S49/62A) and (S49/62D) mutants. Cells expressing S49 and/or S62 phosphorylation mutants showed reduced kinetics of cell population doubling. These effects on cell population doubling kinetics correlated with early outbreak of senescence with no impact on the cell death rate. Senescent cells displayed typical senescence-associated phenotypes including high-level of senescence-associated β-galactosidase activity, interleukin-6 secretion, tumor suppressor p53 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21Waf1/Cip1 activation as well as γH2A.X-associated nuclear chromatin foci. Fluorescence in situ hybridization analysis and Giemsa-banded karyotypes revealed that the expression of Bcl-xL phosphorylation mutants in normal diploid BJ cells provoked chromosome instability and aneuploidy. These findings suggest that dynamic Bcl-xL Ser49 and Ser62 phosphorylation/ dephosphorylation cycles are important in the maintenance of chromosome integrity during mitosis in normal cells. Second, we undertook experiments in Caenorhabditis elegans to understand the importance of Bcl-xL Ser49 and Ser62 in vivo. Transgenic worms carrying single-site S49A, S62A, S49D, S62D and dual-site S49/62A mutants were generated and their effects were analyzed in germlines of young adult worms. Worms expressing Bcl-xL variants showed decreased egg-laying and hatching, variations in the length of their mitotic regions and transition zones, chromosomal abnormalities at their diplotene stages, and increased germline apoptosis. Some of these transgenic strains, particularly the Ser to Ala variants, also showed slight modulations of lifespan compared to their controls. The in vivo observations confirmed the importance of Ser49 and Ser62 within the loop domain of Bcl-xL in maintaining chromosome stability. These studies could impact future strategies aiming to develop and identify compounds that could target not only the anti-apoptotic domain of Bcl-xL protein, but also its mitotic domain for cancer therapy.

L’infertilité concerne 8 à 12% des couples en âge de procréer. Face à ce problème, des prises en charge médicales peuvent être proposées comme la fécondation in vitro (FIV) et l’injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI). Toutefois, le taux d’échec de ces techniques reste relativement élevé. Dans la première partie, l’impact des facteurs maternels et paternels sur les résultats de 194 cycles de FIV et 586 cycles d’ICSI a été étudié. L’âge maternel, le nombre d’ovocytes ponctionnés et matures influencent principalement les résultats. Ni l’âge paternel ni les paramètres spermatiques (numération et mobilité) ne s’associent significativement à l’échec des techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP). Seule la morphologie du spermatozoïde injecté a une influence sur la fécondation en ICSI. En deuxième partie, l’apoptose, la fragmentation de l’ADN et le contenu chromosomique avant et après tri cellulaire à l’aide des microbilles magnétiques ont été étudiés chez des hommes avec un taux de fragmentation de l’ADN spermatique anormal et chez des hommes porteurs d’une anomalie chromosomique constitutionnelle. Une diminution significative des spermatozoïdes apoptotiques avec un ADN fragmenté et chromosomiquement déséquilibrés a été observée. Le tri cellulaire aboutissant à une sélection de spermatozoïdes de meilleure qualité pourrait s’avérer une méthode de référence pour l’AMP. Dans une troisième partie, un protocole fiable a été élaboré pour étudier le transcriptome des spermatozoïdes. La mise au point de ces technologies permettra de mieux comprendre les causes d’échec des techniques d’AMP et ainsi améliorer leur taux de réussite. / Infertility concerns 8-12% of couples of reproductive age. Various medical treatments such as in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) are available to address this problem. However the rate of failure of these procedures remains relatively high.In the first part of this work the impact of maternal and paternal factors on the results of 194 IVF cycles and 586 ICSI cycles was studied. Results are mainly affected by maternal age, the number of oocytes retrieved and the number of mature oocytes collected. Neither paternal age nor spermatic parameters (number and mobility) are significantly associated with the failure of Assisted Reproductive Technologies (ART). Only the morphology of the sperm injected during ICSI influences fertilization rate.In the second part of this work apoptosis, DNA fragmentation and the chromosomal content before and after cell sorting with magnetic micro beads were studied in men with an abnormal level of sperm DNA fragmentation and in men with a constitutional chromosome abnormality. A significant decrease of apoptic spermatozoa with fragmented DNA and chromosome imbalance was observed. Thus cell sorting leading to the selection of better quality spermatozoa could become a reference method for ART.In a third part of the work a reliable protocol for the study of spermatic transcriptomes is designed.The development of these technologies will lead to a better understanding of the underlying causes ofART failure and thus increase the success rate.