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La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

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Cette thèse comporte quatre fichiers vidéo. This thesis comes with four video files. / L'industrie chimique mondiale est en pleine mutation, cherchant des solutions pour rendre la synthèse organique classique plus durable. Une telle solution consiste à passer de la catalyse chimique classique à la biocatalyse. Bien que les avantages des enzymes incluent leur stéréo, régio et chimiosélectivité, cette sélectivité réduit souvent leur promiscuité. Les efforts requis pour adapter la fonction enzymatique aux réactions désirées se sont révélés d'une efficacité modérée, de sorte que des méthodes rapides et rentables sont nécessaires pour générer des biocatalyseurs qui rendront la production chimique plus efficace. Dans l’ère de la bioinformatique et des outils de calcul pour soutenir l'ingénierie des enzymes, le développement rapide de nouvelles fonctions enzymatiques devient une réalité. Cette thèse commence par un examen des développements récents sur les outils de calcul pour l’ingénierie des enzymes. Ceci est suivi par un exemple de l’ingénierie des enzymes purement expérimental ainsi que de l’évolution des protéines. Nous avons exploré l’espace mutationnel d'une enzyme primitive, la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), en utilisant l’ingénierie semi-rationnelle des protéines. La conception rationnelle d’une librarie de mutants, ou «Smart library design», impliquait l’association covalente de monomères de l’homotétramère DHFR R67 en dimères afin d’augmenter la diversité de la librairie d’enzymes mutées. Le criblage par activité enzymatique a révélé un fort biais pour le maintien de la séquence native dans un des protomères tout en tolérant une variation de séquence élevée pour le deuxième. Il est plausible que les protomères natifs procurent l’activité observée, de sorte que nos efforts pour modifier le site actif de la DHFR R67 peuvent n’avoir été que modérément fructueux. Les limites des méthodes expérimentales sont ensuite abordées par le développement d’outils qui facilitent la prédiction des points chauds mutationnels, c’est-à-dire les sites privilégiés à muter afin de moduler la fonction. Le développement de ces techniques est intensif en termes de calcul, car les protéines sont de grandes molécules complexes dans un environnement à base d’eau, l’un des solvants les plus difficiles à modéliser. Nous présentons l’identification rapide des points chauds mutationnels spécifiques au substrat en utilisant l'exemple d’une enzyme cytochrome P450 industriellement pertinente, la CYP102A1. En appliquant la technique de simulation de la dynamique moléculaire par la force de polarisation adaptative, ou «ABF», nous confirmons les points chauds mutationnels connus pour l’hydroxylation des acides gras tout en identifiant de nouveaux points chauds mutationnels. Nous prédisons également la conformation du substrat naturel, l’acide palmitique, dans le site actif et nous appliquons ces connaissances pour effectuer un criblage virtuel d'autres substrats de cette enzyme. Nous effectuons ensuite des simulations de dynamique moléculaire pour traiter l’impact potentiel de la dynamique des protéines sur la catalyse enzymatique, qui est le sujet de discussions animées entre les experts du domaine. Avec la disponibilité accrue de structures cristallines dans la banque de données de protéines (PDB), il devient clair qu’une seule structure de protéine n’est pas suffisante pour élucider la fonction enzymatique. Nous le démontrons en analysant quatre structures cristallines que nous avons obtenues d’une enzyme β-lactamase, parmi lesquelles un réarrangement important des résidus clés du site actif est observable. Nous avons réalisé de longues simulations de dynamique moléculaire pour générer un ensemble de structures suggérant que les structures cristallines ne reflètent pas nécessairement la conformation de plus basse énergie. Enfin, nous étudions la nécessité de compléter de manière informatisée un hémisphère où l’expérimental n’est actuellement pas possible, à savoir la prédiction de la migration des gaz dans les enzymes. À titre d'exemple, la réactivité des enzymes cytochrome P450 dépend de la disponibilité des molécules d’oxygène envers l’hème du site actif. Par le biais de simulations de la dynamique moléculaire de type Simulation Implicite du Ligand (ILS), nous dérivons le paysage de l’énergie libre de petites molécules neutres de gaz pour cartographier les canaux potentiels empruntés par les gaz dans les cytochromes P450 : CYP102A1 et CYP102A5. La comparaison pour les gaz CO, N2 et O2 suggère que ces enzymes évoluent vers l’exclusion du CO inhibiteur. De plus, nous prédisons que les canaux empruntés par les gaz sont distincts des canaux empruntés par le substrat connu et que ces canaux peuvent donc être modifiés indépendamment les uns des autres. / The chemical industry worldwide is at a turning point, seeking solutions to make classical organic synthesis more sustainable. One such solution is to shift from classical catalysis to biocatalysis. Although the advantages of enzymes include their stereo-, regio-, and chemoselectivity, their selectivity often reduces versatility. Past efforts to tailor enzymatic function towards desired reactions have met with moderate effectiveness, such that fast and cost-effective methods are in demand to generate biocatalysts that will render the production of fine and bulk chemical production more benign. In the wake of bioinformatics and computational tools to support enzyme engineering, the fast development of new enzyme functions is becoming a reality. This thesis begins with a review of recent developments on computational tools for enzyme engineering. This is followed by an example of purely experimental enzyme engineering and protein evolution. We explored the mutational space of a primitive enzyme, the R67 dihydrofolate reductase (DHFR), using semi-rational protein engineering. ‘Smart library design’ involved fusing monomers of the homotetrameric R67 DHFR into dimers, to increase the diversity in the resulting mutated enzyme libraries. Activity-based screening revealed a strong bias for maintenance of the native sequence in one protomer with tolerance for high sequence variation in the second. It is plausible that the native protomers procure the observed activity, such that our efforts to modify the enzyme active site may have been only moderately fruitful. The limitations of experimental methods are then addressed by developing tools that facilitate computational mutational hotspot prediction. Developing these techniques is computationally intensive, as proteins are large molecular objects and work in aqueous media, one of the most complex solvents to model. We present the rapid, substrate-specific identification of mutational hotspots using the example of the industrially relevant P450 cytochrome CYP102A1. Applying the adaptive biasing force (ABF) molecular dynamics simulation technique, we confirm the known mutational hotspots for fatty acid hydroxylation and identify a new one. We also predict a catalytic binding pose for the natural substrate, palmitic acid, and apply that knowledge to perform virtual screening for further substrates for this enzyme. We then perform molecular dynamics simulations to address the potential impact of protein dynamics on enzyme catalysis, which is the topic of heated discussions among experts in the field. With the availability of more crystal structures in the Protein Data Bank, it is becoming clear that a single protein structure is not sufficient to elucidate enzyme function. We demonstrate this by analyzing four crystal structures we obtained of a β-lactamase enzyme, among which a striking rearrangement of key active site residues was observed. We performed long molecular dynamics simulations to generate a structural ensemble that suggests that crystal structures do not necessarily reflect the conformation of lowest energy. Finally, we address the need to computationally complement an area where experimentation is not currently possible, namely the prediction of gas migration into enzymes. As an example, the reactivity of P450 cytochrome enzymes depends on the availability of molecular oxygen at the active-site heme. Using the Implicit Ligand Sampling (ILS) molecular dynamics simulation technique, we derive the free energy landscape of small neutral gas molecules to map potential gas channels in cytochrome P450 CYP102A1 and CYP102A5. Comparison of CO, N2 and O2 suggests that those enzymes evolved towards exclusion of the inhibiting CO. In addition, we predict that gas channels are distinct from known substrate channels and therefore can be engineered independently from one another.

Les flavan-3-ols et leurs polymères, les proanthocyanidines, appartiennent à une famille de flavonoïdes appelée les tannins condensés. Ces composés polyphénoliques jouent un rôle essentiel dans la qualité phytosanitaire des baies de raisin ainsi que dans les propriétés organoleptiques du vin (flaveur, astringence et couleur). La connaissance des mécanismes qui régissent leur biosynthèse est donc primordiale afin de mieux comprendre la mise en place de la typicité d’un vin. Ce mémoire est consacré à l’étude de l’une des enzymes responsables de la synthèse des flavan-3-ols : la leucoanthocyanidine réductase 1 de Vitis vinifera (VvLAR1). Dans une première partie, nous décrivons les conditions d’expression, de purification et de stabilité de l’enzyme recombinante. L’activité enzymatique est démontrée et la configuration 2R,3S des produits réactionnels caractérisée. La seconde partie de ce manuscrit décrit l’étude structurale de l’enzyme. Des monocristaux d’apoenzyme, de complexes binaires (VvLAR1 / NADPH) et d’un complexe ternaire (VvLAR1 / NADPH / (+)-catéchine) ont été obtenus. Les différentes structures permettent de décrire les modifications structurales associées à la fixation du coenzyme puis du produit. Un mécanisme catalytique basé sur les interactions intermoléculaires observées au sein du complexe ternaire est proposé. La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la recherche de conditions expérimentales permettant la production et la stabilisation de la leucocyanidine en solution, un des substrats naturels de l’enzyme. Les résultats obtenus permettent une première approche de l’étude des propriétés cinétiques de la VvLAR1. / Flavan-3-ols and their polymerisation products, proanthocyanidins, belong to a flavonoid family named condensed tannins. These polyphenolic compounds play a major role in the protection of grape berries to intruders and in the organoleptic properties of wine (flavour, astringency and colour). Knowledge of the mechanisms which govern their biosynthesis is thus essential to better understand wine typical composition. The present thesis is devoted to the investigation of one of the two enzymes which catalyse the flavan-3-ols formation: leucoanthocyanidin reductase 1 from Vitis vinifera (VvLAR1). In the first part of the manuscript, we describe the expression, purification and stability conditions of the recombinant enzyme. The enzyme activity is demonstrated and the reaction product 2R,3S configuration is characterised. The second part of this report describes the structural studies of the enzyme. Monocrystals of the apoenzyme and of binaries (VvLAR1 / NADPH) and a ternary (VvLAR1 / NADPH / (+)-catechin) complexes were obtained. These different structures allow the description of the structural changes associated with the coenzyme and then the substrate binding. A catalytic mechanism, based on the intermolecular interactions within the ternary complex, is proposed. The last part of the work is devoted to the investigation of the experimental conditions leading to the stability of leucocyanidin in solution, one of the natural substrates of the enzyme. The results obtained allow a first study of the VvLAR1 kinetic properties.

L'ingénierie enzymatique est un outil très avantageux dans l'industrie biotechnologique. Elle permet d'adapter les enzymes à une activité ou à une condition de réaction spécifique. En outre, elle peut permettre de déchiffrer les éléments clés qui ont facilité leur modification. Bien que l'ingénierie enzymatique soit largement pratiquée, elle comporte encore plusieurs goulets d'étranglement. Certains de ces goulets d'étranglement sont techniques, comme le développement de méthodologies pour la création de banques de mutations ciblées ou la réalisation de criblages à haut débit, et d'autres sont conceptuels, comme le déchiffrage des caractéristiques clés pertinentes d'une protéine cible pour la réussite d'un projet d'ingénierie. Parmi ces défis, l'épistasie intra-génique, ou la non-additivité des effets phénotypiques des mutations, est une caractéristique qui entrave grandement la prévisibilité. L'amélioration de l'ingénierie enzymatique nécessite une approche multidisciplinaire qui inclut une meilleure compréhension des relations structure-fonction-évolution. Cette thèse vise à contribuer à l'avancement de l'ingénierie enzymatique en étudiant deux systèmes modèles. Premièrement, des variantes dynamiques de la ß-lactamase TEM-1 ont été choisies pour étudier le lien entre la dynamique des protéines et l'évolution. La ß-lactamase TEM-1 a été largement caractérisée dans la littérature, ce qui s'est traduit par des connaissances approfondies sur son mécanisme de réaction, ses caractéristiques structurelles et son évolution. Les variantes de la ß-lactamase TEM-1 utilisées comme système modèle dans cette thèse ont été largement caractérisées, montrant une dynamique accrue à l'échelle temporelle pertinente pour la catalyse (µs à ms) mais maintenant la reconnaissance du substrat. Dans cette thèse, l'évolution in vitro de ces variantes dynamiques a été réalisée par des cycles itératifs de mutagenèse et de sélection aléatoires pour permettre une exploration impartiale du paysage de ‘fitness’. Nous démontrons que la présence de ces mouvements particuliers au début de l'évolution a permis d'accéder à des voies de mutations connues. De plus, des interactions épistatiques connues ont été introduites dans les variantes dynamiques. Leur caractérisation in silico et cinétique a révélé que les mouvements supplémentaires sur l'échelle de temps de la catalyse ont permis d'accéder à des conformations conduisant à une fonction améliorée, comme dans le TEM-1 natif. Dans l'ensemble, nous démontrons que l'évolution de la b-lactamase TEM-1 vers une nouvelle fonction est compatible avec divers mouvements à l'échelle de temps µs à ms. Il reste à savoir si cela peut se traduire par d'autres enzymes ayant un potentiel biotechnologique. Deuxièmement, la lipase Cal-A, pertinente sur le plan industriel, a été choisie pour identifier les caractéristiques qui pourraient faciliter son ingénierie. La lipase Cal-A présente des caractéristiques telles que la polyvalence du substrat et une grande stabilité thermique et réactivité qui la rendent attrayante pour la modification des triglycérides ou la synthèse de molécules pertinentes dans les industries alimentaire et pharmaceutique. Contrairement à TEM-1, la plupart des études d'évolution in vitro de la lipase Cal-A ont été réalisées dans un but industriel, avec une exploration limitée de l'espace de mutation. Par conséquent, les caractéristiques qui définissent la fonction de la lipase Cal-A restent insaisissables. Dans cette thèse, nous faisons état de la mutagenèse ciblée de la lipase Cal-A, confirmant l'existence d'une région clé pour la reconnaissance du substrat. Cela a été fait en combinant une nouvelle méthodologie de création de bibliothèque basée sur l'assemblage Golden-gate avec une visualisation structurelle basée sur des scripts pour identifier et cartographier les mutations sélectionnées dans la structure 3D. La caractérisation et la déconvolution de deux des plus aptes ont révélé l'existence d'une épistasie dans l'évolution de la lipase Cal-A vers une nouvelle fonction. Dans l'ensemble, nous démontrons que l’identification d'une variété de propriétés suite à la mutagenèse ciblée peut grandement améliorer la connaissance d'une enzyme. Cette information peut être appliquée pour améliorer l'efficacité de l'ingénierie dirigée. / Enzyme engineering is a tool with great utility in the biotechnological industry. It allows to tailor enzymes to a specific activity or reaction condition. In addition, it can allow to decipher key elements that facilitated their modification. While enzyme engineering is extensively practised, it still entails several bottlenecks. Some of these bottlenecks are technical such as the development of methodologies for creating targeted mutational libraries or performing high-throughput screening and some are conceptual such as deciphering the key relevant features in a target protein for a successful engineering project. Among these challenges, intragenic epistasis, or the non-additivity of the phenotypic effects of mutations, is a feature that greatly hinders predictability. Improving enzyme engineering needs a multidisciplinary approach that includes gaining a better understanding of structure-function-evolution relations. This thesis seeks to contribute in the advancement of enzyme engineering by investigating two model systems. First, dynamic variants of TEM-1 ß-lactamase were chosen to investigate the link between protein dynamics and evolution. TEM-1 ß-lactamase has been extensively characterized in the literature, which has translated into extensive knowledge on its reaction mechanism, structural features and evolution. The variants of TEM-1 ß-lactamase used as model system in this thesis had been extensively characterized, showing increased dynamics at the timescale relevant to catalysis (µs to ms) but maintaining substrate recognition. In this thesis, in vitro evolution of these dynamic variants was done by iterative rounds of random mutagenesis and selection to allow an unbiased exploration of the fitness landscape. We demonstrate that the presence of these particular motions at the outset of evolution allowed access to known mutational pathways. In addition, known epistatic interactions were introduced in the dynamic variants. Their in silico and kinetic characterization revealed that the additional motions on the timescale of catalysis allowed access to conformations leading to enhanced function, as in native TEM-1. Overall, we demonstrate that the evolution of TEM-1 b-lactamase toward new function is compatible with diverse motions at the µs to ms timescale. Whether this can be translated to other enzymes with biotechnological potential remains to be explored. Secondly, the industrially relevant Cal-A lipase was chosen to identify features that could facilitate its engineering. Cal-A lipase presents characteristics such as substrate versatility and high thermal stability and reactivity that make it attractive for modification of triglycerides or synthesis of relevant molecules in the food and pharmaceutical industries. Contrary to TEM-1, most in vitro evolution studies of Cal-A lipase have been done towards an industrially-specified goal, with limited exploration of mutational space. As a result, features that define function in Cal-A lipase remain elusive. In this thesis, we report on focused mutagenesis of Cal-A lipase, confirming the existence of a key region for substrate recognition. This was done by combining a novel library creation methodology based on Golden-gate assembly with script-based structural visualization to identify and map the selected mutations into the 3D structure. The characterization and deconvolution of two of the fittest revealed the existence of epistasis in the evolution of Cal-A lipase towards new function. Overall, we demonstrate that mapping a variety of properties following mutagenesis targeted to specific regions can greatly improve knowledge of an enzyme that can be applied to improve the efficiency of directed engineering.