Le raccourcissement télomérique est la source majeure de l'instabilité chromosomique (CIN) au cours de la progression tumorale. Nous avons montré que les cellules humaines embryonnaires de rein (cellules HEK) ayant traversé une période de CIN subissent des vastes changements dans l'expression des microARNs, ce qui induit une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), un processus permettant aux cellules cancéreuses épithéliales migrer et envahir de nouveaux tissus et former des métastases. Notre travail a aussi suggéré que les cellules ayant subi une TEM étaient capables de former des tumeurs dans un microenvironnement sénescent. De surcroît, cette évolution dans la capacité tumorale était associée à une dérégulation supplémentaire des microARNs et à l'acquisition des propriétés des cellules souches. Afin d'étudier comment ce potentiel est mis en place au cours de l'instabilité chromosomique et au contact avec le microenvironnement sénescent, nous avons modulé les niveaux d'expression de miR-145 et avons démontré que la répression de miR-145 était nécessaire pour le développement des caractéristiques des cellules souches. Afin de mieux comprendre l'impact de CIN sur le programme génétique des cellules épithéliales, nous avons utilisé des approches de haut débit et avons caractérisé les changements des paysages chromatiniens et leur mise en place dans les cellules ayant traversé une période de CIN. Nos résultats révèlent pour la première fois que l'instabilité télomérique modifie profondément la distribution des marques d'histones en conduisant aux changements d'expression des gènes et au processus de transformation des cellules épithéliales pré-tumorales. / Telomere shortening is a major source of chromosome instability (CIN) at early stages during carcinogenesis. However, the mechanisms through which telomere-driven CIN (T-CIN) contributes to the acquisition of tumor phenotypes remain uncharacterized. We have shown that human epithelial kidney (HEK) cells undergo massive microRNA deregulation upon CIN, in particular a miR-200-dependent epithelial-mesenchymal transition (EMT), which is thought to enable epithelial cancer cells to migrate and invade other tissues to form metastases. Our work also indicated that CIN+ cells that underwent EMT were able to form tumors in a senescent microenvironment. Notably, this progression in tumor capacity was associated with further microRNA deregulation and the manifestation of enhanced stem-like properties. To investigate how stem-like properties are acquired in CIN+ cells in the contact with senescent microenvironment we adapted knockdown and overexpression approaches to modulate miR-145 expression, and demonstrated that enhanced stem-like properties depended on miR-145 repression. To fully apprehend the impact of CIN on the genetic program of epithelial cells, we used an unbiased approach to characterize the chromatin state of HEK CIN+ cells and uncover genome wide redistributions that were in direct correlation with gene expression changes. Our results reveal for the first time that T-CIN profoundly modifies the chromatin landscape genome-wide thereby fueling the transformation process of pre-tumor epithelial cells.

Les translocations chromosomiques et les autres types de réarrangements peuvent, bien qu'associées à un phénotype normal, mener à la transmission d'un contenu génétique déséquilibré à la descendance. Il n'est pas possible de distinguer les chromosomes équilibrés des déséquilibrés, ce qui empêche toute sélection dans le cadre d'une fécondation in vitro (FIV). Nous avons ainsi mené une série de projets de recherche dont le but a été de mettre en évidence des caractéristiques spécifiques de ces spermatozoïdes déséquilibrés, afin de pouvoir les distinguer au cours d'une FIV. Nous avons montré que les spermatozoïdes déséquilibrés présentaient des taux de fragmentation de l'ADN plus élevés, étaient moins denses, et avaient un volume nucléaire supérieur. Ces constatations ont mené au développement d'une procédure de sélection des spermatozoïdes équilibrés chez les porteurs de réarrangements chromosomiques. En utilisant le hypo-osmotic swelling test (HOST), nous avons montré qu'une morphologie flagellaire spécifique était associée à un contenu chromosomique équilibré. Nous proposons d'utiliser cette procédure de sélection dans le cadre d'une ICSI, afin d'améliorer le pronostic reproductif chez les couples concernés. Nous proposons également d'évaluer la proportion de spermatozoïdes déséquilibrés chez chaque patient porteur de réarrangement chromosomique. En effet, bien que ce taux varie d'un patient à l'autre, il est stable dans le temps pour un patient donné. Il est de plus un élément déterminant dans le choix d'une des options de prise en charge : reproduction naturelle, insémination artificielle avec test de migration survie (TMS), ICSI avec sélection par HOST, et diagnostic préimplantatoire (DPI). / Chromosomal translocations and other balanced rearrangements, although usually associated with a normal phenotype, can lead to the transmission of an abnormal unbalanced genetic content to the offspring. Balanced and unbalanced spermatozoa are indistinguishable, making it impossible to select them prior to in vitro fertilization. We conducted a series of research projects aimed at evidencing specific characterics for unbalanced spermatozoa, in a way to ultimately distinguish them from balanced ones during in vitro fertilization. We showed that unbalanced spermatozoa had higher DNA fragmentation rates, were less dense, and that their nuclear volume was higher. This led to developing a selection procedure for balanced spermatozoa in rearrangement carriers. Using the hypo-osmotic swelling test (HOST), we showed that a specific flagellar morphology was associated with balanced chromosomal status. We suggest using this procedure prior to ICSI in order to improve the reproductive prognosis in those patients. We also suggest evaluating the proportion of unbalanced spermatozoa in every patient with a chromosomal rearrangement. Although this proportion varies among patients, it is stable over time for a given patient. We believe this is a decisive element in choosing between the different available options : natural conception, artificial insemination with discontinuous gradient centrifugation, ICSI with HOST-based selection, and pre-implantation genetic diagnosis (PGD).

L'instabilité chromosomique, marque des cellules tumorales, peut trouver sa source dans un défaut d'initiation de la réplication. Ceci a été illustré chez la levure Saccharomyces cerevisiae et concorde avec l'observation de mutations de régulateurs de la transition G1/S dans un grand nombre de tumeurs. Toutefois, les mécanismes par lesquels cette instabilité survient n'ont pas encore été clairement définis. Pour résoudre cette question, nous avons utilisé le mutant de levure cdc6-1 où la formation des complexes pré-réplicatifs est graduellement affectée avec l'augmentation de la température. Nous avons mis en évidence que l'allongement de la durée de la réplication qui en suit induit des cassures de l'ADN (DSB) seulement à l'entrée en mitose. Par combinaisons de mutants, nous avons vu que la condensation des chromosomes est en partie responsable de ces DSB. Ces DSB sont signalées à la cellule via la protéine Rad9, protéine adaptatrice du checkpoint de dommages à l'ADN. De façon concordante, nous avons observé une activation de la protéine effectrice de ce checkpoint Rad53 à l'entrée en mitose. La viabilité des cellules cdc6-1 repose sur les protéines de checkpoint Chk1 et Rad53 ainsi que sur la présence de cohésines et des topoisomérases Top2 et Top3. Selon nous, la réplication prolongée par diminution du nombre d'origines n'est pas détectée par les cellules comme un stress réplicatif. Lors de l'entrée en mitose, la condensation des chromosomes transformerait les fourches de réplication en structures reconnues et clivées par les nucléases Mus81-Mms4 et Yen1, qui sont activées en mitose, dirigeant ces régions sous-répliquées vers la réparation par recombinaison. Ce sont les coupures induites en mitose, non la progression des fourches, qui activent le checkpoint. Nous proposons que la sous-réplication de segments d'ADN consécutive à un défaut de licensing des origines favorise la recombinaison non homologue et génère l'instabilité chromosomique, à l'image des sites fragiles communs qui sont le siège de remaniements récurrents lors de la cancérogenèse. / Chromosome instability (CIN), a hallmark of cancer cells, can take its roots in the G1 phase of the cell cycle, when replication origins are licensed. This has been illustrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae and is consistent with the fact that a vast number of tumors presents mutations in G1/S transition regulators. However the mechanisms by which this instability occurs are still not well established. Using the yeast cdc6-1 mutant in which preRC formation can be decreased gradually with temperature, we show that cells replicating from fewer origins undergo massive DNA double-strand break (DSB) formation in mitosis. Blocking mitotic entry by Swe1 overexpression or Clb1-4 depletion, and inactivation of Cdc5 (Polo) both suppress DSB formation in cdc6-1 cells, demonstrating that DSBs do not stem from collapsed forks but are actively induced during mitosis. DSB formation is dependent on chromosome condensation and the Mus81-Yen1 structure-specific endonucleases. These DSBs then trigger the Rad9 DNA damage checkpoint. Accordingly, Rad53 phosphorylation is detected only after entry into mitosis. We propose that cells replicating their DNA from fewer origins enter mitosis undetected, then condense their chromosomes and cleave unreplicated regions by Mus81-Yen1 for repair by recombination. The viability of cdc6-1 cells at semi-permissive temperature relies on Chk1 and Rad53, as well as on cohesins and topoisomerases Top2 and Top3. Cleavage of under replicated DNA segments in mitosis may favor non-homologous repair pathways leading to chromosome rearrangements, as seen for common fragile sites that co-localize with recurrent breakpoints in cancer.

La difficulté et la nécessité d'étudier l'organisation dynamique du génome ont poussé ces dernières années les expérimentateurs et les théoriciens à collaborer au développement de modèles théoriques de l'architecture chromosomique. Notre travail s’inscrit dans cet effort. En collaboration avec David Holcman et Assaf Amitaï (ENS Paris), nous avons développé une nouvelle méthode d'analyse de la mobilité de sites chromosomiques marqués avec des protéines fluorescentes. Notre analyse a permis de comparer la mobilité des différents sites du génome afin de comprendre comment l’organisation du noyau influe sur la mobilité de la chromatine, puis dans un second temps nos résultats ont permis d’établir un lien entre les mécanismes de réparation de l’ADN et la mobilité. Il a déjà été prouvé récemment (K. Bloom, 2013) que la mobilité des chromosomes est limitée par leur ancrage au SPB via leur centromère, mais l’étude de l'impact de l’ancrage télomérique sur la mobilité des chromosomes méritait d’être approfondi. Contrairement à ce qui est communément admis, nos résultats ont montré que les télomères ne sont pas fortement ancrés à la membrane nucléaire, de plus il existe une grande variabilité de leur mobilité cellule à cellule. Dans la plupart des cellules, l'interaction télomérique avec la membrane nucléaire est en effet suffisamment forte pour modifier la localisation des locus sub-télomériques mais trop faible pour impacter sa mobilité. Nos résultats ont également montré que les loci sub-télomériques ont une mobilité supérieure à celle des locus situés au milieu du bras chromosomique. Dans les cellules mutantes, la perte de l'intégrité du chromosome lors de l'induction d'une CDB entraîne l'apparition d’extrémités libres sur la chromatine. De manière similaire aux locus sub-télomériques, les extrémités libres des CDB présentent une mobilité plus élevée que les CDB du chromosome dont l'intégrité est préservée, ceci qui pouvant s'expliquer par un degré de liberté de mouvement supérieur des extrémités de la chromatine. Les cassures double-brin de l’ADN sont parmi les lésions les plus toxiques. La non- réparation ou une mauvaise réparation de ces cassures conduit à la mort cellulaire ou à des réarrangements chromosomiques qui sont à l’origine du développement de cancers chez l’homme. Lorsque que la cassure de l’ADN se produit la molécule d’ADN porteuse de l’information génétique est rompue sur les deux brins mais les deux extrémités de la cassure sont maintenues ensemble ce qui préserve l’intégrité du chromosome. En effet l’observation des extrémités de la cassure par microscopie grâce à des tags fluorescents situés de chaque côté de la cassure montre que celles-ci sont maintenues à proximité l’une de l’autre. Il existe donc un ou plusieurs mécanismes permettant à la cellule de préserver l’intégrité du chromosome. Des travaux précédents ont identifié le complexe MRX comme étant l’un des acteurs essentiels de ce mécanisme. Nos travaux ont permis d’identifier une seconde voie, complémentaire de MRX permettant d’assurer le maintien de l’intégrité chromosomique. Nous avons aussi pu observer que nos observations statiques concernant la proportion de cellules présentant des extrémités séparées était en réalité à l’échelle de la cellule le résultat d'un processus dynamique, les extrémités des chromosomes pouvant au cours du temps plusieurs fois se retrouver puis se séparer à nouveau. Afin de mieux comprendre les mécanismes de cohésion entre extrémités, nous avons pensé qu'il était essentiel de comprendre l'impact du recrutement des cohésines sur l'organisation 3D de la chromatine autour de la cassure. En effet, le recrutement de cohésines sur des dizaines de kilobases autour de la rupture est susceptible de générer l'assemblage d'une grande structure capable de modifier l'organisation 3D du chromosome à grande échelle. / The difficulty and the need to study the dynamic organization of the genome have pushed in recent years, experimenters and theorists to collaborate in the development of theoretical models of chromosomal architecture. Our work is a part of this effort. In collaboration with David Holcman and Assaf Amitaï (ENS Paris), we developped a new method of data analysis for the study of chromosomal sites tagged with fluorescent proteins. This new method allows us to extract from miscroscopy analysis a parameter named Kc characterizing constraints that restrict the mobility of the chromosomal locus. This new analysis was used to compare the mobility of different sites in the genome in order to understand how organization of the nucleus impacts chromatin mobility with the final aim of understanding the impact of this mobility on the regulation of DNA repair mechanisms. It was already proven recently (K. Bloom, 2013) that mobility of chromosomes is constrained by their anchoring to SPB by their centromeres, but little was known about the impact of telomeric sequences to nuclear membrane on chromosome mobility. Contrary to what is commonly accepted, our results showed that telomeres are not strongly anchored to the nuclear membrane. Within a cell population, it exists a high variability in telomere mobility, indeed most of the cells the telomeric interaction with the nuclear membrane is indeed strong enough to change the location of sub-telomeric loci but too weak to impact its mobility. Our results also showed that sub-telomeric loci have a higher mobility than loci located in the middle of the same chromosome arm. In mutant cells the loss of chromosom integrity upon the induction of a double-strand break leads to the apparition chromatin free extremities. Similarly to sub-telomerics loci, DSBs free extremities exhibit a higher mobility than DSBs in chromosome with a preserved integrity. In summary our study has shown that free ends of a chromatin fiber have a higher mobility than other monomers in the chain. This higher mobility is due to the higher level of freedom that chromatin extremities have. When DNA double strand break (DSB) is generated, the chromosome ends should become physically totally dissociated from one to another, making ensuing repair difficult. To overcome this dramatic event, the DNA damage response (DDR) takes in charge the implementation of a protein bridge that holds the two chromosome ends together and so preserve its integrity. In S. cerevisiae the MRX complex was already known for playing critical functions in early DSB extremities tethering. Several studies showed that a single DSB induces the formation of a ≈100 kb cohesin domain around the lesion. Our study suggests the late role played by cohesins in the emergence of an intra-chromosomal cohesive structure capable to maintain chromosomal integrity. The way of DSB extremities cohesion is established, is consistent with what is published on the recruitment of cohesins at DSBs. Our study also highlight the dynamical behavior of DSB extremities at the cell scale. Indeed once DSB extremities are separated, they alternate during several hours between a tethered and a separated state. We also analysed the impact of cohesins recruitment at DSBs at the chromosome scale. Our results establish a positive correlation between the level of cohesins loaded on the chromosome and the level of folding of the chromatin fiber. The analysis of the chronology of events leading to the preservation of chromosomal integrity upon DSB suggests that chromatin has an intrinsic property (not related to DNA damage response) preserving its integrity despite the apparition of DSBs. This property could potentially be due to short-range inter-nucleosomal interactions or to the presence of secondary structures formed by cohesines in the interphase genome. All these hypothesis should be further tested experimentally.

Les translocations chromosomiques sont des événements cellulaires rares signatures de nombreux cancers, pouvant mener à l’expression de nouveaux gènes de fusion oncogènes ou à la dérégulation d’un oncogène existant. Cependant, le lien direct entre la formation de translocations et la tumorigenèse n’est pas toujours bien établi. Jusqu’à présent, la modélisation de translocations se limitait principalement à la surexpression du gène de fusion créé. Pour mieux comprendre leur contribution à l’oncogenèse, nous avons développé une nouvelle méthode pour induire des translocations oncogéniques de novo, afin de recréer plus fidèlement les premières étapes de la transformation cellulaire.Pour cela, nous nous appuyons sur la technologie des nucléases artificielles telles que les nucléases à doigt de zinc, les TALEN (TALE Nucleases) et le système CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) pour générer des cassures ciblées de l’ADN et induire la formation de remaniements chromosomiques. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur l’induction de la translocation modèle t(2;5)(p23;q32) et du gène de fusion NPM-ALK, associés au Lymphome Anaplasique à Grandes Cellules (ALCL), dans divers modèles cellulaires. Nous avons ainsi mis en évidence des propriétés oncogéniques du gène de fusion NPM-ALK exprimé sous son promoteur endogène suite à la formation du réarrangement chromosomique. Cependant, l’induction de la translocation dans des lymphocytes T primaires suggère que cet événement ne suffit pas à lui seul à initier l’oncogenèse, et nécessite probablement un contexte génétique ou épigénétique favorable. / Chromosomal translocations are signatures of numerous cancers and lead to expression of fusion genes that act as oncogenes. However, the wealth of genomic aberrations found in cancer makes it challenging to assign a specific phenotypic change to a specific aberration. We set out to use genome editing with Zinc Finger Nucleases (ZFN), Tale Effector Nucleases (TALEN), and the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) to induce de novo specific chromosomal translocations in human cells, thus generating new models to interrogate the contribution of tumor-related translocations in first steps of oncogenesis. We specially focused on Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) t(2;5) translocation and NPM-ALK consequent fusion gene. For the first time, we highlighted oncogenic properties for NPM-ALK fusion expressed under endogenous promoter. However, translocation induction in primary T cells suggests that t(2;5) is not sufficient to initiate ALCL oncogenesis, and likely requires favourable genetic or epigenetic or context.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

TRF1 est une protéine télomérique essentielle pour la stabilité et la régulation de la longueur des télomères. Son expression est altérée dans de nombreux cancers humains, et son inhibition, dans un contexte p53 déficient, favorise le développement de tumeurs chez la souris. Nous montrons ici que l'inhibition de TRF1 dans les fibroblastes primaires humains conduit à une accumulation télomérique de γ-H2AX et à une activation de la voie de réponse aux dommages de l'ADN dépendante des kinases ATR/Chk1, menant rapidement les cellules vers la sénescence. En revanche, lorsque les voies p53 et pRb sont défaillantes, les cellules échappent à la sénescence. L'érosion accrue des télomères engendre alors une fragilité télomérique et une instabilité chromosomique, caractérisées par la présence de fusions entres chromatides soeurs et de signaux multi-télomériques (MTS). Un niveau élevé de MTS, associés à la présence de télomères courts, est également retrouvé après la surexpression de TRF1. Cette fragilité télomérique conduit à une extension de la capacité proliférative des cellules, due à une stabilisation de la longueur des télomères par réactivation de la télomérase. Nous proposons que la fragilité des télomères, induit par l'altération de la charge télomérique de TRF1, conduit à une instabilité chromosomique qui facilite la réactivation de la télomérase et à des anomalies chromosomiques comparables à celles retrouvées dans les tumeurs. La dérégulation de l'expression de TRF1 joueraient un rôle dans la progression tumorale des cellules p53 et pRb déficientes. / TRF1 is a telomere-binding protein which is essential for both telomere stability and telomere length regulation. TRF1 depletion in the context of p53 deficiency promotes tumor development in the mouse, and TRF1 expression is altered in some human cancers. We report here that inhibition of TRF1 in human primary fibroblast results in rapid induction of senescence, which is concomitant with telomeric accumulation of γ-H2AX and phosphorylation of the ATR downstream checkpoint kinase Chk1. Abrogation of p53 and pRb pathways bypasses senescence but leads to accelerated telomere shortening and early onset of chromosomal instability, including sister chromatid fusions and the occurrence of multi-telomeric signals (MTS) related to telomere fragility. MTS are also elevated in TRF1-overexpressing cells and are coincident with the presence of short telomeres. Elevated telomere fragility was associated with greater immortalization potential and resultant cells maintained their telomeres via telomerase reactivation. We propose that changes in TRF1 occupancy at telomeres lead to telomere-fragility driven chromosome instability, which facilitates the reactivation of telomerase and engenders cancer-relevant chromosomal aberrations. These events would occur at early stages of the tumor progression process in the context of an impaired p53 and pRb response.

Grâce aux progrès expérimentaux permettant d'étudier deux phénotypes qui sont d'un intérêt majeur dans la compréhension des capacités d'adaptation d'A. gambiae s.s. à son environnement. Les différences de résistance à la dessiccation mises en évidence entre les différents caryotypes liés à l'inversion chromosomique 2La et entre les formes moléculaires M et S offrent des pistes intéressantes pour l'identification de facteurs génétiques impliqués dans la divergence écologique au sein de ce complexe d'espèces. / Thanks to progress in sequencing, the genomes of many organisms are known and available. Thus, functional genomics, the elucidation of gene function in sequenced genome, is currently booming. However, there is a gap between our growing knowledge in genetic and the current sparse information on phentoypic data ( "phenotype gap"). All organisms whose genome has been sequenced are facing this problem, including Anopheles gambiae.Anopheles gambiae sensu lato is a complex of sibling species, indistinguishable from a morphological point of view, present on almost the entire African continent. A. gambiae demonstrates an extreme environmental ubiquity and the characterization of phenotypes associated with adaptation to varying environments as well as the identification of genes involved in this adaptation is one of the main research axes in the post-genome area of this major malaria vector.We have studied some phenotypes associated with aridity and temperature in the nominal species of the A. gambiae complex. These two parameters are discriminent in the distribution of molecular forms and chromosomal inversions that characterize this species and may be involved in ecological divergence and speciation. We first measured desiccation resistance of adult mosquitoes of A. gambiae s.s. and we then studied the preferred temperatures of larvae in a choice device set-up (the shuttlebox). We compared the thermoregulation behavior and thermal preferences of a laboratory strain with field larvae of A. gambiae s.s. We also presented preliminary data on the preferred temperatures measured in field larvae of the S and M molecular forms.From a technical point of view, we improved an existing device for testing the survival of mosquitoes in highly desiccated conditions by coupling it with a video surveillance system, which help to increase the accuracy in determining the survival time, to avoid disturbing the system during the experiment and allow to test relatively large numbers of individuals. This study revealed a significant association between the 2La chromosomal inversion and resistance to desiccation in A. gambiae and highlighted the role of body size in the survival of this mosquito in dry environments.We also adapted a new device to study experimentally the thermopreference of A. gambiae s.s. larvae. The results showed that laboratory larvae and field M molecular form larvae had similar thermal preferences, consistent with the values of temperature usually found in natural breeding sites. In addition, the S molecular form larvae from southern Cameroon had preferences similar to those of northern Cameroon, regardless of karyotypes related to chromosomal inversions. In addition, the comparison of data for the M and S molecular forms larvae revealed that there was no significant difference in thermal preferences or in thermoregulatory behavior.Our results have contributed to the development of two experimental devices to study two phenotypes that are of major interest in understanding the adaptation of A. gambiae s.s. to its environment. The differences in desiccation resistance between the different karyotypes associated with the 2La chromosomal inversion and between the M and S molecular forms offer interesting new possibilities for the identification of genetic factors involved in their ecological divergence.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles. / Chromatin organization is of functional significance to control the gene expression program. However, its interplay with DNA replication program is less known. Though the capture of chromosomal interactions and cell imaging, we studied the links between the high-order folding of chromatin and the replication timing. This analysis, which has been performed in human lymphoblastoid cells, in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and in a myeloid leukemia cell line with erythroid properties, allowed the identification of structural domains in the nucleus. These domains are quite isolated from each other and their boundaries coincide with early-initiation zones. In addition, our study shows that these early-initiation zones preferentially interact with each other. These interactions have been observed between neighboring early-initiation zones (genomic separation around 1 to few megabases) but also along the whole chromosome. The late-replicated loci interact with their counterparts as well, leading to a nuclear segregation of the loci according to their replication timing. These results are sustained by distance measurements in in-situ hybridizations which show that loci replicated at the beginning of S-phase are closer than expected. Our work also reveals that chromatin organization is similar in cells blocked in G0 phase (quiescent PBMC), demonstrating that it does not result from the cells in S-phase. Taken together, these results provide direct clues for a robust chromatin organization, common to cycling and resting cells, and related to the replication timing at different scales.

Le gène ALK code pour un récepteur à activité tyrosine kinase exprimé principalement dans le système nerveux central et périphérique au cours du développement chez le mammifère. Ces informations font suspecter un rôle développemental du récepteur ALK bien que ses fonctions précises ne sont pas connues. De la même manière, ses ligands et les voies de signalisation qui lui sont associés demeurent mal caractérisés. En 2008, des mutations ponctuelles du gène ALK ont été identifiées dans des formes sporadiques et familiales de neuroblastome. Deux hotspots de mutation sont situés dans le domaine tyrosine kinase. Ces travaux de thèse ont permis d’étudier l’implication du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome sous des aspects cellulaires, génomiques et fonctionnels. L’étude de la régulation de l’activation et de l’adressage de la protéine ALK a révélé qu’à la différence des récepteurs sauvages, l’activation constitutive conduit à une rétention intracellulaire associée à une maturation incomplète des récepteurs mutés. Par ailleurs, la caractérisation complète du locus ALK dans le neuroblastome a mis en évidence une fréquence élevée de réarrangements chromosomiques. Ce travail a notamment identifié un réarrangement chromosomique conduisant à l’expression d’un variant du récepteur ALK tronqué pour une partie du domaine extracellulaire. Ce variant, associé à l’agressivité tumorale, est activé de façon constitutive et présente des propriétés oncogéniques. Enfin, l’analyse de souris knock-in exprimant les mutations AlkF1178L et AlkR1279Q a révélé un rôle majeur du gène Alk dans le développement du système nerveux sympathique. En effet, ces souris présentent une hyperplasie des ganglions sympathiques mise en place chez l’embryon et associée à une augmentation de la prolifération cellulaire à la naissance. Ce travail a aussi mis en évidence la coopération oncogénique in vivo entre les mutations du gène Alk et la surexpression du gène MYCN dans le neuroblastome. Les tumeurs générées chez les souris partageant ces deux altérations se développent après une courte période de latence et avec une pénétrance complète. L’analyse des tumeurs a mis en évidence des propriétés conférées aux tumeurs par les mutations du gène Alk. En effet, ces tumeurs expriment des marqueurs cholinergiques et montrent des signes de différenciation. Ces animaux permettent de mieux comprendre le rôle du gène ALK dans l’oncogenèse du neuroblastome et constituent de bons modèles d’étude préclinique des neuroblastomes dépendants de ALK. / The ALK protein is a receptor tyrosine kinase mainly expressed in the central and peripheral nervous system during the development in mammals. These informations suggest that the ALK receptor might have a developmental role even though its functions remain unknown. Ligands and signaling pathways associated to this receptor are also poorly characterized. In 2008, point mutations of the ALK gene have been identified in sporadic and familial cases of neuroblastoma with two main hotspots of mutation in the kinase domain. This thesis project allowed to study the involvement of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis under cellular, genomic and functional aspects.The study of ALK protein activation and subcellular localization revealed that the constitutive activation of the kinase domain lead to an intracellular retention and to a lack of glycosylation. The genomic characterization of the ALK locus pointed out the high frequency of chromosomal rearrangements in neuroblastoma cell lines. This work notably identified the expression of a chromosomal rearrangement leading to a truncated protein variant of ALK lacking a part of the extracellular domain. This variant, associated with the tumoral aggressiveness, is constitutively activated and harbor oncogenic properties. Finally, the analysis of the knock-in mice expressing the two AlkF1178L and AlkR1279Q mutations demonstrated that the ALK gene has a key role in the regulation of the developing sympathetic nervous system. Indeed, these mice have an hyperplasia of sympathetic ganglia set up during embryogenesis and associated with an increased neuroblast proliferation at birth. This work also described the oncogenic cooperation between ALK mutations and MYCN overexpression in neuroblastoma. Tumors, generated in mice sharing those two alterations, arise with a full penetrance and a short latency. Histological and transcriptomic analysis of tumors identified specific properties provided by ALK mutations. Indeed, these tumors express cholinergic markers and harbor signs of differentiation. Those animals allow to better understand the role of the ALK gene in neuroblastoma oncogenesis and constitute good preclinical models for ALK dependant neuroblastoma.