Submitted by KELLY TASSO DE PAULA null (kelly_tasso@hotmail.com) on 2016-02-02T18:47:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Kelly 2015 v6 .pdf: 6882664 bytes, checksum: 58b55229d09b2ae6003279a8396261d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-02T19:47:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paula_kt_me_rcla.pdf: 6882664 bytes, checksum: 58b55229d09b2ae6003279a8396261d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-02T19:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paula_kt_me_rcla.pdf: 6882664 bytes, checksum: 58b55229d09b2ae6003279a8396261d6 (MD5) Previous issue date: 2016-01-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A isomerização fotoinduzida transcis reversível de azocompostos tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. A fotoisomerização transcis das moléculas azoaromáticas ocorre quando estas moléculas fotocromáticas são expostas à irradiação de luz com comprimento de onda apropriado. A incorporação desses azocompostos em matrizes poliméricas tem originado materiais com potenciais aplicações em diversos campos como óptica não linear e sistemas de armazenamento óptico. Esse trabalho é dedicado à preparação e caracterização óptica de filmes de ORMOSIL (silicatos organicamente modificados) dopados com os azocorantes Methyl Red (MR) e Methyl Orange (MO). Estes materiais híbridos combinam as vantagens do processo sol-gel, com características específicas de polímeros orgânicos, permitindo o processamento de filmes finos, sem fraturas e fissuras. As amostras foram preparadas via processo sol-gel, a partir do alcóxido 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMS) dopado com MR e MO. A matriz foi depositada em forma de filmes finos sobre lâminas de vidro pela técnica de revestimento por imersão (dip coating). Para as caracterizações ópticas dos filmes foram realizadas medidas de espectroscopia de absorção UV/Vis, que permitiu a identificação das bandas de absorção e sua variação quando expostas a um feixe de luz. Os filmes mostraram mudanças reversíveis no seu espectro de UV/Vis de absorção relacionada com a fotoisomerização de trans-cis induzida pela luz quando expostos a um LED branco de alta intensidade. O efeito fotocrômico apresentado pelas amostras foi analisado em diferentes irradiâncias do feixe de excitação, onde foi possível a determinação das constantes de tempo para cada irradiância. Também foi analisado o fotocromismo na presença de bombeio óptico em diferentes temperaturas, o que permitiu a determinação da energia de ativação do processo de fotoisomerização cis-trans(em ausência de luz) (91,4 kJ/mol para a amostra dopada com MR e 82,6 kJ/mol para a amostra dopada com MO). / The reversible photoinduced trans  cis isomerization of azo dye-doped compounds has been extensively studied in the last decades. The trans  cis photoisomerization of azodye molecules occurs when these photochromic molecules are photo-selected by linearly polarized light of appropriate wavelength. The incorporation of these azo compounds in polymeric matrices has given rise to materials with potential applications in various fields as nonlinear optics and optical storage systems. This work is dedicated to the preparation and optical characterization of ORMOSIL (Organic Modified Silicates) films doped with Methyl Red (MR) and Methyl Orange (MO) azo dyes. These hybrids materials combine the advantages of sol-gel process with specifics characteristics of organic polymers, allowing the preparation of thin films without fractures or cracks. ORMOSIL samples were prepared by sol-gel process derived from 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS) alkoxide doped with MR and MO. MR and MO-doped GPTS-derived thin films were deposited onto glass slides by dip-coating technique. In order to characterize optically, UV/Vis absorption spectroscopy measurements were performed, which allowed the identification of the absorption bands, and its variation when exposed to a light beam. Films samples showed reversible changes in its UV-Vis absorption spectrum related to the trans-cis photoisomerization induced by light when exposed to a cold white LED. The photochromic effect of the samples was analyzed at different light intensities of the excitation beam, where it was possible to determine the time constants for each irradiance. It was also analyzed in the presence of optical pumping at different temperatures, allowing the determination of the activation energy of the cis-trans photoisomerization process (in the dark) (91.4 kJ/mol for the MR-doped and 82.6 kJ/mol for the MO-doped GPTMS-derived thin films).

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cowpea [ Vigna unguiculata (L.) Walpers] is a crop of great importance for the Northeastern Brazil, where it represents one of the basic diet constituents of its population. Although cowpea yield has been crescent every year, the crop suffers from several biotic and abiotic stresses. Under stress conditions, excess reactive oxygen species (ROS) are produced as a result of the plant metabolism alterations. ROS accumulation in various tissues is harmful for nucleic acids, proteins and lipids. Thus, the search for mechanisms that act in the removal of ROS is of fundamental importance. The objectives of this present work were to purify a 2-Cys peroxiredoxins from cowpea leaves, named Vu-2-cys-prx, and characterize some of its biochemical, physiological and molecular properties. Vu-2-cys-prx is an antioxidant enzyme which acts by reducing H 2 O 2 and alkyl hydroperoxides producing water and alcohol, respectively. Vu-2-cys-prx was purified by ammonium sulfate fractionation (30-60%) followed by affinity and ion exchange chromatography on chitin and Resource Q, in that order. Purified Vu-2-cys- prx was able to reduce hydroperoxides using NADPH and DTT reducing power with the aid of thioredoxin. Vu-2-cys-prx presented as a 44 kDa/46 kDa protein as determined by SDS-PAGE and size exclusion chromatography on Superose 12 column, respectively. Under reducing conditions, Vu-2-cys-prx appeared as a 22 kDa protein, indicating that the 44/46 kDa protein is a homodimer linked intermolecularly by disulfide bonds. Vu-2- cys-prx has a pI of 4.7, but by two-dimensional electrophoresis, with and without DTT, it focused as several protein spots indicating different oxidation states. The NH 2 -terminal sequence of Vu-2-cys-prx showed 96% similarity with the peroxiredoxins of Phaseolus vulgaris and Populus tricocarpa and 94% similarity with those of Vigna radiata , Pisum sativum , Ricinus cummunis and Nicitiana tabacum . In addition, Vu-2-cys-prx has a highly conserved cystein residue at position 52 (Cys 52 ). Analysis by ESI-Q-TOF MS/MS showed a molecular mass of 28.622 kDa and pI of 5.18. The circular dichroism spectrum and deconvolution at pH 7.0 showed that the secondary structure of Vu-2-cys-prx is composed of 7.6% α -helix, 39% β -sheet, 22.1% β -turn and 31% random coil. Vu-2-cis- prx was heat stable, with a protein melting point (Tm) of 74 ÂC, optimal activity at pH 7.0, and structural and functional changes under pH 3.0 and 9.0. Vu-2-cis-prx did not inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungus Colletrotrichum gloeosporioides , but prevented DNA plamidial degradation by reactive oxygen species (H 2 O 2 ).The transcripts of Vu-2-cys-prx were highly expressed in roots, stems and leaves and the sequence of its corresponding gene showed 100% homology with the cowpea ESTs FG931548.1 and FG883990.1. The predicted amino acid sequence showed 2 conserved cystein residues, and several peptide domains typical of the 2-cys-prx subfamily members. Molecular modeling showed that the redox-active cystein, named peroxidatic cystein, is in a narrow solvent-accessible pocket formed by a loop-helix motif. Cys 52 was located in the first turn of the helix surrounded by Pro 45 , Thr 49 and Arg 128 that are conserved in all 2-cys-peroxiredoxins. Moreover, modeling showed that Vu-2-cys-prx could form oligomers under different oxidative states. In summary, this study describes, for the first time, the purification and characterization of a 2-cys- peroxiredoxin (Vu-2-cys-prx) from cowpea leaves that, similarly to other members of this family, may play a pivotal role in the protection of plant chloroplasts from photo- oxidative stress and thus damage to the photosynthetic apparatus. / O feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] à uma das culturas de grande importÃncia para a regiÃo Nordeste, pois representa um dos constituintes bÃsicos da dieta de sua populaÃÃo. Embora a produÃÃo venha aumentando anualmente no paÃs, a cultura enfrenta diversos tipos de estresses de natureza biÃtica e abiÃtica. Durante condiÃÃes de estresses, espÃcies reativas de oxigÃnio (ROS) sÃo produzidas acima da condiÃÃo fisiolÃgica, como consequÃncia de alteraÃÃes do metabolismo. O acÃmulo de ROS, em vÃrios tecidos, à nocivo para Ãcidos nuclÃicos, proteÃnas e lipÃdeos. Sendo assim, a busca de mecanismos que atuem na remoÃÃo e controle da produÃÃo dessas espÃcies reativas à de fundamental importÃncia. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar, nos seus aspectos bioquÃmicos, fisiolÃgicos e moleculares, uma enzima antioxidante de folhas de feijÃo-de-corda, denominada de 2-cis-peroxirredoxina, que atua reduzindo o perÃxido de hidrogÃnio (H2O2) e hidroperÃxidos de alquil, produzindo Ãgua ou Ãlcool, respectivamente. A 2-cis-peroxirredoxina purificada de folha de V. unguiculata, nomeada de Vu-2-cis-prx, foi obtida por fracionamento com sulfato de amÃnio (30-60%), cromatografia de afinidade em matriz de quitina e cromatografia de troca iÃnica em Resource Q. A Vu-2-cis-prx foi capaz de reduzir hidroperÃxidos usando o poder redutor do NADPH e do DTT com auxÃlio do sistema tioredoxina. Apresentou massa molecular de, aproximadamente, 44 kDa/46 kDa, determinada por SDS-PAGE e cromatografia de exclusÃo molecular em coluna Superose 12, respectivamente. Jà em condiÃÃes redutoras, apresentou massa molecular de 22 kDa, indicativo de se tratar de uma proteÃna homodimÃrica, formada pelo estabelecimento de pontes dissulfeto intermoleculares. A Vu-2-cis-Prx apresentou pI de cerca de 4,7 e a anÃlise por eletroforese bidimensional, com e sem DTT, revelou que a Vu-2-cis-Prx foi focalizada em vÃrios spots protÃicos, indicando diferentes estados de oxidaÃÃo. Sua sequÃncia N-terminal revelou haver similaridade de 96% com a peroxirredoxina de Phaseolus vulgaris e de Populus tricocarpa, e de 94% com aquelas de Vigna radiata, Pisum sativum, Ricinus cummunis e Nicitiana tabacum, alÃm de um resÃduo de cisteÃna altamente conservado na posiÃÃo 52 (Cys52). AnÃlises por ESI-Q-TOF MS/MS demonstrou massa molecular e pI de 28,622 kDa/5,18, respectivamente. O espectro de dicroÃsmo circular e desconvoluÃÃo em pH 7,0 revelaram que a estrutura secundÃria à composta de 7,6% de ?-hÃlice, 39% de folha-?, 22,1% de volta-?, e 31% de padrÃo nÃo ordenado. A Vu-2-cis-Prx se comportou estÃvel ao calor e apresentou temperatura de desnaturaÃÃo (Tm) de 74 ÂC. Apresentou, ainda, Ãtimo de atividade em pH 7.0 e mudanÃas estruturais e funcionais em pH 3 e 9. Vu-2-cis-Prx nÃo foi capaz de apresentar atividade antifÃngica contra Colletrotrichum gloeosporioides, contudo foi capaz de prevenir a degradaÃÃo de DNA plamidial por ROS (H2O2). Os transcritos de Vu-2-cis-Prx foram altamente expressos em raÃzes, caules e folhas e a sequÃncia de seu gene demonstrou 100% de homologia com os ESTs FG931548.1 e FG883990.1 de feijÃo-de-corda, depositados no NCBI. A sequÃncia putativa de aminoÃcidos revelou 2 resÃduos de cisteÃna conservados e diversos domÃnios tÃpicos de membros da subfamÃlia de 2-cis-peroxirredoxinas. Modelagem molecular da Vu-2-cis-Prx revelou que o resÃduo de cisteÃna que participa do sÃtio-redox, denominada de cisteÃna peroxidÃsica, està em um bolso no qual o solvente tem acesso, sendo formado por um motivo âloop-hÃliceâ. A Cys52 foi localizada na primeira volta da hÃlice rodeada pelos aminoÃcidos Pro45, Thr49 e Arg128, que sÃo conservados em todas as 2-cis-peroxirredoxinas. AlÃm disso, a Vu-2-cis-Prx se mostrou capaz de formar oligÃmeros com diferentes estados de oxidaÃÃo. Em suma, foi descrito aqui, pela primeira vez, a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijÃo-de-corda que, semelhantemente a outros membros desta famÃlia, deve desempenhar papel crucial na protecÃÃo dos cloroplastos de plantas contra o estresse foto-oxidativo prevenindo, assim, danos ao aparato fotossÃntÃtico.

Lutein is a principal constituent of the human macular pigment. This study is composed of two projects. The first studies the conformational geometries of lutein and its potential adaptability in biological systems. The second is a study of the response of human subjects to lutein supplements. Using semi-empirical parametric method 3 (PM3) and density functional theory with the B3LYP/6-31G* basis set, the relative energies of s-cis conformers of lutein were determined. All 512 s-cis conformers were calculated with PM3. A smaller, representative group was also studied using density functional theory. PM3 results were correlated systematically to B3LYP values and this enables the results to be calibrated. The relative energies of the conformers range from 1-30 kcal/mole, and many are dynamically accessible at normal temperatures. Four commercial formulations containing lutein were studied. The serum and macular pigment (MP) responses of human subjects to these lutein supplements with doses of 9 or 20 mg/day were measured, relative to a placebo, over a six month period. In each instance, lutein levels in serum increased and correlated with MP increases. The results demonstrate that responses are significantly dependent upon formulation and that components other than lutein have an important influence serum response.

No description available.

No / Propargylic sulfones can be cis-hydrogenated using commercial zinc powder and ammonium chloride in THF¿water at room temperature, the major products being the corresponding (Z)-allylic sulfones. Other reducible groups (alkene, benzyloxy) are not affected. Allenylsulfones are implicated in one of the possible reaction pathways.

No description available.

A conclusão do seqüênciamento do genoma de múltiplos vertebrados trouxe um importante desafio para entender e predizer função, particularmente para seqüências não-codificantes, a partir de seqüências primarias de DNA. A hipótese de que a conservação evolutiva prediz seqüências funcionais é comumente aceita, inclusive para seqüências envolvidas na regulação da transcrição gênica, mesmo que a conservação de seqüências tenha gerado imperfeitas predições de enhancers (acentuadores) funcionais. O colágeno tipo XVIII é um componente da maioria das membranas basais; mutações no gene COL18A1 levam a síndrome de Knobloch, uma doença autossômica recessiva caracterizada por degeneração vitreoretiniana e macular e encefalocele occipital. O COL18A1 tem 43 exons que transcrevem três isoformas a partir de dois promotores diferentes. As três isoformas apresentam um complexo modelo de expressão tecido-específico, incluindo expressão em rim, pulmão, cérebro e retina. Os níveis de expressão do COL18A1 são considerados clinicamente importantes na vasculogenese, e em predisposição para o hepatocarcinoma e diabetes tipo 2. Dessa forma, a identificação de regiões regulatórias fornecerá indícios sobre a regulação da expressão do COL18A1 em estados normal e patogênico. Além disso, a endostatina e o FRZC18 são fragmentos proteolíticos do colágeno XVIII envolvidos na sinalização Wnt. No entanto, o papel in vivo do FRZC18 ainda não foi estudado. Uma profunda investigação do papel deste domínio na via de sinalização Wnt é indubitavelmente necessária, bem como a compreensão da regulação do COL18A1 pela via de Wnt. Empregamos um sistema eficiente de teste em zebrafish para analisar o potencial funcional de elementos enhancers na regulação transcricional do COL18A1. Identificamos quatro elementos enhancers que controlam a transcrição consistente com o COL18A1 endógeno de zebrafish, em tecidos incluindo retina, rim, vasos sanguíneos, intestino, cartilagem e fígado. Apesar dos algoritmos utilizados não tenham detectado conservação em seqüências não-codificantes de humanos à teleósteos no lócus do COL18A1 estudado, as seqüências humanas funcionaram apropriadamente em zebrafish transgênicos. Adicionais análises computacionais post hoc revelaram similaridade entre seqüência humana e de zebrafish dentro ou próximo das quatro regiões enhancers. Testamos funcionalmente o FRZC18 com superexpressão de seu RNAm em embriões de zebrafish. Este experimento resultou em embriões com fenótipos que assemelharam à mutantes da via não-canônica de Wnt (slb e ppt). Este resultado aponta o FRZC18 como um antagonista da via de sinalização não-canônica de Wnt, possivelmente por interação com Wnt11 e Wnt5. Dissecamos o promotor 1 do COL18A1, o qual mostrou características de genes housekeeping e similaridades com o promotor 2 do COL18A1. Também mostramos possível ligação de TCF/LEF aos promotores do COL18A1. A via de Wnt levou à redução de atividade dos promotores do COL18A1 e também redução dos níveis de expressão através de superexpressão de β-catenina. Este trabalho elucidou de forma geral, os elementos regulatórios em cis do COL18A1 e melhor caracterizou o seu papel na via de sinalização Wnt como um antagonista também da via não-canônica e como um alvo da via canônica. / The completion of multiple vertebrate genome sequences has presented an important challenge to understand and predict function from primary DNA sequence, particularly for noncoding sequence. It is commonly hypothesized that evolutionary conservation predicts functional DNA sequences, including those involved in regulating gene transcription, although sequence conservation has proven to be an imperfect predictor of enhancer function. Type XVIII collagen is a component of most basement membranes; mutations in the COL18A1 gene lead to Knobloch Syndrome, an autosomal recessive disease characterized by vitreoretinal and macular degeneration and occipital encephalocele. COL18A1 has 43 exons that transcribe three isoforms from two different promoters. The three isoforms display complex patterns of tissue-specific expression, including in kidney, lung, brain, and retina. Expression levels of COL18A1 are thought to be clinically important in vasculogenesis, and in predisposition to hepatocarcinoma and diabetes type 2. Therefore, identification of the regulatory regions will provide insight into normal and pathogenic regulation of COL18A1 expression. Furthermore, endostatin and FRZC18 are cleaved fragments from collagen XVIII that are involved in Wnt signaling, however in vivo role of FRZC18 has not been investigated yet in any model organism. Thus, a deeper investigation of FRZC18 role in Wnt signaling is indubitable necessary, as well as a comprehension of COL18A1 regulation by Wnt signaling. We have employed an efficient system of transgenesis in the zebrafish to functionally evaluate potential enhancer elements regulating COL18A1 transcription. We identified four enhancer elements that control transcription consistent with zebrafish endogenous COL18A1, in tissues including retina, kidney, blood vessels, gut, cartilage and liver. Although the algorithms we used did not detect noncoding conservation from human to teleosts at the COL18A1 locus, the human sequences functioned appropriately in zebrafish transgenics. Additional post hoc computational analysis revealed detectable sequence similarities between human and zebrafish in or near two of the four enhancer regions. We tested one of these zebrafish regions and confirmed orthologous enhancer activity. We functionally tested FRZC18 with its mRNA overexpression in zebrafish embryos. This experiment resulted in embryos with phenotype remaining slb and ppt, mutants of non-canonical wnt components. This result points FRZC18 as an antagonist of non-canonincal Wnt signaling possibly by interaction with Wnt11 and Wnt5. We dissected COL18A1 promoter 1 and it showed characteristics of a housekeeping gene and similarities with promoter 2 and we also showed possible TCF/LEF binding to COL18A1 promoters. Wnt signaling responded to downregulate promoter activity of COL18A1 and also decrease its expression by overexpression of s-catenin. This work broadly elucidated COL18A1 cis regulatory elements and better characterized its role in Wnt signaling as an antagonist of noncanonical and also as a target of canonial signaling.

A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros. / Genetic transformation is an alternative to citros conventional breeding that allows the modification of genotypes by the introduction of one or more genes derived from different organisms that can not be crossed by natural means. The transferred genes to the species of interest are controlled by promoters, which regulate a gene expression temporally, spatially and in the desired magnitude. In most cases, the introduced genes have been constitutively expressed using the CaMV35S promoter obtained from the cauliflower mosaic virus. However, the development of novel plant transformation approaches (cisgenesis and intragenesis) imply the use of genetic material from the same species or from closely related species capable of sexual hybridization, which requires the isolation of genetic elements, including citros constitutive promoters. The objective of this study was clone and characterize Citrus sinensis constitutive promoters. For this, the promoter region of the genes Elongation Factor 1-α (CsEF1), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) and Cyclofiline (CsCYC) was isolated and evaluated by fusion to the uidA reporter gene. The functionality of three promoter was confirmed by histochemical GUS assay in leaves, stems and roots of transgenic citrus plants cv. \'Hamlin\'. RT-qPCR analysis revealed that uidA gene expression under control of the CsCYC, CsGAPC2 and CsEF1 promoters was approximately 64%, 58% and 47% expression compared with the CaMV35S promoter. In silico analysis of the CsGAPC2, CsCYC and CsEF1 promoters displays their activity is controlled by a series of putative cis-regulatory elements. The full length promoter and truncated versions originated from deletions in promoters sequences were fused to the uidA gene and analyzed in Nicotiana benthamiana transgenic plants by histochemical and fluorimetric GUS assay. Deletion analysis did not cause loss of function on any of the promoters, but affected the gene expression on CsGAPC2 and CsEF1 truncated versions. The isolated promoters represent good candidates to be used in citros genetic transformation.

A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros. / Genetic transformation is an alternative to citros conventional breeding that allows the modification of genotypes by the introduction of one or more genes derived from different organisms that can not be crossed by natural means. The transferred genes to the species of interest are controlled by promoters, which regulate a gene expression temporally, spatially and in the desired magnitude. In most cases, the introduced genes have been constitutively expressed using the CaMV35S promoter obtained from the cauliflower mosaic virus. However, the development of novel plant transformation approaches (cisgenesis and intragenesis) imply the use of genetic material from the same species or from closely related species capable of sexual hybridization, which requires the isolation of genetic elements, including citros constitutive promoters. The objective of this study was clone and characterize Citrus sinensis constitutive promoters. For this, the promoter region of the genes Elongation Factor 1-α (CsEF1), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) and Cyclofiline (CsCYC) was isolated and evaluated by fusion to the uidA reporter gene. The functionality of three promoter was confirmed by histochemical GUS assay in leaves, stems and roots of transgenic citrus plants cv. \'Hamlin\'. RT-qPCR analysis revealed that uidA gene expression under control of the CsCYC, CsGAPC2 and CsEF1 promoters was approximately 64%, 58% and 47% expression compared with the CaMV35S promoter. In silico analysis of the CsGAPC2, CsCYC and CsEF1 promoters displays their activity is controlled by a series of putative cis-regulatory elements. The full length promoter and truncated versions originated from deletions in promoters sequences were fused to the uidA gene and analyzed in Nicotiana benthamiana transgenic plants by histochemical and fluorimetric GUS assay. Deletion analysis did not cause loss of function on any of the promoters, but affected the gene expression on CsGAPC2 and CsEF1 truncated versions. The isolated promoters represent good candidates to be used in citros genetic transformation.

A conclusão do seqüênciamento do genoma de múltiplos vertebrados trouxe um importante desafio para entender e predizer função, particularmente para seqüências não-codificantes, a partir de seqüências primarias de DNA. A hipótese de que a conservação evolutiva prediz seqüências funcionais é comumente aceita, inclusive para seqüências envolvidas na regulação da transcrição gênica, mesmo que a conservação de seqüências tenha gerado imperfeitas predições de enhancers (acentuadores) funcionais. O colágeno tipo XVIII é um componente da maioria das membranas basais; mutações no gene COL18A1 levam a síndrome de Knobloch, uma doença autossômica recessiva caracterizada por degeneração vitreoretiniana e macular e encefalocele occipital. O COL18A1 tem 43 exons que transcrevem três isoformas a partir de dois promotores diferentes. As três isoformas apresentam um complexo modelo de expressão tecido-específico, incluindo expressão em rim, pulmão, cérebro e retina. Os níveis de expressão do COL18A1 são considerados clinicamente importantes na vasculogenese, e em predisposição para o hepatocarcinoma e diabetes tipo 2. Dessa forma, a identificação de regiões regulatórias fornecerá indícios sobre a regulação da expressão do COL18A1 em estados normal e patogênico. Além disso, a endostatina e o FRZC18 são fragmentos proteolíticos do colágeno XVIII envolvidos na sinalização Wnt. No entanto, o papel in vivo do FRZC18 ainda não foi estudado. Uma profunda investigação do papel deste domínio na via de sinalização Wnt é indubitavelmente necessária, bem como a compreensão da regulação do COL18A1 pela via de Wnt. Empregamos um sistema eficiente de teste em zebrafish para analisar o potencial funcional de elementos enhancers na regulação transcricional do COL18A1. Identificamos quatro elementos enhancers que controlam a transcrição consistente com o COL18A1 endógeno de zebrafish, em tecidos incluindo retina, rim, vasos sanguíneos, intestino, cartilagem e fígado. Apesar dos algoritmos utilizados não tenham detectado conservação em seqüências não-codificantes de humanos à teleósteos no lócus do COL18A1 estudado, as seqüências humanas funcionaram apropriadamente em zebrafish transgênicos. Adicionais análises computacionais post hoc revelaram similaridade entre seqüência humana e de zebrafish dentro ou próximo das quatro regiões enhancers. Testamos funcionalmente o FRZC18 com superexpressão de seu RNAm em embriões de zebrafish. Este experimento resultou em embriões com fenótipos que assemelharam à mutantes da via não-canônica de Wnt (slb e ppt). Este resultado aponta o FRZC18 como um antagonista da via de sinalização não-canônica de Wnt, possivelmente por interação com Wnt11 e Wnt5. Dissecamos o promotor 1 do COL18A1, o qual mostrou características de genes housekeeping e similaridades com o promotor 2 do COL18A1. Também mostramos possível ligação de TCF/LEF aos promotores do COL18A1. A via de Wnt levou à redução de atividade dos promotores do COL18A1 e também redução dos níveis de expressão através de superexpressão de β-catenina. Este trabalho elucidou de forma geral, os elementos regulatórios em cis do COL18A1 e melhor caracterizou o seu papel na via de sinalização Wnt como um antagonista também da via não-canônica e como um alvo da via canônica. / The completion of multiple vertebrate genome sequences has presented an important challenge to understand and predict function from primary DNA sequence, particularly for noncoding sequence. It is commonly hypothesized that evolutionary conservation predicts functional DNA sequences, including those involved in regulating gene transcription, although sequence conservation has proven to be an imperfect predictor of enhancer function. Type XVIII collagen is a component of most basement membranes; mutations in the COL18A1 gene lead to Knobloch Syndrome, an autosomal recessive disease characterized by vitreoretinal and macular degeneration and occipital encephalocele. COL18A1 has 43 exons that transcribe three isoforms from two different promoters. The three isoforms display complex patterns of tissue-specific expression, including in kidney, lung, brain, and retina. Expression levels of COL18A1 are thought to be clinically important in vasculogenesis, and in predisposition to hepatocarcinoma and diabetes type 2. Therefore, identification of the regulatory regions will provide insight into normal and pathogenic regulation of COL18A1 expression. Furthermore, endostatin and FRZC18 are cleaved fragments from collagen XVIII that are involved in Wnt signaling, however in vivo role of FRZC18 has not been investigated yet in any model organism. Thus, a deeper investigation of FRZC18 role in Wnt signaling is indubitable necessary, as well as a comprehension of COL18A1 regulation by Wnt signaling. We have employed an efficient system of transgenesis in the zebrafish to functionally evaluate potential enhancer elements regulating COL18A1 transcription. We identified four enhancer elements that control transcription consistent with zebrafish endogenous COL18A1, in tissues including retina, kidney, blood vessels, gut, cartilage and liver. Although the algorithms we used did not detect noncoding conservation from human to teleosts at the COL18A1 locus, the human sequences functioned appropriately in zebrafish transgenics. Additional post hoc computational analysis revealed detectable sequence similarities between human and zebrafish in or near two of the four enhancer regions. We tested one of these zebrafish regions and confirmed orthologous enhancer activity. We functionally tested FRZC18 with its mRNA overexpression in zebrafish embryos. This experiment resulted in embryos with phenotype remaining slb and ppt, mutants of non-canonical wnt components. This result points FRZC18 as an antagonist of non-canonincal Wnt signaling possibly by interaction with Wnt11 and Wnt5. We dissected COL18A1 promoter 1 and it showed characteristics of a housekeeping gene and similarities with promoter 2 and we also showed possible TCF/LEF binding to COL18A1 promoters. Wnt signaling responded to downregulate promoter activity of COL18A1 and also decrease its expression by overexpression of s-catenin. This work broadly elucidated COL18A1 cis regulatory elements and better characterized its role in Wnt signaling as an antagonist of noncanonical and also as a target of canonial signaling.