Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-15T13:55:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2791905 bytes, checksum: 2d2f70d34d0c7441ea3eddfe80eafd1b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-15T13:55:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2791905 bytes, checksum: 2d2f70d34d0c7441ea3eddfe80eafd1b (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína do capsídeo do circovirus suíno 2 (PCV2), codificada pela ORF2, é uma proteína estrutural, sendo altamente imunogênica. Anti-soro produzido a partir dessa proteína recombinante purificada, em coelhos, poderá apresentar as mesmas propriedades daquele produzido a partir de partículas virais purificadas e ser de relevância como ferramenta diagnóstica. O objeto do presente estudo foi padronizar uma técnica de imunoistoquímica, a partir da produção de um soro hiperimune anti-PCV2 em coelhos, utilizando como antígeno a proteína recombinante purificada do capsídeo do PCV2 (Cap PCV2). A proteína foi expressada em Escherichia coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade. Inoculações desta proteína foram realizadas em coelhos e os soros foram colhidos para avaliações por Western blotting, ELISA, imunocitoquímica e imunoistoquímica. Obteve-se sucesso na purificação da proteína recombinante e na produção do soro hiperimune em coelhos. A afinidade de ligação do anticorpo produzido ao antígeno (proteína recombinante) foi demonstrada pela técnica de Western blotting e ELISA e foi considerada eficiente e sensível. As técnicas de imunocitoquímica e imunoistoquímica apresentaram resultados considerados satisfatórios. O anticorpo produzido contra a proteína codificada pela ORF2 mostrou ter boa afinidade de ligação, podendo ser empregado como ferramenta diagnóstica. / The porcine circovirus 2 (PCV2) capsid protein, encoded by ORF2, is a structural protein and highly immunogenic. An antiserum produced from the purified recombinant protein in rabbits, may present the same properties as that produced from purified viral particles and may be of relevance as a diagnostic tool. The aim of this study was the immunohistochemistry technique standardartization from the production of an anti-PCV2 hyperimmune serum in rabbits using as antigen the purified recombinant protein from the capsidal of PCV2 (Cap PCV2). The protein was expressed in BL21 Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Inoculations of this protein were performed in rabbits and the sera were collected for evaluation by Western blotting, ELISA, immunocytochemistry and immunohistochemistry. The recombinant protein purification and hyperimmune serum production in rabbits was achieved successfully. The antibody-binding affinity to the antigen (recombinant protein) was demonstrated by Western blotting and ELISA techniques and were considered efficient and sensitive. The immunocytochemistry and immunohistochemistry techniques results were considered satisfactory. The antibody produced against the protein encoded by ORF2 showed can be used as a diagnostic tool.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T14:03:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 298725 bytes, checksum: 7bee1975846b19c9ac200de64bd75213 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T14:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 298725 bytes, checksum: 7bee1975846b19c9ac200de64bd75213 (MD5) Previous issue date: 2003-04-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O circovírus suíno (PCV) é um agente amplamente distribuído na Europa, América do Norte e sul da Ásia. O PCV é um pequeno vírus de cadeia simples de DNA (17 nm) que foi reconhecido, a partir da década de 90, como um patógeno de suíno. Dois tipos de PCV tem sido caracterizados e designados PCV tipo 1 (PCV1) e PCV tipo 2 (PCV2). O PCV1 foi primeiramente isolado em 1974 como um contaminante persistente da linhagem de células PK-15 de rim de suíno (ATCC CCL 31) e a cepa de PCV isolada de células PK-15 tem sido bem caracterizada. O PCV1 é considerado como um vírus não patogênico, enquanto que a infecção de um suíno pelo PCV2 é normalmente associada ao desenvolvimento de Síndrome Multissistêmica Pós-Desmame (PMWS), em animais de 5 a 12 semanas de idade, e ao tremor congênito (CT), que acomete animais no período neonatal. A PMWS é uma nova doença emergente de suínos, caracterizada clinicamente por dispnéia progressiva, aumento dos nódulos linfáticos e patologicamente caracterizada por uma ampla extensão de lesões inflamatórias. Recentemente, pesquisadores da EMBRAPA iniciaram um estudo da PMWS em leitões, mas no Brasil a presença do PCV ainda não é reconhecida oficialmente. O objetivo desse trabalho foi (1) padronizar técnicas de diagnóstico para o genoma e antígeno do PCV, assim como anticorpos contra o agente; (2) avaliar a susceptibilidade de diferentes linhagens celulares ao PCV; (3) diagnosticar a infecção do PCV em suínos da Zona da Mata de Minas Gerais; (4) isolar o PCV de amostras positivas. O PCV, proveniente de tecidos de animais normais e com diagnóstico de CT, foi isolado em células SK6 e analisadas por PCR. O padrão de bandas foi o mesmo encontrado em células PK15 contaminadas com PCV2, gentilmente cedidas pela EMBRAPA. Os oligos usados diferenciavam o PCV1 do PCV2. Todos os leitões de maternidade testados por PCR foram positivos para o PCV2. Porém, em 59 animais de abate testados por PCR não foi observada a presença do PCV. No teste de susceptibilidade as células PK15, SK6, VERO e MDCK foram susceptíveis ao PCV, mas somente as PK-15 estavam persistentemente infectadas. No ensaio de imunofluorescência indireta, foi utilizado um conjugado anti-IgG suína previamente padronizado e anticorpos contra PCV foram identificados em soros de 24 em 44 animais de abate testados e nenhum anticorpo foi encontrado nos animais com diagnóstico de CT positivos para PCV2 por PCR. Com esses resultados podemos concluir que os 24 suínos de abate soropositivos entraram em contato com o agente e desenvolveram a infecção em alguma fase durante o estagio de produção. A ausência de soropositivos entre os leitões recém nascidos, aliada a presença de infecção, pode ser explicada pela incapacidade de produção de anticorpos por esses animais neste estágio de desenvolvimento. Estudos adicionais da epidemiologia e da imunologia de infecções pelo PCV são necessários para o melhor entendimento e efetivo controle das doenças associadas a esse vírus. / Porcine circovirus (PCV) is thoroughly an agent distributed in Europe, North America and south of Asia. PCV is a small virus of simple chain of DNA (17 nm) that was recognized, starting from the decade of 90, as a swine pathogen. Two types of PCV have been characterized and designated PCV type 1 (PCV1) and PCV type 2 (PCV2). PCV1 was isolated firstly in 1974 as a persistent contaminant of the lineage of cells PK-15 of swine kidney (ATCC CCL 31) and the stump of isolated PCV of cells PK-15 has been well characterized. PCV1 is considered as a non- pathogenic virus, while the infection of a swine for PCV2 is usually associated to Post weaning Multisistemic Wasting Syndrome (PMWS), in animals from 5 to 12 weeks of age, and to the congenital tremor (CT), that attack animals in the neonatal period. PMWS is a new emergent disease of swine, clinically characterized by progressive dispnea, increase of the lymphatic nodules and pathologically characterized by a wide extension of inflammatory lesions. Recently, researchers of EMBRAPA began a study of PMWS in pigs, but in Brazil the presence of PCV is not still recognized officially. The objective of that work was (1) to standardize diagnosis techniques for the genome and antigen of PCV, as well as antibodies against the agent; (2) to evaluate the susceptibility of different cellular lineages to PCV; (3) to diagnose the infection of PCV in swine of the Zona da Mata of Minas Gerais; (4) to isolate PCV of positive samples. PCV, originating from tissues of normal animals and with diagnosis of CT, it was isolated in SK6 cells and analyzed by PCR. The pattern of bands was the same found in contaminated cells PK15 with PCV2, kindly by EMBRAPA. The used oligos differentiated PCV1 of PCV2. All the pigs of maternity tested by PCR were positive for PCV2. However, in 59 slaughtering animals tested by PCR, PCV was not found. In susceptibility test, PK15, SK6, VERO and MDCK cells were susceptible for both PCV but only PK15 cells were persistently infected. Anti-PCV antibodies were found to be positive in 54,5% of slaughtering animals serum and any anti-PCV antibody was found in animals with clinical CT. Rapid and accurate diagnosis and removal of disease animals from farms, combined with good husbandry practices, would appear to be the only current method of controlling losses attributable to PCV2 infections. However, additional studies into the epidemiology and immunology of PCV infections are now required if better understanding and eventual control of the disease syndromes associated with these viruses are to be achieved. / Dissertação importada do Alexandria.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:17:34Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Nayara Evaristo Pontes.pdf: 1260344 bytes, checksum: 91a47c546488e8c96e02bf7cbc6d3631 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Nayara Evaristo Pontes.pdf: 1260344 bytes, checksum: 91a47c546488e8c96e02bf7cbc6d3631 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq; CAPES / O Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um vírus sem envelope e contém um DNA fita simples circular com 1,7 kb de tamanho. O vírus pertence ao gênero Circovírus da família Circoviridae. O PCV2 é o agente etiológico da Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (PMWS), doença que causa grande impacto econômico na suinocultura mundial. O objetivo deste trabalho foi desenvolver a técnica de STNPCR para detecção do Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) bem como avaliar a presença de diferentes variantes virais em Pernambuco. Foram utilizados controles positivos, negativos, e 55 amostras de tecidos de animais clinicamente normais obtidas em abatedouro. Para o desenvolvimento da STNPCR foram avaliadas diferentes temperaturas de anelamento para os primers externos e internos. A atuação de ambos os pares de primers foi realizada de forma independente, sendo que o segundo par de primers foi imobilizado na parte interna da tampa do microtubo e após a primeira etapa de amplificação os primers foram eluídos por inversão do microtubo. Além disso, foi realizada a análise de achado técnico buscando encontrar os genótipos do PCV2 já descritos no Brasil e mundialmente, os subtipos PCV2a e PCV2b. Na aplicação clínica, a STNPCR foi comparada com a NPCR e resultaram em reações positivas para o PCV2 em 100% (55/55) das amostras analisadas, revelando igual sensibilidade e especificidade, porém, com menor risco de contaminação cruzada. Na análise de achado técnico (sequências da ORF2 do PCV2), foi possível identificar os genótipos PCV2a e PCV2b. A técnica molecular STNPCR demonstrou ser eficaz para detecção do DNA viral e pode ser aplicada em estudos epidemiológicos para o PCV2 e auxiliar no diagnóstico laboratorial da PMWS.

O Circovírus suíno tipo 2 (PCV-2) pertence ao gênero Circovirus da família Circoviridae. É considerado “vírus emergente", tendo sido associado, principalmente, à Síndrome de Refugagem Multissistêmica dos suínos (SRM). O genoma circular é composto por: (i) ORF-1 que codifica a proteína replicativa; (ii) ORF-2 que codifica a proteína estrutural formadora do capsídeo, (iii) região não codificadora que intercala as ORF-1 e 2 e contem a origem da replicação, denominada IGS-1 e (iv) região que intercala as ORF-1 e 2, denominada IGS-2. Oito amostras, denominadas amostras completas, tiveram mais de 1705 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 699 da ORF-2, 20 da IGS-1 e 39 da IGS-2); duas amostras tiveram em média 1692 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2); uma amostra teve 1392 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 414 da ORF-2, 9 da IGS-1 e 24 da IGS-2) e nove amostras tiveram em média 970 nucleotídeos seqüenciados (196 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2). Portanto, a partir dessas 20 amostras em estudo, foram obtidas: (i) oito amostras completas; (ii) 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 19 seqüências completas de ORF-2, as quais foram analisadas. A identidade de nucleotídeo variou de: (i) 99,7% a 100% entre as oito amostras completas; (ii) 99,3% a 100% entre as 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 91,9% a 100% entre as 19 seqüências completas de ORF-2. A topologia das árvores genealógicas utilizando as oito seqüências completas e as 11 seqüências completas de ORF-1 foi similar, agrupando todas as amostras em estudo em um só grupo denominado subtipo PCV-2a. Pela análise da genealogia da ORF-1 observou-se que todas as amostras agruparam-se com uma amostra de PCV-2 associada à Síndrome de Dermatite e Nefropatia suína (PDNS), formando um grupo separado das amostras de PCV-2 associadas à Síndrome de Refugagem Multissistêmicas dos suínos (SRM) e abortamento. A genealogia proposta para as 19 amostras que tiveram a ORF-2 seqüenciada, dividiu as amostras em dois grupos, sendo que 14 amostras agruparam-se num grupo denominado subtipo PCV-2a e 5 no subtipo PCV-2b. Os resultados mostraram a circulação de, pelo menos, dois subtipos de PCV-2 no Brasil / Porcine circovirus 2 belongs to Circovirus genus and Circoviridae family. It is considered an “emerging virus" being associated to Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS). The circular viral genome is formed by: (i) ORF-1 coding for the replicative associated proteins; (ii) ORF-2 encoding the structural proteins of the viral capsid; (iii) a non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 containing the replicative origin of the viral genome (IGS-1) and (iv) a second non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 (IGS-2). Eight samples, named complete sequences, had about 1705 nucleotides determined (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, 20 from IGS-1 and 39 from IGS-2); two samples had about 1692 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2); one sample had 1392 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 414 from ORF-2, 9 from IGS-1 and 24 from IGS-2) and nine samples had about 970 nucleotides sequenced (196 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2). Therefore, from the 20 samples it was obtained: (i) eight complete sequences; (ii) 11 complete sequences of ORF-1 and (iii) 19 complete sequences of ORF-2. The identity at nucleotide level was from: (i) 99,7% to 100% among the eight complete sequences; (ii) 99,3% to 100% among the 11 sequences of ORF-1 and (iii) 91,9 to 100% among the 19 sequences of ORF-2. The topology of the tree generated by the ORF-1 analysis revealed a cluster formed by the Brazilian samples of PCV-2 and the samples associated to PDNS and another cluster formed by the PCV-2 associated to other syndromes. The genealogy presented for the 19 samples using the data from ORF-2 revealed the presence of two clusters, one of them formed by 14 samples named subtype PCV-2a and the other formed by 5 samples, named PCV-2b. The results demonstrated that, at least, two subtypes of PCV-2 circulate in Brazil

O Circovírus suíno tipo 2 (PCV-2) pertence ao gênero Circovirus da família Circoviridae. É considerado “vírus emergente”, tendo sido associado, principalmente, à Síndrome de Refugagem Multissistêmica dos suínos (SRM). O genoma circular é composto por: (i) ORF-1 que codifica a proteína replicativa; (ii) ORF-2 que codifica a proteína estrutural formadora do capsídeo, (iii) região não codificadora que intercala as ORF-1 e 2 e contem a origem da replicação, denominada IGS-1 e (iv) região que intercala as ORF-1 e 2, denominada IGS-2. Oito amostras, denominadas amostras completas, tiveram mais de 1705 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 699 da ORF-2, 20 da IGS-1 e 39 da IGS-2); duas amostras tiveram em média 1692 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2); uma amostra teve 1392 nucleotídeos seqüenciados (945 da ORF-1, 414 da ORF-2, 9 da IGS-1 e 24 da IGS-2) e nove amostras tiveram em média 970 nucleotídeos seqüenciados (196 da ORF-1 e 699 da ORF-2, os restantes correspondem às regiões IGS-1 e 2). Portanto, a partir dessas 20 amostras em estudo, foram obtidas: (i) oito amostras completas; (ii) 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 19 seqüências completas de ORF-2, as quais foram analisadas. A identidade de nucleotídeo variou de: (i) 99,7% a 100% entre as oito amostras completas; (ii) 99,3% a 100% entre as 11 seqüências completas de ORF-1 e (iii) 91,9% a 100% entre as 19 seqüências completas de ORF-2. A topologia das árvores genealógicas utilizando as oito seqüências completas e as 11 seqüências completas de ORF-1 foi similar, agrupando todas as amostras em estudo em um só grupo denominado subtipo PCV-2a. Pela análise da genealogia da ORF-1 observou-se que todas as amostras agruparam-se com uma amostra de PCV-2 associada à Síndrome de Dermatite e Nefropatia suína (PDNS), formando um grupo separado das amostras de PCV-2 associadas à Síndrome de Refugagem Multissistêmicas dos suínos (SRM) e abortamento. A genealogia proposta para as 19 amostras que tiveram a ORF-2 seqüenciada, dividiu as amostras em dois grupos, sendo que 14 amostras agruparam-se num grupo denominado subtipo PCV-2a e 5 no subtipo PCV-2b. Os resultados mostraram a circulação de, pelo menos, dois subtipos de PCV-2 no Brasil / Porcine circovirus 2 belongs to Circovirus genus and Circoviridae family. It is considered an “emerging virus” being associated to Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS). The circular viral genome is formed by: (i) ORF-1 coding for the replicative associated proteins; (ii) ORF-2 encoding the structural proteins of the viral capsid; (iii) a non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 containing the replicative origin of the viral genome (IGS-1) and (iv) a second non-coding intergenic sequence between ORF-1 and ORF-2 (IGS-2). Eight samples, named complete sequences, had about 1705 nucleotides determined (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, 20 from IGS-1 and 39 from IGS-2); two samples had about 1692 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2); one sample had 1392 nucleotides sequenced (945 from ORF-1, 414 from ORF-2, 9 from IGS-1 and 24 from IGS-2) and nine samples had about 970 nucleotides sequenced (196 from ORF-1, 699 from ORF-2, and the rest from IGS-1 and 2). Therefore, from the 20 samples it was obtained: (i) eight complete sequences; (ii) 11 complete sequences of ORF-1 and (iii) 19 complete sequences of ORF-2. The identity at nucleotide level was from: (i) 99,7% to 100% among the eight complete sequences; (ii) 99,3% to 100% among the 11 sequences of ORF-1 and (iii) 91,9 to 100% among the 19 sequences of ORF-2. The topology of the tree generated by the ORF-1 analysis revealed a cluster formed by the Brazilian samples of PCV-2 and the samples associated to PDNS and another cluster formed by the PCV-2 associated to other syndromes. The genealogy presented for the 19 samples using the data from ORF-2 revealed the presence of two clusters, one of them formed by 14 samples named subtype PCV-2a and the other formed by 5 samples, named PCV-2b. The results demonstrated that, at least, two subtypes of PCV-2 circulate in Brazil

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-05Bitstream added on 2014-06-13T19:45:15Z : No. of bitstreams: 1 cruz_tf_dr_botfmvz.pdf: 667109 bytes, checksum: b54ec5fc8ecf8d9aaadfe47b8708a295 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A quantificação de anticorpos é muito importante para monitoramento sorológico em granjas e associação com proteção contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Dessa forma este trabalho teve como objetivo padronizar e aplicar ELISA indireto com anticorpo de captura e utilizá-lo na quantificação de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos. Na padronização, os soros teste e os imunoreagentes básicos, incluindo, anticorpo de coelho anti-PCV2 purificado utilizado como captura e suspensão viral tiveram suas concentrações de uso ótimas determinadas. Aplicou-se o índice ELISA (IE) nos resultados dos soros de suínos para correção de variações entre testes. O teste mostrou-se específico do ponto de vista analítico e com alta reprodutibilidade podendo adequadamente ser utilizado na quantificação de anticorpos em soros de suínos contra o PCV2. Na aplicação, um total de 138 amostras de soros foi testado sendo cinco de porcas na gestação e 133 de leitões nascidos dessas porcas, acompanhados nas fases de maternidade ao crescimento em uma granja comercial com SMDS. Na avaliação da resposta de anticorpos contra o vírus, houve uma diminuição dos anticorpos da maternidade para a creche, coincidindo com o declínio dos anticorpos de origem materna e com a ocorrência da soroconversão simultaneamente com a detecção de PCV no sangue total pela PCR quantitativa. Em dois leitões com alta carga relativa de DNA viral e sinais clínicos sugestivos de SMDS, a quantidade de anticorpos detectada foi extremamente baixa / Antibody quantification is important for serological monitoring in swine herds and association with protection against porcine circovirus type 2 (PCV2). The aim of this work was to standardize and apply indirect trapping ELISA and use it in the quantification of antibodies against PCV2 in sera from pigs. The immunoreagents, including rabbit antibody anti-purified PCV2 used as trapping antibody and viral suspension had their optimum use dilution previously determined. The absorbance index (ELISA Index, EI), was used to determine the antibody concentration in pig serum directed against PCV2. The test showed high analytical specificity and reproducibility. A total of 138 serum samples was tested including five sows in gestation and 133 piglets accompanied by phases from lactation to growth in a commercial swine herd where PCV2 was previously detected. In anti PCV2 antibody response it was observed a decreasing in the phases of lactation to nursery due to decline of maternal antibodies. The seroconversion was concurrent with PCV DNA detection by quantitative PCR in total blood. In two piglets with high relative DNA viral load and compatible clinical signs of PMWS, the anti PCV2 antibody concentration was very low

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:56:04Z : No. of bitstreams: 1 cruz_tf_me_botfmvz.pdf: 332026 bytes, checksum: b36d32d75d346e3063434cff130d4fa5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Vários estudos têm demonstrado a associação entre a maior concentração viral do circovírus suíno tipo 2 (PCV2) detectado por PCR quantitativa com o desenvolvimento de lesões microscópicas típicas da Síndrome da circovirose suína (SCS). Clinicamente, a SCS é caracterizada principalmente pelo emagrecimento progressivo, acompanhado de dispnéia, aumento de tamanho dos linfonodos, palidez e/ou icterícia das mucosas. A diminuição na taxa de crescimento dos leitões acometidos com a síndrome provoca grave prejuízo econômico para o produtor, o que torna a SCS uma das doenças mais importantes para a suinocultura. Assim, com o objetivo de comparar a concentração viral relativa do circovírus suíno (PCV) com o ganho de peso de leitões provenientes de uma granja comercial com SCS, amostras de sangue total, soro e swab nasal foram analisadas por PCR em tempo real com SYBR® Green I e PCR para o circovírus suíno tipo 1 (PCV1), sendo posteriormente, comparadas entre si para determinação de qual amostra seria mais apropriada para a utilização na PCR em tempo real com SYBR® Green I. Foram colhidas 128 amostras de sangue total, 128 de soro e 128 de swab nasal, as quais foram obtidas de 32 leitões acompanhados na maternidade, creche, recria e crescimento. Através da comparação das concentrações virais relativas do PCV entre as amostras, o sangue total mostrou-se mais apropriado para a PCR em tempo real, seguido do soro. Os swabs nasais não foram considerados apropriados para detecção do PCV pela técnica aplicada, pois o PCV detectado pode representar o vírus sendo eliminado nas secreções nasais e/ou uma contaminação do ambiente. Todas as amostras (n = 107) positivas para PCV por PCR em tempo real foram testadas para PCV1 e resultaram negativas. / Several studies have shown the association among the largest viral concentration of Porcine circovirus type 2 (PCV2) detected by quantitative PCR with the development of typical microscopic lesions of Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Clinically, PMWS is characterized by the progressive weigh loss, accompanied of dyspnea, enlargement of limph nodes, paleness and/or jaundice of the mucous membranes. The reduce growth rate of the pigs affected with the PMWS cause serious economical damage, making this disease as one of the most important for swine producing area. Like this, with the objective of comparing the relative viral concentration of the PCV with the weight gain of piglets of a commercial farm with PMWS, samples of total blood, serum and nasal swab were analyzed by real time PCR using SYBR® Green I and PCR for the PCV1, and were compared later amongst themselves for determination of which sample would be more appropriate for quantitative PCR. A total of 128 samples of total blood, 128 of serum and 128 of nasal swab were collected, which were obtained of 32 piglets accompanied at the nursery, grower, and finisher stage. After analyses, total blood was shown more appropriate for real time PCR, following by the serum. The nasal swabs were not considered appropriate for quantifications of PCV because detected PCV can represent the virus being eliminated in the nasal secretions and/or an environment contamination. All of the samples (n = 107) positive for PCV in real time PCR were also tested in PCR for PCV1 with negative results. The comparison between viral concentrations in blood or serum samples and the weights of the piglets, a negative correlation was observed.

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Alexandre Secorun Borges / Banca: Alice Fernandes Alfieri / Banca: Hélio Jose Montassier / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A quantificação de anticorpos é muito importante para monitoramento sorológico em granjas e associação com proteção contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Dessa forma este trabalho teve como objetivo padronizar e aplicar ELISA indireto com anticorpo de captura e utilizá-lo na quantificação de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos. Na padronização, os soros teste e os imunoreagentes básicos, incluindo, anticorpo de coelho anti-PCV2 purificado utilizado como captura e suspensão viral tiveram suas concentrações de uso ótimas determinadas. Aplicou-se o índice ELISA (IE) nos resultados dos soros de suínos para correção de variações entre testes. O teste mostrou-se específico do ponto de vista analítico e com alta reprodutibilidade podendo adequadamente ser utilizado na quantificação de anticorpos em soros de suínos contra o PCV2. Na aplicação, um total de 138 amostras de soros foi testado sendo cinco de porcas na gestação e 133 de leitões nascidos dessas porcas, acompanhados nas fases de maternidade ao crescimento em uma granja comercial com SMDS. Na avaliação da resposta de anticorpos contra o vírus, houve uma diminuição dos anticorpos da maternidade para a creche, coincidindo com o declínio dos anticorpos de origem materna e com a ocorrência da soroconversão simultaneamente com a detecção de PCV no sangue total pela PCR quantitativa. Em dois leitões com alta carga relativa de DNA viral e sinais clínicos sugestivos de SMDS, a quantidade de anticorpos detectada foi extremamente baixa / Abstract: Antibody quantification is important for serological monitoring in swine herds and association with protection against porcine circovirus type 2 (PCV2). The aim of this work was to standardize and apply indirect trapping ELISA and use it in the quantification of antibodies against PCV2 in sera from pigs. The immunoreagents, including rabbit antibody anti-purified PCV2 used as trapping antibody and viral suspension had their optimum use dilution previously determined. The absorbance index (ELISA Index, EI), was used to determine the antibody concentration in pig serum directed against PCV2. The test showed high analytical specificity and reproducibility. A total of 138 serum samples was tested including five sows in gestation and 133 piglets accompanied by phases from lactation to growth in a commercial swine herd where PCV2 was previously detected. In anti PCV2 antibody response it was observed a decreasing in the phases of lactation to nursery due to decline of maternal antibodies. The seroconversion was concurrent with PCV DNA detection by quantitative PCR in total blood. In two piglets with high relative DNA viral load and compatible clinical signs of PMWS, the anti PCV2 antibody concentration was very low / Doutor

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Alessandra Marnie M. G. Castro / Resumo: Vários estudos têm demonstrado a associação entre a maior concentração viral do circovírus suíno tipo 2 (PCV2) detectado por PCR quantitativa com o desenvolvimento de lesões microscópicas típicas da Síndrome da circovirose suína (SCS). Clinicamente, a SCS é caracterizada principalmente pelo emagrecimento progressivo, acompanhado de dispnéia, aumento de tamanho dos linfonodos, palidez e/ou icterícia das mucosas. A diminuição na taxa de crescimento dos leitões acometidos com a síndrome provoca grave prejuízo econômico para o produtor, o que torna a SCS uma das doenças mais importantes para a suinocultura. Assim, com o objetivo de comparar a concentração viral relativa do circovírus suíno (PCV) com o ganho de peso de leitões provenientes de uma granja comercial com SCS, amostras de sangue total, soro e "swab" nasal foram analisadas por PCR em tempo real com SYBR® Green I e PCR para o circovírus suíno tipo 1 (PCV1), sendo posteriormente, comparadas entre si para determinação de qual amostra seria mais apropriada para a utilização na PCR em tempo real com SYBR® Green I. Foram colhidas 128 amostras de sangue total, 128 de soro e 128 de "swab" nasal, as quais foram obtidas de 32 leitões acompanhados na maternidade, creche, recria e crescimento. Através da comparação das concentrações virais relativas do PCV entre as amostras, o sangue total mostrou-se mais apropriado para a PCR em tempo real, seguido do soro. Os "swabs" nasais não foram considerados apropriados para detecção do PCV pela técnica aplicada, pois o PCV detectado pode representar o vírus sendo eliminado nas secreções nasais e/ou uma contaminação do ambiente. Todas as amostras (n = 107) positivas para PCV por PCR em tempo real foram testadas para PCV1 e resultaram negativas. / Abstract: Several studies have shown the association among the largest viral concentration of Porcine circovirus type 2 (PCV2) detected by quantitative PCR with the development of typical microscopic lesions of Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Clinically, PMWS is characterized by the progressive weigh loss, accompanied of dyspnea, enlargement of limph nodes, paleness and/or jaundice of the mucous membranes. The reduce growth rate of the pigs affected with the PMWS cause serious economical damage, making this disease as one of the most important for swine producing area. Like this, with the objective of comparing the relative viral concentration of the PCV with the weight gain of piglets of a commercial farm with PMWS, samples of total blood, serum and nasal swab were analyzed by real time PCR using SYBR® Green I and PCR for the PCV1, and were compared later amongst themselves for determination of which sample would be more appropriate for quantitative PCR. A total of 128 samples of total blood, 128 of serum and 128 of nasal swab were collected, which were obtained of 32 piglets accompanied at the nursery, grower, and finisher stage. After analyses, total blood was shown more appropriate for real time PCR, following by the serum. The nasal swabs were not considered appropriate for quantifications of PCV because detected PCV can represent the virus being eliminated in the nasal secretions and/or an environment contamination. All of the samples (n = 107) positive for PCV in real time PCR were also tested in PCR for PCV1 with negative results. The comparison between viral concentrations in blood or serum samples and the weights of the piglets, a negative correlation was observed. / Mestre

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T13:46:49Z No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T13:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação. Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma. Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.