A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

Submitted by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:34:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T13:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_CinéticaEnzimaAlfa-Galactosidase.pdf: 2284274 bytes, checksum: 84e0046c6ef967080654f5dc29d5c13b (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima / Human alpha-galactosidase A (α-Gal A) is a lysosomal enzyme which is deficient in Fabry disease. Fabry disease is a sphingolipidosis which chronic kidney failure (CKF) is the most important cause of morbidity and mortality. The aim of this study was the establishment of a laboratorial protocol that allows the diagnosis of Fabry’s disease in plasma and leukocytes, the analysis of α-Gal A kinetic features in plasma and searching for potential Fabry patients in 25 individual with unknown CKF. Reproducibility and fluorescence stability of the enzymatic method were also evaluated. The assay standardization was realized with the fluorescent substrate 4- methylumbeliferil-α-D-galactopyranoside. Reproducibility was evaluated using plasma samples stored at a 4ºC, -20ºC and -70ºC, the assay was performed once a month until 6 months and fluorescence stability was evaluated until 24 hours after the end of the assay. The standardization allowed the establishment of value references to α-Gal A in Pará State, from 4 to 28 nmoles/h/mL (plasma) and 20 to 96 nmoles/h/mg protein (leukocytes). α-Gal A enzyme was thermolabile and 1 minute of preincubation at 60ºC was sufficient to decrease 71.09% of its entire activity. The activity of the α-Gal A enzyme increased progressively according to incubation time, between 15 and 180 minutes. Its activity was better at pH 4,8, the Km value for the α-Gal A enzyme was 1.007 mM, and maximum reaction velocity was 30.9 nmoles/h/mL. The best storage temperature for plasma samples was -20ºC that showed less variation until 6 months. The enzyme method is stable and even after 24 hours, at room temperature, the fluorescence remained the same. All CKF patients with unknown cause presented α-Gal A activity between normal values, therefore neither was diagnosed with Fabry disease. Understanding the kinetics of the α-Gal A enzyme and its in vitro behavior will contribute to improvements in the laboratory diagnosis of Fabry disease, and provide a diagnostic baseline for the analysis of individuals affected by mutations in this enzyme.

Orientador: Álvaro Takeo Omori / Disseração (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Quimica, 2012.

Orientador: Álvaro Takeo Omori. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2012.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T15:07:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T15:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), é considerada uma das principais pragas da sojicultura, causando enormes prejuízos devido ao seu ataque. As proteases digestivas desempenham papel importante na fisiologia das larvas e o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. Para a utilização dessa estratégia de controle é necessário conhecer a estrutura dessas enzimas, além de entender as interações químicas com esses inibidores. O uso de programas computacionais são ferramentas úteis para contornarem os problemas relacionados às técnicas de elucidação estrutural e avaliam in silico as principais interações entre as enzimas e os ligantes. Após esse processo a caracterização cinética do complexo enzimático contribuem para a melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar a modelagem molecular por homologia das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis, avaliar as possíveis interações com peptídeos sintéticos utilizando estudos de docking e propôr um modelo de inibição enzimática das serino-proteases utilizando os peptídeos. As sequências obtidas foram utilizadas na modelagem molecular com o programa I-TASSER. Os três melhores modelos estruturais foram validados através dos parâmetros de C-score e B-factor profile. A análise do C-scoreEC classificou as enzimas como serino-proteases. No estudo de docking, dos sete ligantes testados, somente Gor K, Gor R e Gor 5 apresentaram valores de energia livre de ligação para a formação de complexos estáveis. As principais interações observadas foram em regiões do centro ativo e sítio secundário das enzimas. Para a caracterização cinética utilizando diferentes substratos peptídicos as enzimas foram purificadas por cromotagrafia de afinidade utilizando coluna de p-aminobenzamidina agarose em sistema FPLC. Pelas análises dos parâmetros cinéticos foi possível constatar que as serino-proteases intestinais tripsina- like de Anticarsia gemmatalis têm preferência na hidrólise de substratos contendo arginina na posição P1. Nos estudos de cinética de inibição utilizando os peptídeos sintéticos Gor 3, Gor 4 e Gor 5 em presença do substrato cromogênico L-BApNA observou-se que a inibição é do tipo competitiva linear nas concentrações utilizadas. A melhor Ki foi observada para o peptídeo Gor 5 que apresentou uma inibição mais eficiente em comparação aos peptídeos Gor 3 e Gor 4. No geral, a eficiência na inibição da atividade enzimática está relacionada à capacidade de ligação ao centro ativo da enzima. / The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), is considered the main pest of soybean culture, causing huge losses due to its attack. Digestive proteases play an important role in the physiology of the larvae and the study of protease inhibitors as pest control agents has received continuous attention. The use of this control strategy requires knowledge of the structure of these enzymes, besides understanding the chemical interactions with those inhibitors. Computer programs are useful tools to overcome problems related to structural elucidation techniques and also evaluate in silico the main interactions between enzymes and ligands. After this process the kinetic characterization of the enzyme complex contribute to a better understanding of the active centers of the enzyme and mechanisms of action. In this context, this study aimed to perform homology modeling of intestinal serine proteases A. gemmatalis, to evaluate possible interactions with synthetic peptides utilizing docking studies and to propose one enzyme inhibition model of serine proteases using peptides. The sequences obtained were used in molecular modeling with I-TASSER program. The top three structural models were validated through the C-score parameters and B-factor profile. Analysis of C-scoreEC ranked enzymes like serine proteases. In the docking study of the seven tested ligands, only Gor K, Gor R and Gor 5 showed binding free energy values for the formation of stable complexes. The main interactions were observed in regions of the active site and secondary site of the enzyme. For kinetic characterization using different peptides substrates the crude extract were purified by affinity cromotagraphy using p-aminobenzamidine agarose column FPLC system. From the analysis of the kinetic parameters was noted that the trypsin-like serine proteases from Anticarsia gemmatalis prefer hydrolyse substrates containing arginine at position P1. In inhibition kinetic studies using synthetic peptides Gor 3, Gor 4 and Gor 5 in the presence of chromogenic substrate L-BApNA was observed that the inhibition is linear competitive in the concentration range used. The best Ki was observed for Gor 5 peptide that showed more efficient inhibition compared to peptides Gor 3 and Gor 4. Overall, the efficient inhibition of enzyme activity is related to the binding capacity to the active center of the enzyme.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-14T09:48:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2368608 bytes, checksum: b94f4a77c169f94c63678cc44ab336aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T09:48:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2368608 bytes, checksum: b94f4a77c169f94c63678cc44ab336aa (MD5) Previous issue date: 2012-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Com o intuito de melhor compreender os mecanismos pela qual a peroxidase (POD) está envolvida no bloqueio xilemático em hastes de ave-do-paraíso e como estes podem ser reduzidos ou inibidos, este trabalho teve como objetivos: purificar e caracterizar a POD; verificar o efeito da utilização de inibidores enzimáticos combinados ou não com pHs ácidos e a presença do corte periódico da base da haste sobre a vida pós-colheita dessas flores, avaliar o efeito da aplicação de substratos fenólicos na longevidade das flores e estudar as características inerentes à própria haste, que podem estar influenciando a longevidade das flores de ave-do-paraíso. Para a purificação da POD foi utilizada uma amostra composta de bases de várias hastes mantidas por 8 dias na água. Durante a extração, foi utilizado um processo de separação da POD solúvel da de parede, e o extrato bruto obtido foi purificado por meio da precipitação com sulfato de amônia e por cromatografia gélica. O extrato purificado foi utilizado para a caracterização enzimática. A atividade total no extrato bruto, a massa molecular estimada e o pH ótimo foram semelhantes para as duas isoenzimas. O processo de purificação só foi eficiente para a POD solúvel, e a POD de parede mostrou-se mais sensível aos aumentos de temperatura e apresentou maior afinidade com os substratos. Entre os inibidores enzimáticos testados, o mais eficiente foi o β-mercaptoetanol. No experimento de vaso, as hastes foram colhidas com um florete aberto e distribuídos entre os tratamentos que continham os inibidores metabissulfito de sódio ou azida sódica, combinados com pH 6,0 ou 2,5, aplicados na forma de pulsing por 24 h. Metade das hastes sofreram o corte da base, e a outra metade não. Para as hastes que não sofreram o corte da base, o melhor tratamento foi azida sózica, pH 6,0, que proporcionou maiores valores de massa fresca relativa e retardou o desenvolvimento do balanço hídrico negativo. Já o mesmo inibidor com o pH 2,5 causou toxidez, e por isso foi considerado o pior tratamento. O metabissulfito foi eficiente em retardar o escurecimento da base e reduziu a atividade da polifenoloxidase (PPO). Apesar destes resultados, a longevidade não apresentou diferenças estatísticas entre os tratamentos aplicados. Em outro experimento de vaso, substâncias fenólicas (catecol, 4-metilcatecol, pirogalol, pirocatequina e guaiacol, 10 mM) foram aplicadas como pulsing por 24 h e em experimento subsequente, o guaiacol foi aplicado como pulsing ou solução de vaso em concentrações de 5, 25 e 50 mM. A massa fresca relativa das hastes tratadas com essas substâncias fenólicas foram superiores as das hastes controles nos dois experimentos e o balanço hídrico negativo foi retardado. No entanto, essas hastes apresentaram escurecimento intenso da base, e a longevidade não foi prolongada. No último experimento, as hastes colhidas com um florete aberto foram separadas em 3 grupos de acordo com o diâmetro da base: I – finas (até 10 mm de diâmetro), II – médias (diâmetro maior que 10 e menor que 12 mm) e III – grossas (diâmetro maior que 12 mm). A presença do corte da base a cada 48 h também foi avaliado. Foram avaliadas as relações hídricas, o conteúdo de carboidratos, abertura de florete, tamanho de florete, longevidade, escurecimento da base e atividade da POD. A taxa da absorção de água só foi influenciada pela presença do corte da base, sendo maior para as hastes grossas que sofreram o corte da base, apresentando estas maiores valores de massa fresca relativa. Essas hastes também apresentaram maior abertura de floretes e longevidade. As taxas de transpiração não foram influenciadas pelo diâmetro da haste, nem pela presença do corte da base. O conteúdo de carboidrato variou com o diâmetro da haste, parte da planta avaliada (haste, bráctea ou florete), tempo e presença do corte. O escurecimento foi semelhante entre os 3 grupos e a atividade da POD foi maior nas hastes grossas. O tamanho da bráctea e da sépala aumentou proporcionalmente com o aumento no diâmetro da base. Conclui-se que a POD está mesmo envolvida no processo de obstrução xilemática em hastes de ave- do-paraíso, desempenhando um papel fundamental neste processo que culmina com o murchamento precoce dos floretes. No entanto, outros fatores, como diâmetro da haste e o conteúdo de reserva presente nessas podem estar influenciando a longevidade das flores. / In order to better understand the mechanisms by which the peroxidase (POD) is involved in xylem blockage in stems of bird of paradise and how these xylem blockage can be reduced or inhibited, this work aimed to purify and characterize POD; verify the effect of enzyme inhibitors combined or not with acid pH and the periodical cut of the base of the stem on the postharvest life of these flowers, evaluate the effect of phenolic substrates in the longevity of the flowers and study the characteristics inherent to the stem, which may be influencing the bird of paradise flowers longevity. To purify POD was used a sample of several bases maintained for 8 days in water. For the extraction, a procedure to separate the soluble POD from the cell wall POD was used, and the crude extract obtained was purified by precipitation with ammonium sulfate and by gel chromatography. The extract purified was used for enzymatic characterization. The total activity in the crude extract, the estimated molecular weight and pH optima were similar for both isoenzymes. The purification process was only effective for soluble POD. The cell wall POD was more sensitive to increases in temperature and had a higher affinity for the substrates. β- mercaptoethanol was the most efficient, among the enzyme inhibitors tested. In the vase experiment, stems were collected with an open floret and distributed among the treatments containing inhibitors sodium metabisulfite or sodium azide, combined with pH 6.0 or 2.5, applied as pulsing for 24 h. Half of the stems had undergone the cutting of the base, and the other half didn‟t. For stems that didn‟t have the cut in the base, the best treatment was sodium azide pH6.0, which led to higher values of relative fresh weight and slowed the development of negative water balance. However the same inhibitor at pH 2.5 caused toxicity, and therefore was considered the worst treatment. The metabisulfite was effective in delaying the darkening of the base and reduced polyphenoloxidase (PPO) activity. Despite these results, longevity showed no statistical differences among treatments. In a different vase experiment, phenolic substances (catechol, 4-methylcatechol, pyrogallol, pirocatequina and guaiacol 10 mM) were applied as pulsing for 24 h. and in a subsequent experiment, the guaiacol was applied as a vase solution or pulsing at concentrations of 5, 25 and 50 mM. The stems treated with these phenolic compounds showed higher relative fresh weight than those of control stems of the two experiments and the negative liquid balance was delayed. However, these stems had intense base darkening, and the longevity was not increased. In the last experiment, the stems collected with an open floret were separated into three groups according to the base diameter: I - thin (up to 10 mm diameter), II - medium (diameter greater than 10 and smaller than 12 mm) and III - thick (greater than 12 mm diameter). The base cutting at every 48 h was also evaluated. Were also evaluated the water relations, carbohydrate content, floret opening, floret size, longevity, darkening of the base and POD activity. The rate of water absorption was only changed by the presence of the base cutting, being greater for thick stems that have undergone the base cutting that also showed higher relative fresh weight. These stems also had a greater opening of florets and longevity. Transpiration rates were not influenced by the stem diameter or by the presence of the base cutting. The carbohydrate content changed with the stem diameter, the plant part evaluated (stem, bract or floret), cutting time and cutting presence. Darkening was similar among the three groups and POD activity was higher in thick stems. The size of the bract and sepal increases with the increase in base diameter. In conclusion, POD is really involved in xylem blockage of bird of paradise stems, playing a key role in this process that culminates in early wilting of the florets. However, other factors such as stem diameter and reserves content may be influencing the flowers longevity. / Tese antiga

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T12:48:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T12:48:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) Previous issue date: 2005-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diversas pesquisas têm demonstrado o potencial de α-galactosidases para o processamento de produtos alimentícios à base de leguminosas. A soja, uma fonte concentrada de isoflavonas, tem sido utilizada na prevenção e tratamento de câncer e osteoporose. Além disso, o leite de soja é considerado um substituto de baixo custo para o leite de vaca, como suplemento nutritivo para crianças intolerantes à lactose. Em contrapartida, leguminosas contêm muitos fatores antinutricionais, sendo um deles os oligossacarídeos de rafinose (RO), que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. As mucosas intestinais de humanos e de animais monogástricos não possuem a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise de ligações α-1,6 nos RO. Portanto, a eliminação dos RO dos produtos de soja contribui para melhorar o seu valor nutritivo. Esses galacto- oligossacarídeos são extremamente termoestáveis e, práticas tradicionais como embebição, cozimento e germinação são incapazes de eliminá-los completamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a hidrólise de RO presente no extrato desengordurado de soja e nos produtos de soja, melaços leve e pesado utilizando α-galactosidases extra e intracelulares purificadas de Debaryomyces hansenii, além da enzima extracelular imobilizada. Debaryomyces hansenii foi cultivada em meio mineral com extrato de levedura (MME), contendo galactose como fonte de carbono, por 36 h a 30 o C. Após este período, o meio de cultura foi centrifugado, o sobrenadante foi utilizado como fonte da enzima extracelular e as células como fonte da enzima intracelular. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de filtração em gel Sephadex G- 150 e posteriormente, à cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, pH 5,5. As frações protéicas com atividade de α-galactosidase foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0 a 1 M. As enzimas extra e intracelulares apresentaram fatores de purificação de 16,7 e 289 vezes, respectivamente, com um rendimento de 58 e 45 %, respectivamente. Atividades máximas das α-galactosidases extra e intracelulares foram detectadas em pH 5,0, a 60 e 55 o C, respectivamente. A enzima extracelular manteve 80 % da atividade original após pré-incubação por 3 h a 60 o C, enquanto que, a enzima intracelular manteve 85 % da atividade original por 6 h a 55 o C. Os valores da K M para ρ-NP-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima extracelular foram 0,30, 2,01, 9,66 e 16,0 mM, respectivamente, e para a enzima intracelular foram 0,32, 2,12, 10,8 e 32,8 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando ρ-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose e os polímeros goma de alfarroba e goma guar. As α-galactosidases foram completamente inibidas por sulfato de cobre. A enzima extracelular foi completamente inibida por nitrato de prata, enquanto que, a atividade da enzima intracelular foi reduzida em 70 %. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima extracelular apresentou inibição não-competitiva por galactose (Ki 2,7 mM) e melibiose (Ki 1,2 mM). A enzima intracelular apresentou inibição do tipo acompetitiva por galactose (Ki 0,70 mM) e inibição competitiva por melibiose (Ki 0,98 mM). O N-terminal da α-galactosidase extracelular foi determinado por seqüenciamento automático (YENGLNLVPQMGWN), apresentando similaridade com α-galactosidases de outros microrganismos. A α-galactosidase extracelular foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e apresentou maior estabilidade comparada à enzima livre, mantendo 94 % de sua atividade original por 16 h a 70 o C. Os resultados dos tratamentos do leite de soja a 60 o C com a α- galactosidase extracelular purificada, com as células permeabilizadas contendo a enzima intracelular e com a enzima extracelular imobilizada, por 2, 2 e 4 h, respectivamente, mostraram redução de 100 % de estaquiose. Houve 100 % de redução de rafinose, com a enzima extracelular e com as células permeabilizadas, após 2 e 4 h, respectivamente. O tratamento do leite de soja com a enzima extracelular imobilizada por 10 h, promoveu redução de 63 % de rafinose. Após tratamento com a α-galactosidase extracelular a 60 o C, os produtos melaços leve e pesado, mostraram 100 % de redução de estaquiose após 2 h de incubação e rafinose foi reduzida em 60 e 50 %, respectivamente. Portanto, observa-se que as α-galactosidases de Debaryomyces hansenii foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares. / Several researches have demonstrated the potential of α-galactosidases in the processing of legume derived food. Soybean is a concentrated source of isoflavones, which has been used in prevention and treatment of cancer and osteoporosis. Besides, soy milk is considered a substitute for cow milk, as well as a nutritional suplement for lactose intolerant children. On the other hand, there are many antinutritional features in legume. The raffinose oligosaccharides (RO) are the main responsible for gastric and intestinal diseases related to the ingestion of soy products. The intestinal mucous membrane of men and monogastrics animals does not have the α-galactosidase enzyme, which is essential for hydrolysis of the α-1,6 linkages in the RO. Therefore, the most important factor for improvement of soy nutritional value is to eliminate the RO from soy products. These galacto- oligosaccharides are extremely thermostable and traditional practices like embebition, cooking and germination are unable to eliminate them completely. The present work aims to evaluate the hydrolysis of RO present in the fat free soybean extract and in the soybean molasses, using purified extra and intracellular α- galactosidases from Debaryomyces hansenii and the immobilized extracelular enzyme. The Debaryomyces hansenii was cultivated in mineral medium with yeast extract (MME), which contained galactose as carbon source for 36 h at 30 o C. Following the centrifugation of the culture medium, the supernatant was used as extracellular enzyme source and the cells as intracellular enzyme source. The enzymatic extracts were submitted to the chromatography of gel filtration Sephadex G-150 followed by the ion exchange chromatography DEAE- Sepharose, pH 5.5. The protein fractions with α-galactosidase activity were eluted with NaCl gradient from 0 to 1 M. The extra and intracellular enzymes presented purification factors of 16.7 and 289 times, respectively, with a recovery of 58 and 45 %, respectively. The maximum activities of the extra and intracellular α- galactosidases were detected in pH 5.0 at 60 and 55 o C, respectively. The extracellular enzyme maintained 80 % of its original activity after a pre-incubation for 3 h at 60 o C, while the intracellular enzyme maintained 85 % of its original activity for 6 h at 55 o C. The values of K M for ρ-NP-αGal, melibiose, stachyose and raffinose for the extracellular enzyme were 0.30, 2.01, 9.66 e 16.0 mM, respectively, and for the intracellular enzyme were 0.32, 2.12, 10.8 e 32.8 mM, respectively. The α-galactosidases presented absolute specificity for galactose in α position, hydrolysing ρ-NP-αGal, stachyose, raffinose, melibiose and the polymers locust bean gum and guar gum. The α-galactosidases were completely inhibited by copper sulphate. The extracellular enzyme was completely inhibited by silver nitrate, while the intracellular enzyme activity was reduced in 70 %. In the presence of substrate ρ-NP-αGal the extracellular enzyme presented a non- competitive inhibition by galactose (Ki 2.7 mM) and melibiose (Ki 1.2 mM), the intracellular enzyme showed acompetitive inhibition by galactose (Ki 0.70 mM) and competitive inhibition by melibiose (Ki extracellular α-galactosidase was 0.98 mM). The N-terminal of the determined by automatic sequencing (YENGLNLVPQMGWN), presenting some similarity with α-galactosidases of other organisms. The extracellular α-galactosidase was immobilized in insoluble support (modified silica) and presented greater stability than the free enzyme, maintaining 94 % of its original activity for 16 h at 70 o C. The results of the treatments of soy milk at 60 o C with purified extracellular α-galactosidase, permeable cells containing the intracellular enzyme and immobilized extracellular enzyme, for 2, 2 and 4 h, respectively, showed reduction of 100 % in the amount of stachyose. There was 100 % reduction in the amount of raffinose by the extracellular enzyme and by permeable cells, after 2 and 4 h, respectively. The treatment of the soy milk with the immobilized extracellular enzyme for 10 h promoted reduction of 63 % in raffinose amount. After a treatment with extracellular α-galactosidase the light and heavy molasses products showed 100 % reduction of stachyose after incubation for 2 h at 60 o C, and the raffinose was reduced to 60 and 50 %, respectively. Therefore, it can be observed that α-galactosidases of Debaryomyces hansenii were efficient in reducing the RO presents in soy derived products, and they are appropriate to industrial use in the processing of these sugars. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-10T15:48:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 460318 bytes, checksum: 7e3afed1422c277bb9fda24ca28d8a9e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-10T15:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 460318 bytes, checksum: 7e3afed1422c277bb9fda24ca28d8a9e (MD5) Previous issue date: 2005-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente trabalho foi avaliar experimentalmente o crescimento de diferentes tipos de leveduras cervejeiras (Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces uvarum) em diferentes tipos de mosto (substratos), contendo arroz, milho, sorgo, maltose e cana como adjunto do malte em composição. Objetivou-se, assim, ve rificar se tais composições alteram a cinética de fermentação e a atividade de algumas enzimas durante o processo fermentativo em uma temperatura constante. Acompanhou-se também a presença de alguns metabólitos extracelulares (etanol, acetato e glicerol) e glicose, as características físico-químicas e microbiológicas (pH, atenuação, contagem de células, oBrix e densidade) e a qualidade sensorial das cervejas produzidas nas diferentes condições de substratos e leveduras relatadas anteriormente. Durante o preparo dos substratos foram determinados os teores de extrato dos mostos primários e mostos mistos, a massa dos mostos mistos e o rendimento da mosturação. Os processamentos das cervejas foram realizados pelos processos de duas massas e infusão. O mosto foi inoculado com leveduras de alta e baixa fermentação. A fermentação transcorreu a 12°C, sendo encerrada quando 80% do extrato fermentável foi consumido pelas leveduras. Amostras do caldo fermentativo foram coletadas em 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 e 180 horas, no transcorrer da fermentação. Por centrifugação, as células foram separados e posteriormente lisadas com pérolas de vidro e congeladas até o momento de análise. A quantificação enzimática (álcool desidrogenase, piruvato desidrogenase, isocitrato liase, fosfofrutoquinase, glutamato oxaloacetato transaminase e diacetil redutase) e dos metabólitos (etanol, glicerol e acetato) mais a glicose foram realizadas em testes de colorimetria em aparelho Cobas Fara. Na mosturação, o uso dos adjuntos açucarados (cana e xarope de high maltose) apresentou maior teor de mosto primário, maior teor de mosto misto, maior massa de mosto e maior rendimento, que represente a eficiência da mosturação e a taxa de hidrólise do amido em açúcares.Nas análises físico- químicas, o pH foi significativo para as variáveis individuais e não-significativo nas interações. Existiu diferença entre as leveduras na contagem de células, atenuação e extrato aparente. A formação de glicerol e etanol apresentou tendência de aumento ao longo do processo e a produção de acetato foi variável, com bastante oscilações. Constatou-se que o consumo de glicose inicia-se efetivamente após 60 horas. A atividade da álcool desidrogenase apresentou maiores picos de produção em cultivos com a levedura ale, em relação à levedura lager, o que não influenciou os níveis de etanol para as duas leveduras. As melhores atividades da piruvato desidrogenase no cultivo da levedura ale, foi nos substratos maltose, sorgo e cana e para lager nos substratos cana xarope de high maltose e arroz. Os maiores picos de produção da glutamato oxaloacetato transaminase foram detectados na levedura ale em cultivo em caldo de cana, xarope de high maltose e milho e na levedura lager, nos substratos caldo de cana, arroz e milho. A fosfofrutoquinase teve, para as duas leveduras, maiores atividades em cultivos no susbtratos arroz. As maiores atividades da isocitrato liase para levedura ale foi em cultivo nos substratos caldo de cana e sorgo e para levedura lager nos substratos arroz e xarope de high maltose. A maior atividade da diacetil redutase foi no cultivo em substrato sorgo e na levedura lager, no cultivo em substrato arroz. Os adjuntos açucarados apresentaram extratos superiores aos dos amiláceos. Entre os cereais não houve diferença significativa, o complexo amilolítico da levedura agiu igualmente para os três adjuntos. Todos os adjuntos testados são capazes de produzir meios adequados para produção de cerveja. Não há destaque na produção de etanol entre as leveduras, estando na faixa ideal para produção de cerveja. O glicerol não apresenta grandes variações, sendo ligeiramente superior na levedura ale. O acetato, até o final da fermentação (80% de consumo de açúcares), teve tendência de produzir cervejas mais ácidas, mas com possibilidade de diminuição caso a fermentação evoluísse até o final. Os substratos com diferentes constituições químicas influenciaram o comportamento enzimático nas duas leveduras. A atividade da álcool desidrogenase foi baixa, mas não influenciou a produção de etanol. A piruvato desidrogenase apresentou maiores atividades na levedura de alta fermentação, o que caracteriza uma possível maior disponibilidade de intermediário do ciclo de Krebs. Apesar de baixa, houve diferença nas atividades da isocitrato liase entre as duas leveduras, em substratos diferentes, o que deixa claro que maiores atividades em alguns substratos caracteriza a presença de metabólitos oriundos do desvio do ciclo do glioxalato, que pode, em certas situações, determinar uma via glicolítica mais fraca. A atividade da glutamato oxaloacetato transaminase está fortemente relacionada nesses testes com a formação de precursores (aminoácidos) de substâncias essenciais ao sabor da cerveja, em que a atividade apresenta-se mais baixa nas amostras de menor aceitação, com uso de escala hedônica. A atividade da fosfofrutoquinase apresentou-se baixa nas duas leveduras. Essa atividade baixa não influenciou a produção de substâncias como glicerol e etanol, porém picos de produção nos substratos testados indicam atividade glicolítica mais elevada, com potencial de produção de metabólitos- chaves que poderão ser usados em outras vias. A diacetil redutase, apesar de apresentar baixas atividades para as duas leveduras nos substratos, mostra maior potencialidade de redução do diacetil nos substratos sorgo e arroz. / The objective of this work was to experimentally eval uate the growth of different types of brewery yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum) in different types of worts (substrates) containing rice, corn, sorghum, maltose, and sugarcane as malt adjuncts in compositions to verify whether such compositions alter fermentation kinetics and the activity of some enzymes during the fermentative process at a constant temperature. The presence of some extra cellular metabolites (ethanol, acetate and glycerol) and glucose, physical- chemical and microbiological characteristics (pH, attenuation, cell count, oBrix and density) as well as the sensorial quality of the beer produced under the different substrate and yeast conditions previously reported, were also monitored. The contents of primary worts and mixed worts, mixed wort mass, and mosturation yield were determined during substrate preparation. Beer processing was carried out by applying the mass and infusion processes. The wort was inoculated with high and low fermentation yeasts. Fermentation occurred at a 12°C, ending when 80% of the fermentable extract was consumed by the yeasts. Samples of the fermentative juice were collected at 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 and 180 hours, throughout fermentation. The cells were separated by centrifugation, and later ruptured with glass pearls and frozen until analysis. Enzymatic quantification (alcohol dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, isocytrate lyase, phophofrutoquinase, glutamate oxaloacetate transaminase and diacetyl redutase) and metabolites (ethanol, glycerol and acetate) plus glucose were carried out in colorimetric tests in Cobas Fara equipment. In mosturation, the use of sugar adjuncts (sugarcane and high maltose syrup) presented higher primary wort content, higher mixed wort content, higher w mass and higher ort yield, representative of mosturation efficiency and starch hydrolysis rate in sugars. In the physicochemical analyses, pH was significant for the individual variables and non-significant in the interactions. There was a difference betwe en the yeasts in cell count, attenuation, and apparent extract. Glycerol and ethanol formation tended to increase along the process and acetate production was variable, with many oscillations. Glucose intake was confirmed to effectively initiate after 60 hours. Alcohol dehydrogenase activity presented higher production peaks in ale yeast cultivations, in relation to lager yeast, which did not influence the ethanol levels for the two yeasts. The best pyruvate dehydrogenase activities in ale yeast cultivation were found in the substrates maltose, sorghum and sugarcane and for lager yeast in the substrates sugarcane, high maltose syrup and rice. The highest glutamate oxaloacetate transaminase production peaks were detected in ale yeast in sugarcane juice, high maltose syrup and corn and in lager yeast in the substrates sugarcane juice, rice, and corn. Phosphofrutoquinase presented greater activities in rice substrate cultivation for both yeasts. The highest isocytrate lyase activities for ale yeast were in the substrates sugarcane juice and sorghum and for the lager yeast, in the substrates rice and high maltose syrup. The greatest diacetyl reductase activity was in sorghum substrate cultivation juice and in lager yeast, in the rice substrate. The sugar substrates presented superior extracts compared to the amylaceous substrates. No significant difference was found among the grains, with yeast amylolytic complex acting equally for the three adjuncts. All adjuncts tested are capable of producing adequate media for beer production. Ethanol production was not outstanding among the yeasts, being within the ideal range for beer production. Glycerol does not present great variations, being slightly superior in the ale yeast. Until the end of fermentation (80% of sugar consumption), acetate tended to produce more acid beer but with the likelihood of decreased acidity if fermentation evolved until the end. The substrates with different chemical constitutions influenced the enzymatic behavior in both yeasts. Alcohol dehydrogenase activity was low but it did not influence ethanol production. Piruvate dehydrogenase presented greater activities in high fermentation yeast, characterizing a possible availability of Krebs cycle intermediates. Although low, there was a difference in the isocytrate lyase activities between the two yeasts, in different substrates, clearly showing that greater activities in some substrates characterized the presence of metabolites originated from the glyoxalate cycle deviation, which can, in some situations, determine a weaker glycolytic pathway. Glutamate oxaloacetate transaminase activity is strongly related in these tests to the formation of precursors (amino acids) of substances essential to beer flavor, in which the activity is lower in less accepted samples, with the use of the hedonic scale. Phosphofrutoquinase activity was low in the two yeasts. This low activity did not influence the production of substances such as glycerol and ethanol, but production peaks in the substrates tested indicate a hi gher glycolytic activity, with potential to produce key-metabolites that can be used in other pathways. Diacetyl reductase, although presenting low activities for the two yeasts in the substrates, shows greater potentiality of reducing diacetyl in the substrates sorghum and rice. / Não foi localizado o cpf do autor.