La identificació dels mecanismes moleculars que regulen la supervivència i mort de les motoneurones representa una informació important per a la comprensió funcional i l'establiment de potencials dianes terapèutiques per a les malalties que cursen amb degeneració i mort d'aquestes neurones. Per aquest motiu hem dedicat aquest treball a:a) L'estudi dels mecanismes intracel·lulars dependents de calci que modulen la supervivència de les motoneurones durant el desenvolupament.Com a efecte inductor de supervivència hem analitzat la participació de la proteïna quinasa dependent de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneurones embrionàries de pollastre, i demostrem que la seva activació calci dependent indueix la fosforilació d'Akt i la supervivència d'aquestes neurones. Per altra banda, com a efecte inductor de mort demostrem que els increments excessius de la concentració del calci intracel·lular induïts per la despolarització de la membrana, són responsables de l'activació de la proteasa Calpaïna i la conseqüent degeneració de les motoneurones de ratolí. Proposem la inhibició de Calpaïna com a mecanisme neuroprotector.b) La generació d'un model in vitro per a l'estudi dels mecanismes patològics que causen la degeneració específica de les motoneurones en Atròfia Muscular Espinal.En aquesta segona part del treball, amb la finalitat de contribuir a la comprensió de la fisiopatologia d'aquesta malaltia hem desenvolupat un model in vitro utilitzant tècniques d'interferència d'RNA. Reduïm l'expressió de la proteïna Survival Motoneuron (SMN) en les motoneurones fins a nivells representatius de la forma severa de la malaltia. L'estudi morfològic i de viabilitat en aquestes cèl·lules ens facilitarà la identificació dels mecanismes moleculars implicats en la malaltia.Els resultats presentats en aquesta tesi impliquen l'activació de CaMKIV en la regulació de la supervivència de les motoneurones; proporcionen nous coneixements sobre les vies de regulació que en provoquen la seva degeneració (nivells de potassi elevats al medi extracel·lular i Calpaïna), i demostren alteracions d'aquestes neurones en un models d'Atròfia Muscular Espinal (degeneració neurítica i mort). / La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y muerte de las motoneuronas representa una información importante de conocimiento básico y para el establecimiento de potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades que cursan con degeneración y muerte de estas neuronas. Por este motivo hemos dedicado este trabajo al estudio de:a) Mecanismos intracelulares básicos dependientes de calcio que modulan la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo.Como efecto inductor de supervivencia hemos analizado la participación de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneuronas embrionarias de pollo, y demostramos que su activación calcio dependiente, induce la fosforilación de Akt y supervivencia de estas neuronas. Por otro lado, como a efecto inductor de muerte demostramos que incrementos de la concentración del calcio intracelular inducidos por la despolarización de la membrana, son responsables de la activación de la proteasa Calpaína y la degeneración de las motoneuronas de ratón. Nuestros resultados apoyan el uso de inhibidores de Calpaína como estrategia neuroprotectora.b) Mecanismos patológicos que causan la degeneración específica de las motoneuronas en Atrofia Muscular Espinal.En esta segunda parte del trabajo, con la finalidad de contribuir a la comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad hemos desarrollado un modelo in Vitro utilizando técnicas de interferencia de RNA. Reducimos la expresión de la proteína Survival Motoneuron (SMN) en las motoneuronas hasta niveles representativos de la forma severa de la enfermedad. El estudio morfológico y de viabilidad en estas células nos facilitará la identificación de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad.Los resultados que presentamos en esta tesis implican la activación de CaMKIV en la regulación de la supervivencia de las motoneuronas; proporcionan nuevos conocimientos sobre las vías de regulación que provocan su degeneración (niveles de potasio elevados al medio extracelular y Calpaína), así como alteraciones específicas de estas neuronas en modelos de Atrofia Muscular Espinal (degeneración neurítica y muerte). / Identification of molecular mechanisms that regulate motoneuron survival and death represent valuable basic knowledge to elucidate potential therapeutic targets for those diseases that imply motoneuron degeneration and death. For this reason in the present work we studied:a) Basic calcium-dependent intracellular mechanisms which modulate motoneuron survival during development.As a pro-survival effect we analysed the role of the calcium/calmodulin dependent protein kinase IV (CaMKIV) in cultured chicken motoneurons. Results demonstrated that CaMKIV activation induces Akt phosphorylation and motoneuron survival. On the other hand, as a prodegenerative effect we demonstrate that in mouse motoneurons depolarization induced excessive calcium influx activates the protease Calpain and causes motoneurons death. Our results suggest that Calpain inhibitors may induce neuroprotective effects.b) Intrinsic motoneuron pathological mechanisms underlying Spinal Muscular Atrophy.In this second part, with the aim to facilitate the understanding of the physiopathology of SMA we developed an in vitro model using RNA interference techniques. We reduce Survival Motoneuron (SMN) protein expression in motoneurons to representative levels from severe Spinal Muscular Atrophy mouse models. Morphologic and survival analysis of these cultured neurons may contribute to the identification of pathologic molecular mechanisms implicated in the disease.Reported results, obtained from the morphological and molecular analysis of primary motoneuron cultures, provide new knowledge on motoneuron development and survival regulating pathways (implication of CaMKIV activation in motoneuron survival regulation), about regulation pathways involved in motoneuron degeneration (high potassium extracellular levels and Calpain activation), as well as motoneuron alterations in a severe SMA culture model (neurite degeneration and death).

Una forma d’analitzar la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules normals és l’anàlisi de l’expressió dels llocs fràgils. Aquests són regions del genoma caracteritzats per la seva inestabilitat sota condicions d’estrès replicatiu. Sota aquestes condicions es poden induir alteracions en loci relacionats amb càncer. L’estudi d’inestabilitat es pot centrar en sang perifèrica, i en altres tipus de teixit, d’entre els quals la bufeta és un bon model donat l’elevada freqüència de recidives i la multifocalitat o presència de tumors sincrònics en aquest òrgan. Els objectius d’aquest treball són: a) estudiar l’expressió de llocs fràgils comuns en limfòcits de sang perifèrica d’una sèrie de pacients afectats de càncer de bufeta i comparar-la amb una sèrie de controls aparellats per edat i hàbit fumador; b) analitzar si les condicions d’estrès replicatiu sota les quals s’expressen els llocs fràgils indueixen alteracions dels loci 9p21 i CCND1 en pacients i comparar-ho amb controls; c) analitzar la presència d’aneuploïdies afectant als cromosomes 1, 7, 8, 9, 11 i 17 en el tumor i en la resta de l’uroteli vesical aparentment normal del mateix pacient. Els nostres resultats demostren que l’afidicolina indueix alteracions en limfòcits de sang perifèrica en forma de delecions i duplicacions en loci tals com 9p21 i CCND1 normalment alterats en cèl·lules tumorals. Aquestes alteracions no difereixen entre pacients i controls. De la mateixa manera, l’expressió de llocs fràgils no presenta diferències entre ambdós grups, i en general els dos fenòmens estudiats estarien relacionats amb la pèrdua d’integritat del genoma relacionada amb l’edat. En l’epiteli urotelial, l’anàlisi cromosòmica d’inestabilitat numèrica indica que la mucosa aparentment normal acumula alteracions en major o menor freqüència i que s’observa variabilitat entre pacients. Els nostres resultats permeten confirmar que la presència d’inestabilitat en cèl·lules normals i en individus aparentment sans és un fenomen més freqüent de l’esperat i que probablement està relacionat amb l’envelliment. / One way to analyse chromosomal instability in normal cells is the analysis of the expression of fragile sites. These are regions of the genome characterized by instability under conditions of replicative stress. Under these conditions, alterations in cancerrelated loci may be induced. The study of instability can focus on peripheral blood and other tissue types, among which the bladder is a good model given the high frequency of recurrences and the presence of multiple synchronous tumours in this organ. The aim of this work is: a) to study the expression of common fragile sites in peripheral blood lymphocytes of a series of patients with bladder cancer and controls matched by age and smoking habit; b) to analyse if the replicative stress also induce alterations in loci 9p21 and CCND1 in the same subjects; c) to analyse the presence of aneuploidies for chromosomes 1, 7, 8, 9, 11 and 17 in bladder tumour and the apparently normal urothelium of the same patient. Our results show that aphidicolin induces deletions and duplications in loci 9p21 and CCND1 in peripheral blood lymphocytes. These alterations did not differ between patients and controls. Similarly, the expression of fragile sites presents no differences between both groups, and generally both phenomena would be related with the loss of integrity of the genome associated with age. The urothelial epithelium analysis indicates that numerical chromosomal instability is present in apparently normal mucosa, where alterations accumulates in varying frequency, and shows variability between patients. In summary, our results confirm the presence of instability in normal cells and in apparently healthy individuals. This phenomenon is more common than expected and probably is related to aging.

El factor limitant de la dosi aplicada en els tractaments de radioteràpia és la tolerància del teixit normal. Aquesta tolerància mostra variabilitat entre pacients i aproximadament un 5% dels pacients que reben radioteràpia pateixen toxicitat elevada en el teixit normal. Per aquesta raó, s’han dedicat molts esforços en trobar un assaig que pugui predir-la, per poder establir en el futur tractaments de càncer individualitzats. Per aconseguir aquest propòsit, és necessari l’estudi dels mecanismes moleculars que determinen la radiosensibilitat. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la resposta a les radiacions ionitzants (RI) de dues línies cel·lulars limfoblastoides, una línia cel·lular radiosensible (4060, RS) i una altra radioresistent (20037, RR), mitjançant assajos cel·lulars i d’expressió gènica. Primer, es va avaluar la fosforilació de la histona H2AX en les dues línies, utilitzant diferents metodologies microscòpiques i citometria de flux, observant-se sempre majors recomptes de foci de γ-H2AX o un major increment d’intensitat d’immunofluorescència en la línia RS en comparació amb la línia RR. A més, el sistema microscòpic automàtic va ser la metodologia més ràpida pel recompte de foci i per tant va representar una eina molt útil. Segon, es va avaluar la inducció de foci de γ-H2AX i la seva cinètica de desaparició fins a 24 h postirradiació. La línia RS va presentar recomptes significativament superiors de foci en gairebé tots els temps postirradiació analitzats, així com una taxa de desaparició més lenta en comparació amb la línia RR. Tercer, es va avaluar la freqüència d’alteracions cromosòmiques completes i incompletes (CCE i ICE, respectivament) en les dues línies 24 h després d’irradiar. La línia RS va mostrar una freqüència significativament major d’ICE en comparació amb la línia RR. Quart, es va analitzar la mortalitat cel·lular induïda per una dosi de 2 Gy, observant-se que era major en la línia RS que en la línia RR. Finalment, es va utilitzar la metodologia QuantSeq per identificar perfils d’expressió gènica diferencial de les dues línies cel·lulars a diferents temps postirradiació. En comparació amb la línia RR, la línia RS presentava una major i prolongada expressió diferencial de gens, tant a les 4 com a les 24 h després d’irradiar. L’anàlisi funcional 24 hores després d’irradiar va mostrar que la línia RS encara presentava gens diferencialment sobreexpressats relacionats amb resposta al dany en el DNA, efectors de p53 i apoptosi, mentre que la línia RR ja no en sobreexpressava. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi demostren que les dues línies cel·lulars tenen diferent resposta a les RI i, tot i ser uns resultats preliminars, podrien ser un bon model per avaluar la toxicitat del teixit normal en pacients de càncer després de la radioteràpia. / The tolerance of the normal tissue represents the limiting factor on the radiation dose given in radiotherapy. There is significant variation between patients in terms of normal tissue toxicity, and about 5% of cancer patients receiving radiotherapy show high toxicity. For that reason, efforts have been focused on searching a predictive assay of normal tissue radiosensitivity for tailoring individualized radiotherapy treatments in the future. To achieve this goal, understanding the molecular mechanisms underlying radiation sensitivity is necessary. In this scenario, the present thesis aimed to study the response to ionizing radiation of two lymphoblastoid cell lines, one radiosensitive (4060, RS) and another radioresistant (20037, RR), using cell-based assays and gene expression analysis. First, quantification of H2AX phosphorylation was assessed using different microscopic methodologies and flow cytometry. The RS cell line always showed higher foci counts and higher levels of immunofluorescence intensity than the RR cell line. The automated microscopy system represented an improvement of the speed for scoring γ-H2AX foci when compared with the other microscopic methodologies. Second, the kinetics of γ-H2AX foci induction and disappearance was evaluated after irradiation up to 24 h. The RS cell line showed significantly higher foci counts for almost all the post-irradiation times tested and a slower rate of their disappearance in comparison with the RR cell line. Third, the frequency of complete and incomplete chromosome aberrations (CCE and ICE, respectively) was scored after irradiation in both cell lines, showing the RS cell line a significantly higher frequency of ICE than the RR cell line. Fourth, radiation-induced cell death was evaluated after 2 Gy irradiation, presenting the RS cell line a higher mortality than the RR cell line. Finally, QuantSeq methodology was used to identify differential gene expression profiles of both cell lines at different post-irradiation times. The RS cell line presented a greater and a prolonged differential expression of genes, both at 4 and 24 h after irradiation, in comparison with the RR cell line. Functional analysis revealed that 24 h after irradiation genes involved in DNA damage response, p53 effectors and apoptosis were still differentially up-regulated in the RS cell line but not in the RR cell line. Collectivelly, the results from this thesis demonstrate that the two cell lines respond differently to ionizing radiation. Although these data are preliminary, they could serve as a model to study normal tissue radiation toxicity of cancer patients.

L’ús de materials biocompatibles ha assolit una importància creixent en aplicacions ortopèdiques i quirúrgiques, degut a l’envelliment de la població. Els aliatges metàl·lics que s’empren actualment en medicina presenten propietats físiques i mecàniques diferents a les de l’os humà, incrementant la probabilitat de pèrdua de l’implant. Per aquesta raó, s’estan desenvolupant nous aliatges metàl·lics amb millors propietats. En aquest sentit, la present tesi té com objectiu l’anàlisi de la biocompatibilitat de nous aliatges pel seu ús en implants ortopèdics. En primer lloc, s’ha demostrat la biocompatibilitat del vidre metàl·lic massís TiZrCuPd en termes de citotoxicitat, i d’adhesió i de diferenciació d’osteoblasts. En segon lloc, s’ha avaluat l’efecte de dues modificacions de superfície, anodització electroquímica i modificació física, dels aliatges TiZrCuPd i Ti-6Al-4V sobre el comportament dels osteoblasts. En aquest cas, no hem observat cap efecte de la topografia en la proliferació, l’adhesió i la diferenciació. En tercer lloc, hem demostrat que els aliatges TiZrPdSi i TiZrPdSiNb són biocompatibles i afavoreixen l’adhesió, la proliferació i la diferenciació d’osteoblasts. Finalment, hem avaluat l’efecte electroestimulador de dos nous nanogeneradors piezoelèctrics, basats en ZnO, emprant dues línies cel·lulars implicades en la regeneració òssia (osteoblasts i macròfags). Els resultats observats indiquen que els nanogeneradors són biocompatibles i que la seva interacció amb les cèl·lules produeix un camp elèctric local que estimula la motilitat dels macròfags i l’augment de la concentració intracel·lular de Ca2+ en osteoblasts. Aquests nous materials intel·ligents presenten propietats força interessants pel seu ús en aplicacions biomèdiques. En conjunt, els resultats obtinguts en els nostres estudis contribueixen en el desenvolupament de materials per millorar la reparació i la regeneració òssia. / The use of biocompatible materials has attained an increasing importance for medical surgery and orthopaedics due to population aging. Metallic alloys currently used in bone implants have physical and mechanical properties different from those of the bone, which increases the probability of implant loosening. For this reason, new metallic alloys with better properties are being developed. In this regard, the present thesis aims to analyse the biocompatibility of new biomaterials for orthopaedic applications. First, we demonstrated the biocompatibility of TiZrCuPd bulk metallic glass in terms of cytotoxicity, and osteoblast adhesion and differentiation. Second, we assessed the effect of surface modification of TiZrCuPd and Ti-6Al-4V alloys by electrochemical anodization and physical modification on osteoblast behaviour. Differences in topography did not cause changes on osteoblasts adhesion, proliferation and differentiation. Third, we demonstrated that TiZrPdSi and TiZrPdSiNb alloys are also biocompatible and enhance osteoblasts adhesion, spreading, proliferation and differentiation. Fourth, we evaluated the electrostimulation effect of two new ZnO piezoelectric nanogenerators using two cell lines involved in bone regeneration (osteoblasts and macrophages). We observed that both nanogenerators are biocompatible and that their interaction with cells produces a local electric field that stimulate macrophages motility and the increase in intracellular Ca2+ concentration in osteoblasts. Thus, these new smart materials have interesting properties for their use in biomedical devices. Collectively, the results obtained in our studies contribute to the progress in the development of better materials for bone repair and regeneration.

En estudis previs realitzats en el nostre laboratori vam demostrar que la infusió de cèl·lules de medul·la òssia (MO) transduïdes amb un autoantigen (MOG40-55), dirigit a la via de presentació d'antígens per MHC de classe II, induïen tolerància immunològica en un model experimental d'esclerosi múltiple, la encefalomielitis autoimmune experimental (EAE), tant en un abordatge preventiu com terapèutic (Eixarch et al. 2009). Per altra banda, l'absència d'empelt de les cèl·lules que expressaven la MOG va permetre eliminar la mieloablació i ens va conduir a la hipòtesis de que l'efecte terapèutic observat no estava mediat per cèl·lules amb capacitat d'empeltar sinó més aviat per unes cèl·lules més madures que presentaven l'autoantigen de forma tolerogènica. Estudis posteriors van revelar que la majoria de les cèl·lules que es generaven en els cultius de transducció amb retrovirus de cèl·lules de MO eren d'origen mieloide i que, de fet, eren cèl·lules mieloide supressores (MDSCs, sigles en anglès) (Gomez et al.2014). Per tant, la primera part d'aquesta tesi es va iniciar amb el propòsit de caracteritzar millor aquestes MDSCs i de determinar si eren elles les responsables de la inducció de tolerància immunològica observada en la EAE a més d'estudiar els possibles mecanismes d'acció implicats. Amb aquesta finalitat es van transduïr cèl·lules de MO amb un vector retroviral que codificava per l'autoantigen (MOG40-55) o amb un vector control. Es van aïllar les MDSCs i es van administrar als ratolins set dies abans (braç preventiu) o 13-14 dies després (braç terapèutic) de la inducció de la EAE. Els resultats mostren que una única administració de MDSCs antigen-específiques va induir tolerància immunològica in vivo i que va prevenir i millorar els signes clínics de la EAE de manera antigen-específica. A més a més, els animals toleritzats presentaven una neuropatologia reduïda, proporcions de limfòcits activats reduïdes i proporcions de limfòcits B amb un fenotip regulador augmentades. D'altra banda, aquestes MDSCs generades ex vivo expressaven la molècula inhibitòria programmed death ligand 1 (PD-L1) i produïen espècies reactives d'oxigen, mecanismes associats amb la inhibició dels limfòcits T autoreactius i amb la inducció de tolerància immunològica. Després d'obtenir resultats prometedors amb les MDSCs antigen-específiques de ratolí, vam decidir donar un pas més i la segona part d'aquesta tesi està enfocada a desenvolupar mètodes eficients per generar MDSCs humanes a partir de progenitors hemopoètics per la seva potencial aplicació clínica. Es van cultivar progenitors CD34+ obtinguts de productes d'afèresis de donants sans durant 9, 14 i 20 dies en presència de diferents combinacions de citoquines bàsicament formades per SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF i IL-6. Els resultats mostren que les MDSCs es poden generar de manera eficient a partir de progenitors hemopoètics i que les seves proporcions augmentaven amb els dies de cultiu. A més, aquestes cèl·lules expressaven la molècula immunosupressora PD-L1, eren molt poc al·loreactives, suprimien la proliferació de cèl·lules T induïda per un estímul policlonal i reduïen els nivells de les citoquines proinflamatòries mentre que augmentaven el nivell de la citoquina immunomoduladora IL-10. Per aquests motius creiem que les MDSCs generades in vitro són una eina potencial pel tractament de malalties autoimmunes i per evitar la malaltia de l'empelt contra l'hoste després del trasplantament. / In previous studies conducted at our laboratory we demonstrated that infusion of bone marrow (BM) cells transduced with a self-antigen (MOG40-55), targeted to the MHC class II antigen presentation pathway, induced immunological tolerance in an experimental model of multiple sclerosis, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), both preventively and therapeutically (Eixarch et al. 2009). Moreover, the absence of engraftment of the MOG-expressing cells allowed to eliminate myeloablation and hypothesize that the therapeutic effect observed was not mediated by cells with engrafting potential but rather by a more mature cell type that expressed the self-antigen in a tolerogenic manner. Subsequent studies revealed that the majority of cells generated in standard retroviral transduction cultures of BM cells were of myeloid origin and that, indeed, were myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) (Gomez et al. 2014). Therefore, the first part of this thesis was initiated with the purpose of better characterizing these MDSCs generated in BM retroviral transduction cultures and determining whether these cells were responsible for the induction of the immunological tolerance observed in the EAE model as well as studying the potential mechanisms of action involved. To this end, BM cells were transduced either with a retroviral vector encoding for the self-antigen or with a control vector. Both BM cells and isolated MDSCs were infused to the animals seven days before (preventive arm) or 13-14 days after (therapeutic arm) EAE induction. Results showed that a single infusion of antigen-specific MDSCs induced immunological tolerance in vivo and was able to prevent and ameliorate established EAE in an antigen-specific manner. In addition, tolerized animals presented a decreased neuropathology, reduced proportions of activated T cells and increased proportions of B cells with a regulatory phenotype. Moreover, the ex vivo generated MDSCs expressed the inhibitory molecule programmed death ligand 1 (PD-L1) and produced reactive oxygen species, mechanisms associated with the inhibition of autoreactive T cells and with the induction of immunological tolerance. After obtaining these promising results with the murine antigen-specific MDSCs, we decided to move one step further and, therefore, the second part of this thesis was aimed at developing efficient methods to generate human MDSCs from hematopoietic progenitor cells for its potential clinical application. To this end, CD34+ progenitor cells from apheresis products of healthy donors were cultured for 9, 14 and 20 days in the presence of different cytokine combinations mainly consisting of SCF, TPO, FLT3-L, IL-3, GM-CSF and IL-6. Results showed that MDSCs can be efficiently generated from hematopoietic progenitor cells and that their proportions significantly increased along with the days of the culture. Moreover, these cells expressed the immunosuppressive molecule PD-L1, had very little alloreactivity, suppressed polyclonal-induced T-cell proliferation and decreased the levels of proinflammatory cytokines while increasing the levels of the immunomodulatory cytokine IL-10. For these reasons, we believe that in vitro generated MDSCs constitute a potential tool for the treatment of autoimmune diseases and to prevent graft-versus-host disease (GVHD) in transplantation settings.

En 2002, el petrolero Prestige se hundió vertiendo una gran cantidad de fuel que poco después llegó a las costas gallegas. En las tareas de limpieza del fuel colaboraron un gran número de personas que se expusieron a los compuestos químicos potencialmente tóxicos y algunos, como el benceno, carcinógenos. En un estudio genotóxico realizado dos años después de la exposición al fuel, por nuestro grupo (Prestige I), se observó un incremento de alteraciones cromosómicas estructurales en los individuos expuestos. Las conclusiones de este estudio evidenciaron la importancia de realizar un estudio de seguimiento de los mismos individuos a más largo plazo (Prestige II), dada la asociación existente entre aumento de alteraciones cromosómicas y riesgo a desarrollar cáncer. El objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar si el efecto genotóxico detectado persiste transcurridos 4 años del estudio anterior. Para ello se han estudiado 105 pescadores gallegos expuestos (E) y no expuestos (NE) al fuel. Además, 9 individuos se han incluido en un grupo especial de cáncer. Se han llevado a cabo cultivos convencionales de linfocitos de 72h en medio RPMI-1640. En total se han analizado 11.651 metafases con tinción secuencial uniforme-bandas G y 3.130 cariotipos para la detección de lesiones cromosómicas y alteraciones cromosómicas estructurales, respectivamente. La frecuencia de lesiones cromosómicas observada es similar en individuos expuestos y no expuestos en ambos estudios (Prestige I y Prestige II), indicando que las lesiones cromosómicas no son un buen biomarcador para analizar el efecto del fuel, si este ya no está presente. Se ha detectado una frecuencia elevada de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos E, indicando que el efecto genotóxico detectado anteriormente aún persiste 4 años después y que las células de la médula ósea podrían haber sido afectadas por la exposición al fuel. Así mismo, la frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales en individuos no expuestos era mayor que la observada en el Prestige I, lo que hace pensar que dichos individuos han estado sometidos, durante estos años, a una exposición indirecta al fuel de menor intensidad. Los individuos diagnosticados de cáncer presentan una frecuencia de alteraciones cromosómicas estructurales similar a la observada en individuos expuestos al fuel en Prestige II. Estos datos muestran la necesidad de hacer un seguimiento de los individuos que estuvieron muy expuestos al fuel, con el fin de detectar el cáncer en etapas más tempranas. Los estudios de genotoxicidad del Prestige I y II son, hasta el momento, los únicos que han analizado la exposición aguda al fuel en un elevado número de individuos muy seleccionados, a medio y largo plazo (2 y 6 años después de la exposición). / In 2002 the oil tanker Prestige wrecked near the Spanish region of Galicia, in the northwestern Atlantic coast of Spain. A big quantity of oil was spilt and reached the nearby coast soon after. An important amount of people took part in the cleaning tasks of the fuel and were therefore exposed to potentially toxic chemicals, some of them being carcinogens, as it is the case of benzene. A genotoxic study, carried out by our group (Prestige I) 2 years after the exposure to the fuel, showed an increase in structural chromosome aberrations in the exposed individuals. The conclusions from that study revealed the importance of conducting a follow up study of the same individuals in a longer term period (Prestige II), due to the existing association between the increase of chromosome aberrations and the risk of developing cancer. The main objective of this doctoral thesis is to determine if the genotoxic effect detected in these individuals persist four years after the previous study, by analyzing 105 fishermen, exposed (E) and not exposed (NE) to the fuel. Furthermore, 9 individuals have been included in a special cancer group. Conventional culturing of 72-hour lymphocytes in RPMI-1640 medium was carried out. A total of 11.651 metaphases were analysed sequentially stained, uniform- G-bands, and 3.130 karyotypes in order to detect chromosome lesions (gaps and breaks) and structural chromosome aberrations respectively. The observed frequency of chromosome lesions is similar in both groups exposed and not exposed, in both studies (Prestige I and Prestige II), indicating that chromosome lesions are not a good biomarker to analyse the fuel effect, when the fuel is not longer present. An elevated amount of structural chromosome aberrations has been detected in exposed individuals, which indicates that the genotoxic effect previously observed still persists four years later, and that the cells of the bone marrow could have been affected due to the exposure to the fuel. Moreover, the frequency of structural chromosome aberrations in not exposed individuals has been greater than observed in Prestige I, which makes us believe that these individuals have undergone, during these years, a less intense and indirect exposure to the fuel. The individuals diagnosed with cancer present a frequency in structural chromosome aberrations similar to the observed in individuals exposed to the fuel in Prestige II. Such data proves the need for following up of the most exposed individuals, aiming to detect cancer in the initial stages. The genotoxic studies in Prestige I and II are, so far, the only studies that have analysed the acute exposure to the fuel in an important quantity of well chosen individuals, in a medium and long-term period (2 and 6 years after the exposure).

El petrolier Prestige (2002) es va enfonsar abocant al mar unes 65.000 tones de fuel que, dies després, van contaminar les costes gallegues. Durant les tasques de neteja, més de 300.000 persones van estar exposades als components genotòxics del fuel, com el benzè i el benzopirè. El nostre grup va realitzar un estudi genotòxic dos anys després de l’exposició al fuel (Prestige I), observant un augment de les alteracions cromosòmiques estructurals en els individus exposats. L’associació existent entre l’augment de les alteracions cromosòmiques i el risc de desenvolupar càncer va fer que es plantegés la necessitat de realitzar un estudi de seguiment (Prestige II). Aquesta tesi doctoral té com objectiu principal determinar si l’efecte genotòxic, prèviament detectat, persisteix sis anys després de l’exposició. S’han estudiat 104 pescadors gallecs, 58 exposats i 46 no exposats al fuel, amb cultius estàndards de limfòcits de 48 h. A més, s’han realitzat cultius de limfòcits amb afidicolina en 44 d’aquests mateixos individus, per comprovar l’existència d’errors en la reparació de l’ADN. Basant-nos en els resultats d’aquest treball, en els obtinguts prèviament (Prestige I i Prestige II cultius de 72 h) i en les comparacions realitzades entre ells, podem concloure que: a) en els estudis de seguiment només s’han d’incloure els individus prèviament analitzat, b) les lesions cromosòmiques no són un bon biomarcador de genotoxicitat quan el temps transcorregut des de l’exposició al fuel és superior a dos anys, c) el temps de cultiu no afecta a la detecció de dany cromosòmic després de dos anys de l’exposició, d) la freqüència d'alteracions cromosòmiques estructurals en individus exposats al fuel és entre dos i tres vegades superior a la descrita en la població normal, confirmant que l'efecte genotòxic persisteix sis anys després de l'exposició, e) l’augment d’alteracions cromosòmiques en els individus no exposats suggereix que han estat sotmesos a una exposició secundària al fuel (aliments contaminats o residus emmagatzemats) o a algun altre agent genotòxic, que els ha fet empitjorar des del Prestige I, f) l’augment del dany detectat en individus exposats al fuel, tan en Prestige I com en Prestige II, està associat a errors en la reparació de l’ADN. Finalment, l’interès socio-sanitari dels nostres resultats, posa de manifest la necessitat de portar a terme estudis semblants que permetin confirmar si l’exposició accidental al fuel incrementa el risc de desenvolupar càncer. / The tanker Prestige (2002) wrecked and spill about 65.000 tons of oil and pollutants into the sea at the Galician coasts. During the cleaning tasks, more than 300.000 people were exposed to genotoxic oil components, like benzene and benzopyrenne. Our group carried out a genotoxic study two years after the exposure to oil (Prestige I) and showed an increase in structural chromosome alterations in exposed individuals. The associations between the increase of chromosomal alterations and the risk of developing cancer revealed the importance of conducting a follow-up study (Prestige II). The main objective of this doctoral thesis is to determine if the previously detected genotoxic effect persists six years after the exposure. We have analyzed 104 fishermen, 58 exposed and 46 not exposed to the oil, with conventional culturing of 48 h lymphocytes. And 44 of the same individuals were studied with culturing with aphidicolin, to test possible errors in DNA repair. Based on our results, the results of the previous studies (Prestige I 72 h and Prestige II 72h) and the comparison between them, we must conclude that: a) follow-up studies only have to include previously studied individuals, b) chromosomal lesions are not a good genotoxicity biomarker when the fuel is not present, c) the time of culturing does not affect the detection of chromosomal damage two years after the exposure, d) the frequency of structural chromosome alterations is about two times higher than described in normal population, which confirms that genotoxic effect previously detected still persists six years after the exposure, e) the increase of damage in non-exposed individuals makes us believe that these individuals have undergone a less intense exposure to the oil (contaminated food or stored residues) or to another genotoxic agent, which affected them, f) the high damage in exposed individuals, in Prestige I and Prestige II, is associated with errors in DNA repair. Finally, the socio-sanitary interest of our results shows the need for similar studies to confirm if accidental exposure to oil increases the risk of developing cancer.

La correcta trazabilidad de las muestras derivadas de la práctica de las técnicas de reproducción asistida principalmente ovocitos, semen y embriones es esencial, tanto en la reproducción asistida de humanos como de animales de renta. Los sistemas actualmente destinados a mantener identificada la muestra durante su paso por el laboratorio y a preservar dicha trazabilidad presentan ciertas limitaciones. En esta tesis se ha desarrollado un sistema de etiquetaje directo de ovocitos y embriones utilizando microdispositivos codificados de polisilicio que permite mantener la muestra identificada, y por lo tanto trazarla durante todo su procesamiento cubriendo así la mayoría de las limitaciones detectadas en los sistemas actualmente disponibles para esta función. / The correct traceability of samples derived from the practice of assisted reproductive technologies mainly oocytes, semen and embryos is essential, both in human and livestock assisted reproduction. Current systems designed to maintain the sampleidentifiedduringallthe laboratory procedures and to preserve its traceability have certain limitations. In this thesis a direct tagging system for oocytes and embryos, using encoded polysilicon microdevices, has been developed. This system keeps the sample identified throughout its processing, allowing its traceability at any time. Thus, the limitations detected in the systems currently available can be overpassed by means of the implementation of the direct tagging system developed here.

Els telòmers són estructures ribonucleoproteiques formades per repeticions en tàndem TTAGGG, un complex proteic específic (shelterina), i RNA telomèric no codificant (TERRA), que es localitzen als extrems dels cromosomes eucariotes per prevenir la inestabilitat genòmica i les fusions entre cromosomes. En les cèl·lules germinals, el manteniment de l’estructura telomèrica és crucial per a la correcta progressió de la gametogènesi, ja que els telòmers participen en l’aparellament entre cromosomes homòlegs durant la profase I de la meiosi, i promouen la sinapsi i la recombinació entre ells. De fet, la disrupció de l’homeòstasi telomèrica provoca l’apoptosi de les cèl·lules germinals i/o la generació d’aneuploïdies, i està altament relacionada amb la senescència reproductiva. No obstant, poc se’n sap dels mecanismes encarregats de preservar l’estructura i longitud telomèrica al llarg de la gametogènesi dels mamífers. Per aquest motiu, tenint en compte que TERRA és un component integral de l’estructura telomèrica, i que la telomerasa és el complex enzimàtic que allarga els telòmers, en aquest treball es va plantejar l'estudi de la implicació d’aquestes dues molècules en la preservació de l’homeòstasi dels telòmers en les cèl·lules germinals de mamífer. Amb aquest objectiu, es van analitzar cèl·lules germinals humanes i de ratolí al llarg de la gametogènesi mitjançant tècniques citogenètiques i moleculars. Els nostres resultats mostraren que tant TERRA com el component proteic de la telomerasa (TERT) es localitzaven als telòmers de les cèl·lules germinals. La distribució nuclear de TERRA estaria subjecta a un llindar dependent dels nivells cel·lulars de TERRA i del gènere de la cèl·lula (oòcit o espermatòcit), mentre que la transcripció de TERRA dependria de l’estadi de la gametogènesi i de l’estat del mateix telòmer. D’altra banda, TERT es trobava majoritàriament als telòmers de les cèl·lules germinals, sobretot en ratolí, tot i que no s’observà l’elongació dels telòmers al llarg de la gametogènesi. Alhora, la (baixa) co-localització entre TERRA i TERT als meiòcits humans i de ratolí es produïa majoritàriament fora del complex telomèric. De la mateixa manera, es va analitzar la distribució de TERRA i TERT en espermatòcits de pacients diagnosticats amb infertilitat idiopàtica d’origen no obstructiu, els quals mostraren un menor nombre d’esdeveniments de recombinació en comparació amb els espermatòcits control. S’observà una reducció en els nivells de TERRA conjuntament amb una disrupció de la distribució telomèrica de TERRA i TERT en les cèl·lules dels individus infèrtils: mentre TERRA tendia a localitzar-se als telòmers, TERT tendia a dissociar-se’n. No obstant, ni el nombre de repeticions telomèriques ni l’associació de TERRA i TERT es veien afectades. Per tant, en base als nostres resultats, proposem que TERRA i TERT s’associarien amb els telòmers de les cèl·lules germinals humanes i de ratolí per tal de participar en el manteniment de l’estabilitat de l’estructura telomèrica durant els complexos esdeveniments cromosòmics que tenen llocs durant la meiosi i la gametogènesi. Alhora, donat que l’homeòstasi d’aquestes dues molècules es veu alterada a les cèl·lules germinals de pacients infèrtils, el seu anàlisi en meiòcits, conjuntament amb d’altres paràmetres, podria ser útil per a la determinació de l’origen de la infertilitat humana. / Telomeres are ribonucleoprotein complexes, composed by TTAGGG tandem repeats, a telomere-specific protein complex (shelterin) and telomeric noncoding RNA (TERRA) that cap the ends of eukaryote chromosomes preventing them from genomic instability and fusions. In mammalian germ cells, the maintenance of the telomeric structure is crucial for the proper progression of gametogenesis since telomeres are involved in homologous chromosomes pairing during the meiotic prophase I, also promoting their synapsis and recombination. In fact, disruption of telomere homeostasis leads to germ cells apoptosis and/or aneuploidy, and has been strongly related to reproductive aging. However, little is known on the mechanisms preserving telomere structure and length during mammalian gametogenesis so far. Thus, taking into account that TERRA is an integral component of the telomeric structure, and that telomerase is the enzymatic complex that elongates telomeres, the main objective of this work was to investigate whether these two molecules are implicated in the preservation of telomere homeostasis of mammalian germ cells. To this aim, mouse and human germ cells were analyzed by cytogenetic and molecular techniques throughout gametogenesis. Our results showed that both TERRA and the protein component of telomerase (TERT) localized at telomeres of germ cells. The distribution of TERRA in the nucleus would be subjected to a threshold that would depend on TERRA cellular levels and the cell gender (i.e. oocyte or spermatocyte), whereas TERRA transcription would be regulated according to the gametogenic stage and the telomere status per se. On the other hand, TERT highly localized at germ cells telomeres, especially in mouse, although no telomere elongation was observed in these cells throughout gametogenesis. Moreover, (scarce) TERRA and TERT co-localization occurred out of the telomeric complex in mouse and human meiocytes. In the same way, TERRA and TERT distribution was analyzed in human spermatocytes from patients diagnosed with idiopathic non-obstructive infertility, which showed fewer recombination events compared to spermatocytes of a control donor. A reduction in TERRA levels together with a disruption of the telomeric distribution of TERRA and TERT was observed in cells of infertile individuals. While TERRA was prone to localize at telomeres, TERT tended to dissociate from them. Nevertheless, neither the number of telomeric repeats nor TERRA-TERT association was affected in spermatocytes of infertile patients. Therefore, in the light of our results, we propose that TERRA and TERT would associate with telomeres of mouse and human germ cells to participate in the maintenance of the stability of telomere structure during the complex chromosome events taking place throughout meiosis and gametogenesis. Moreover, since the homeostasis of these two molecules is disrupted in germ cells from infertile patients, they could be useful to determine of the origin of human infertility by their analysis in meiocytes together with other parameters.

La guia axonal i la migració són dos processos similars i crucials per al desenvolupament. Aquests dos elements permeten el correcte posicionament cel•lular i la selecció de dianes essencial per a la funcionalitat posterior del sistema nerviós central, i es fonamenten en la regulació de l’avanç del con de creixement o la cèl•lula, respectivament, en resposta a estímuls externs, quimioatraients i quimiorepulsius, proporcionats per molècules de guia. Un altre component clau del funcionament neuronal és l’exocitosi, que permet la propagació dels estímuls nerviosos entre cèl•lules a través de la fusió de vesícules amb la membrana plasmàtica i l’alliberament de neurotransmissors. L’exocitosi està vehiculada per les proteïnes SNARE, que es troben a la membrana cel•lular i de la vesícula i que, a través de la unió paral•lela dels dominis catalítics, aproximen les membranes plasmàtica i vesicular possibilitant-ne la fusió Malgrat posseir la maquinària necessària per a l’exocitosi, les neurones en desenvolupament no presenten estructures especialitzades per a la transmissió del senyal com són les sinapsis, i es creu que el paper de les proteïnes del complex SNARE rau en el manteniment de la homeòstasi de membrana. Conceptualment, és fàcil pensar que la guia axonal i la migració actuïn a través del control precís de la dinàmica de la membrana, augmentant localment la superfície de la neurona i expandint-la en la direcció del creixement. En aquesta tesi hem investigat el paper de la dinàmica de membrana en la guia axonal i la migració. Concretament, ens hem centrat en l’estudi de la interacció del receptor de la Netrina-1 amb les proteïnes del complex SNARE en dos sistemes bàsics per a l’establiment de connexions del cervell: la guia dels axons de neurones de l’hipocamp i la migració de les neurones del llavi ròmbic atrets cap a una font de Netrina-1. També hem estudiat l’efecte del silenciament de les proteïnes del complex SNARE en dos paradigmes de guia axonal in vivo: la navegació dels axons de les cèl•lules comissurals de la medul•la espinal cap a, a través i més enllà de la línia mitja, i la innervació de l’extremitat inferior per part de les motoneurones d’embrions de pollastre. El tercer focus d’atenció ha estat l’estudi de la dinàmica de membrana i l’exocitosi al con de creixement de neurones d’hipocamp murí en resposta a estímuls quimioatraients de Netrina-1. Els resultats obtinguts durant aquesta tesi han demostrat que el receptor de la atractiu de la Netrina-1 DCC interacciona in vivo amb les proteïnes del complex SNARE Sintaxina1 i TI-VAMP, però no amb SNAP25 o VAMP2 en cèl•lules d’hipocamp i neurones migrants del llavi ròmbic inferior. A més, la interacció de DCC amb Sintaxina1 està regulada pel lligand, però l’exocitosi del receptor de Netrina-1 no es veu afectada per tractaments amb toxines que proteolitzen Sintaxina1. Hem descrit que les proteïnes del complex SNARE són imprescindibles per a la guia dels axons de neurones comissurals i motoneurones , perquè el silenciament de Sintaxina1, SNAP25, VAMP2 o TI-VAMP causa defectes en la navegació dels seus axons compatibles amb alteracions de diversos sistemes (molècula guia-receptor) de guia axonal. Per últim, hem descrit la dinàmica de membrana i l’exocitosi a nivell del con de creixement amb una tècnica innovadora, que permet la monitorització de l’exocitosi en temps real, i, i hem descrit com la Netrina-1 incrementa l’exocitosi dependent de proteïnes SNARE a nivell del con de creixement i les vies de senyalització que hi estan implicades. / Role of Synaptic Proteins and Exocytosis in Axon Guidance and Migration. Axon guidance and migration are two similar processes which are key to the development of the nervous system by allowing the correct localization and innervation of neurons. They regulate the elongation of the axon and the movement of cells by the use of guidance molecules which act as chemoattractants or chemorepellents at short and long ranges. A second crucial component in the nervous system functionality is exocytosis. It allows the communication of neighboring cells by the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane and the release of the vesicle contents to the extracellular space, a process mediated by the SNARE proteins. SNARE proteins located at the vesicle and the plasma membranes interact and bring the two membranes into close apposition, thereby facilitation fusion. Developing neurons have a vast array of synaptic proteins whose function is thought to reside in the regulation of membrane homeostasis. It is plausible to think that axon guidance and migration may act thru the precise control of membrane dynamics at discrete locations of the growth cone/leading edge, thereby expanding the neuron on the direction of growth. In this thesis we have analyzed the role of SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration. We have focused our studies in the analysis of the interaction between the guidance receptor DCC and SNARE proteins in the attraction of hippocampal axons and migrating neurons of the lower rhombic lip towards a Netrin-1 source. We have also studied the role of SNARE proteins in two axon guidance paradigms such as the navigation of commissural axons of the spinal cord and motoneurons. Furthermore, we have also investigated Netrin-1-induced exocytosis in growth cones using live imaging techniques. Our results demonstrate the necessary participation of SNARE proteins and SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration; reveal a ligand-regulated interaction between the Netrin-1 receptor DCC and the SNAREs Syntaxin1 and TI-VAMP; and show that Netrin-1 triggers SNARE-mediated exocytosis in the growth cone.