Annexina A6 (AnxA6) es una proteína de unión a fosfolípidos de membrana de forma dependiente de calcio. Está implicada en múltiples procesos celulares como la homeostasis de colesterol y el tráfico intracelular. Partiendo de que AnxA6 es una de las proteínas más abundantes en el hígado, representando el 0.25% del total, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio del papel de AnxA6 en este órgano a partir de ratones genoanulados para la proteína (AnxA6-/-). Teniendo en cuenta la fisiología y arquitectura comparable a los ratones WT de los hígados en ausencia de AnxA6, se procedió al estudio de AnxA6 durante el proceso de regeneración hepática tras la realización de una hepatectomía parcial (HP) de 2/3. Sorprendentemente, el 80% los ratones AnxA6-/- no sobrevivían más allá de las 72 horas post-HP. La regeneración hepática consiste en la activación de los hepatocitos por diversas citoquinas y factores de crecimiento que permiten la proliferación de las células hepáticas tras un daño hepático o una resección, como es el caso. En paralelo, el hígado y, el organismo en general, sufren una serie de adaptaciones metabólicas para mantener la homeostasis energética. El estudio del proceso de regeneración hepática demostró una menor expresión de las citoquinas TNFα e IL-6, encargadas de activar la transcripción de centenares de genes que podía estar compensada por una mayor activación del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Además, se observó cierto retraso en la acumulación de lípidos en el hígado, necesarios para hacer frente a la elevada demanda energética derivada de la intensa proliferación. Tras la HP, los ratones experimentan una hipoglucemia muy elevada fruto de la resección del 60% de la masa hepática, con lo que se reducen los almacenes de glucógeno y los hepatocitos con capacidad gluconeogénica. A diferencia de los ratones WT, los AnxA6-/- tenían una drástica y rápida caída de los niveles de glucosa en sangre que no retornaban a valores normales, sugiriendo un coma hipoglucémico como causa de la baja supervivencia. Además, el análisis de la glucosa en sangre en los ratones AnxA6-/-, hizo evidente que en ausencia de AnxA6, y ante un estrés metabólico, los ratones eran incapaces de mantener la homeostasis de glucosa. Mediante el ayuno de los ratones AnxA6-/-, se determinó que el problema en la homeostasis de glucosa no era debido ni a una señalización defectuosa por parte de las hormonas insulina y glucagón, ni por una disfunción en el almacén y degradación de glucógeno. Estos resultados centraban a la gluconeogénesis (GNG) como la causa que provoca la hipoglucemia. La GNG es el proceso mediante el cual se produce glucosa a partir de sustratos no glucídicos como lactato, aminoácidos y glicerol. Así, se descartó un problema en la expresión de las enzimas clave de la GN; glucosa-6-fosfatasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y fructosa-1,6-bisfosfatasa. En cambio, se observó una inhibición en la producción de glucosa a partir de alanina tanto in vivo en ratones hipoglucémicos como en hepatocitos aislados. La alanina es el principal sustrato de la GNG tanto en condiciones de ayuno como durante la regeneración hepática. Está inhibición se determinó debida a una deficiencia en la captación de alanina, tal como se observó en hepatocitos aislados. El transportador de aminoácidos SNAT2, uno de los principales transportadores de alanina, entre otros aminoácidos neutros, se ha descrito esencial durante la regeneración hepática y el ayuno. En estas situaciones se sobreexpresa el transportador y se transloca a la membrana plasmática de los hepatocitos. Tras el ayuno, los hepatocitos deficientes en AnxA6 no presentan niveles de SNAT2 en la membrana sinusoidal indicando un impedimento en el tráfico del transportador. Por último, se ha determinado mediante la técnica de pull down la interacción entre AnxA6 y SNAT2. De manera que se propone un mecanismo mediante el cual AnxA6 interacciona con SNAT2 dirigiéndolo a la membrana plasmática. Con estos resultados, hemos determinado la implicación por primera vez de AnxA6 en el metabolismo de la glucosa a través de alanina. Así, sugerimos que en ausencia de AnxA6, el transportador SNAT2 no se transloca a la membrana plasmática, quedando retenido en algún compartimento celular. De esta forma, se inhibe la GNG a partir de alanina impidiendo la producción de glucosa y provocando una situación de hipoglucemia, que en el caso de la HP podría llevar a la muerte del animal. / Annexin A6 (AnxA6) ) is a multifunctional calcium-dependent membrane binding protein involved in a plethora of different functions such as Ras-MAPK and PKCα signalling regulation, intracellular cholesterol homeostasis, actin-cytoskeleton and plasma membrane arrangement among others. Although AnxA6 is one of the major proteins in the liver (0.25% total protein), its function in the physiology of this organ remains unknown. After partial hepatectomy (PH) quiescent hepatocytes are triggered to progress through the cell cycle, showing a synchronous onset of DNA synthesis with a cellular response that involves cell activation and tissue remodelling. During this period of liver regeneration, the liver has to retain the major physiological tasks such as the synthesis and secretion of plasma proteins, lipid homeostasis and its metabolic function to ensure viability of the organism. The aim of the present study was to investigate the in vivo function of AnxA6 during liver regeneration using an AnxA6 knock-out (AnxA6-/-) mouse model. To this objective, 2/3 PH was performed in wild-type C57BL/6 control and AnxA6-/- mice. After PH, AnxA6-/- mice exhibit a dramatic reduction of survival rate (87.5% at 72h post-PHx). However, the exogenous administration of glucose before and during PH restored AnxA6-/- survival rate after PH, suggesting a link between AnxA6 and hepatic energetic metabolism. A comprehensive analysis of glucose metabolism experiments pointed to an impairment of liver gluconeogenesis in AnxA6-/- mice, also observed in starving mice. A biochemical approach allowed us to elucidate a role for AnxA6 in the intracellular trafficking of SNAT2, the main liver L-Alanine transporter, which is essential for gluconeogenic hepatic substrate uptake during liver regeneration and mice starvation. We conclude that AnxA6 is a new regulator of hepatic gluconeogenesis essential for the trafficking of the alanine transporter (SNAT2) into the hepatocyte sinusoidal plasma membrane and subsequent alanine uptake, the major gluconeogenic substrate during both liver regeneration and fasting.

En aquest estudi s'ha treballat amb diferents hipòtesis que avui en dia es consideren per explicar les causes de l'Esclerosi Lateral Amiotròfica.En primer lloc, s'ha estudiat la autoimmunitat sèriques (IgG) provinents de malalts d'ELA i d'altres malalties de la Motoneurona (MN). Tractant embrions de pollastre amb sèrums i IgG de pacients afectats per ELA s'obté un rescat significatiu en el nombre de la MN de la banya ventral de la medul·la espinal lumbar que d'altra manera moririen en un procés de mort cel·lular programada per apoptosi i un augment significatiu de la ramificació nerviosa en la musculatura inervada per aquestes MN. S'ha detectat la unió de les IgG a proteïnes del sistema nerviós de l'embrió de pollastre i s'ha identificat com a antígen una proteïna implicada en la regulació i la quimiotaxis del sistema nerviós embrionari, la Semaforina. No sabem, per ara, la significació d'aquests anticossos anti Sema 3A circulants en els pacients de malalts d'ELA ni la seva relació amb la patogènia de la malaltia.En segon lloc, s'ha traballat amb l'aspecte genètic de la malaltia. Utilitzant rosegadors transgènics amb una mutació en el gen de la SOD1 s'ha comprovat que diferents tipus de cèl·lules nervioses d'animals trangènics en estadis avançats de la malatia mostren ractivitat cap a l'anticòs anti P2X4. A part de la reactivitat mostrada en MNs degenerades al còrtex celebral i tronc de l'encèfal d'animals trangènics, fet que concorda amb l'afectació clàssica descrita en la ELA, s'ha vist també reactivitat a cèl·lules de Purkinje cerebelars.Posteriorment s'ha comprovat que aquesta reactivitat és deguda a un reconeixement per part d'aquest anticòs de formes mal plegades de la proteïna SOD1, formes que es van acumulant a mesura que la malaltia avança i que la neurona degenera. Aquestes formes malplegades de SOD1 s'ha comprovat que són capaces de d'activar la microglia in vivo en nivells significativament superiors que la proteöna SOD1 nativa.Per últim, s'ha estudiat l'efecte de la transfecció amb proteïna SOD1 mutada i fenomens autofàgics dins del model de línia cel·lular neuroal NSC-34. Tot i que s'ha comprovat que en aquest model no es repeteixen els resultats obtinguts per l'anticòs anti P2X4 en models de rosegadors transgènics, s'ha pogut estudiar l'autofàgia i l'efecte beneficiós del liti en aquest model, veient-se que el liti és capaç de disminuir el nombre d'agregats de SOD1 en aquest model quan les cèl·lules són transfectades amb diferents tipus de SOD1 mutada.

EN CATALÀ:L'acceptació indefinida dels òrgans trasplantats mantenint el correcte funcionament de l'empelt sense necessitat d'administrar l'agressiu tractament immunosupressor constitueix el principal objectiu de la investigació clínica en el camp del trasplantament. Tot i que aquest fenomen s'observa amb freqüència en models animals, la tolerància immunològica a l'empelt en essers humans es redueix a un limitat grup de pacients, principalment en trasplantats hepàtics, considerats tolerants operacionals.L'objectiu de l'estudi és precisament la caracterització immunològica dels pacients operacionalment tolerants desprès del trasplantament de fetge. L'anàlisi descriptiu dels diferents paràmetres immunològics en sang perifèrica, mitjançant citometria de flux i expressió genètica, permetria delimitar la contribució de les principals subpoblacions immunològiques en l'acceptació de l'empelt hepàtic i els possibles mecanismes moleculars responsables del procés de tolerància.Els receptors hepàtics tolerants mostren un major numero de limfòcits reguladors CD4+CD25+CD62Lhigh Foxp3+ que els pacients no tolerants, però no que els controls sans, evidenciant la possible interacció dels fàrmacs immunosupressors en els limfòcits T reguladors. Així mateix, els pacients tolerants exhibeixen una proporció de limfòcits gammadelta superior, i una inversió en el quocient de les subpoblacions delta1+/delta2+ respecte als receptors dependents de immunosupressió i els controls, conseqüència de l'expansió del subtipus limfocitari Vdelta1.L'anàlisi de l'expressió genètica de sang perifèrica manifesta diferencies significatives en el patró d¡expressió dels pacients tolerants respecte als receptors no tolerants i controls sans. Aquests canvis transcripcionals varen ser validats amb mostres independents mitjançant PCR a temps real i a nivell proteic mitjançant citometria de flux. Els resultats revelen un increment en l'expressió de gens relacionats amb cèl·lules NK i limfòcits gammadelta, suggerint un paper central del sistema immune innat en el manteniment de l'estat de tolerància.L'estudi realitzat no solsament proporciona un major coneixement dels mecanismes relacionats en la tolerància hepàtica, també suggereix que l'ús de biomarcadors, com el patró d'expressió genètica en sang perifèrica, podria ser utilitzat com a test diagnòstic en la practica clínica per identificar receptors tolerants a qui es pot retirar la teràpia immunosupressora.

El experimento T2K es un experimento de neutrinos de largo recorrido que utiliza un haz casi puro the neutrinos muónicos. El objetivo principal del experimento es a medida de los parámetros de oscilación del neutrino muónicos. Para conseguir éste objetivo, T2K necesita una rigurosa predicción del índice de interacciones en el detector lejano, Super-KamiokaNDE. El detector cercano de T2K, ND280, calcula el índice de interacciones y estima el número de eventos en el detector lejano. Las interacciones de neutrino muónico de corriente cargada en el detector cercano (ND280) son usadas para predecir el índice de eventos en el detector lejano (Super-KamiokaNDE). Para una mejor restricción de los parámetros de sección eficaz, los cuales dominan el análisis junto con las incertezas de la prediccion del flujo, categorizamos los eventos seleccionados en tres grupos de acuerdo con el número de piones en el estado final. Estas tres categorías permiten un mejor ajuste de la señal del canal de oscilación (Corriente Cargada Quasielástica) y el principal ruído en oscilaciones (Corriente Cargada de 1 Pión Cargado). Actuales y futuros experimentos de neutrinos están limitados por las incertezas en las secciones eficaces de neutrinos. Los modelos actuales de sección eficaz están en tension con los datos experimentales en algunos rangos energéticos. Esto hace que sea critico estudiar secciones eficaces de neutrino--nucleo en todos los canales de interacción posibles. La producción the un solo pión en interacciones de neutrino muónico de corriente cargada es uno de los principales canales en tensión con los modelos. Como segunda contribución, presentamos el cálculo de producción the un solo pión en interacciones de neutrino muónico de corriente cargada usando un enfoque indepenediente del modelo explorando la capacidad total del detector ND280 para establecer las distribuciones cinemáticas del evento. La mejore del conocimiento de las interacciones, y en concreto del canal de producción de un sólo pión, permitirá la reducción de las incertidumbres sistemáticas en el análisis de oscilaciones. / The T2K experiment is a long baseline neutrino experiment which utilizes an almost pure muon neutrino beam. The main goal of the experiment is the measurement of the oscillation parameters of the muon neutrinos. In order to achieve this goal, T2K requires an accurate prediction of the interaction rates in the far detector, Super-KamiokaNDE. The near detector of T2K, ND280, measures the interaction rates and estimates the number of events at the far detector. The muon neutrino charged current interactions in the near detector (ND280) are used to predict the rate at the far detector (Super-KamiokaNDE). To a better constrain of the cross section parameters, which are dominant in the analysis together with the flux uncertainty, we categorize the selected events in three different samples according to the number of pions in the final state. These categories allow for a better constrain of the oscillation signal channel (Charged Current Quasielastic) and the main oscillation background (Charged Current 1 Charged Pion). Current and future neutrino experiments are limited by neutrino cross section uncertainties. The actual cross section models are in tension with the experimental data in some energy ranges. It is still critical to study neutrino-nucleus cross sections on all possible interaction channels. The muon neutrino charged current single pion production is one of the main channels in tension with the model. As a second contribution, we present the measurement of the Charged Current single positive pion production cross section using a model independent approach exploring the full capability of the ND280 detector to determine the kinematical distributions of the event. The improved knowledge of the interactions, and in concrete for the single pion channel, will allow the reduction of the the systematical uncertainties in the oscillation analysis.

La malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) és un procés patològic lent i progressiu caracteritzat per l'obstrucció permanent, i no totalment reversible, del flux d'aire als bronquíols i de l'increment de la compliància del pulmó com a resultat de la presència d'emfisema. L'origen de l'MPOC s'associa a una exposició crònica a gasos nocius i partícules, sobretot, al fum del tabac. Malgrat això, les causes de la patologia són multifactorials, i poden incloure tant trastorns genètics com factors ambientals.Els principals trets anatomopatològics de l'MPOC són l'engruiximent de la paret i el remodelatge tissular dels bronquíols i la destrucció emfisematosa del parènquima pulmonar. Malgrat que aquestes lesions histològiques són diferents, les cèl·lules inflamatòries implicades en ambdós processos són les mateixes. Davant d'aquest fet, el primer objectiu de la meva tesi va ser determinar si aquests dos fenotips histopatològics estan relacionats amb dos perfils limfocitaris diferents.D'altra banda, malgrat que la progressió de l'MPOC s'ha associat amb la presència de fol·licles limfoides pulmonars, no hi ha dades disponibles sobre la densitat de les cèl·lules inflamatòries que formen aquestes estructures en l'àmbit de la malaltia. A més, també es desconeixen tant el patró de vascularització com l'expressió d'adrecines dels fol·licles limfoides pulmonars en l'MPOC. En conseqüència, el segon objectiu de la tesi va ser analitzar la prevalença, l'estructura, la localització, la vascularització i la proliferació/apoptosi cel·lulars dels fol·licles limfoides pulmonars en l'MPOC. Paral·lelament, també es van estimar les densitats fol·liculars dels limfòcits B i T, així com dels macròfags, de les cèl·lules dendrítiques i de les cèl·lules CD57+ en aquestes estructures.Per tal d'assolir aquests objectius es van aplicar tècniques immunohistoquímiques i morfomètriques sobre teixit pulmonar procedent de 9 pacients no fumadors, de 18 fumadors sense l'MPOC, de 16 fumadors amb MPOC moderada i de 16 pacients amb MPOC molt greu sotmesos a un trasplantament bipulmonar.Els resultats obtinguts demostren que els individus amb MPOC molt greu tenen una densitat de limfòcits T CD3+ i de limfòcits B significativament major als bronquíols en comparació amb el parènquima pulmonar. A més, els malalts d'MPOC presenten una densitat de limfòcits T CD8+ a l'epiteli bronquiolar significativament incrementada en comparació amb els individus no fumadors. Finalment, malgrat que la densitat parenquimàtica de limfòcits T CD8+ també es troba incrementada en els malalts d'MPOC, les densitats tant de limfòcits T CD8+ com de limfòcits B són similars en comparar el parènquima periemfisematós amb aquelles zones de parènquima no afectades per l'emfisema.Pel que fa als fol·licles limfoides pulmonars, els resultats mostren una densitat fol·licular de cèl·lules CD57+ significativament major en els pacients d'MPOC quan se'ls compara amb els individus no fumadors i amb els fumadors sense l'MPOC (p < 0,05). A més, el percentatge de perfils fol·liculars que presenten apoptosi també és significativament major en els malalts d'MPOC (p = 0,03). D'altra banda, no s'observen diferències significatives entre grups quant a les densitats fol·liculars de la resta de cèl·lules inflamatòries, ni tampoc quant a la distribució de vasos sanguinis o limfàtics en aquestes estructures.Així, els resultats presentats en aquest tesi corroboren l'existència d'un patró inflamatori bronquiolar en l'MPOC, que es caracteritza per la presència d'infiltracions mononuclears i de remodelatge tissular. No obstant això, el teixit parenquimàtic mostra una infiltració de limfòcits T CD8+ més lleu, la qual, a més, no es relaciona espacialment amb les zones de destrucció emfisematosa. D'altra banda, donat que les cèl·lules CD57+ són uns efectors importants de la resposta citotòxica i de la regulació immunitària, l'increment de la densitat fol·licular d'aquestes cèl·lules dóna suport a la hipòtesi que postula l'existència d'una disfunció immunitària local en l'MPOC. / In COPD, the histological lesions at both the small airways and lung parenchyma (wall thickening and tissue remodeling and emphysematous destruction, respectively) are definitely different. However, the inflammatory cells involved in both processes are the same. Moreover, although the presence of pulmonary lymphoid follicles (LF) has been associated with the progression of the disease, there is no information about the pattern of vascularization, expression of addressins or inflammatory cell densities within these structures in COPD.Histological and immunohistochemical techniques were used to assess the distribution and cell density of CD3+, CD4+, CD8+ and B lymphocytes in small airways and parenchymal interstitium of 9 non-smokers, 18 smokers without COPD, 16 smokers with moderate COPD and 16 patients with very severe COPD. Also, the prevalence, structure, localization, vascularization and cell proliferation/apoptosis of LF, as well as the follicular density of the main inflammatory cells were assessed in our series. The results of this study showed that CD3+ and B cell densities were significantly higher in small airways than parenchyma interstitium of very severe COPD patients. Furthermore, CD8+ cells were increased in the epithelium of airways of moderate COPD patients compared to non-smokers. Although CD8+ cell density was increased in parenchyma of COPD patients, CD8+ and B cell densities were similar when comparing periemphysematous and non-emphysematous alveolar interstitium. Regarding LF, those of COPD patients showed a significantly higher density of CD57+ cells. Moreover, the percentage of LF profiles with cell apoptosis was also significantly higher in COPD patients. On the contrary, no significant differences among groups were observed in the follicular densities of other inflammatory cells, nor in the distribution of blood and lymphatic vessels within LF.These results suggest that, although the small airways' wall of COPD patients shows a clear inflammatory pattern, with a high mononuclear infiltration and tissue remodeling, the parenchymal interstitium shows a milder CD8+ infiltration which, moreover, is not spatially related to emphysematous destroyed areas. Moreover, since CD57+ cells are important effectors of cytotoxicity and immune regulation, an increase of their follicular density supports the hypothesis of a local immune dysfunction in COPD.KEYWORDS: cigarrette smoking, lung inflammation, emphysema, inflammatory cells, lymphoid follicles

L'obesitat s'ha convertit en un problema sanitari important a nivell mundial, i és important poder-hi trobar solucions. El tungstat, tal i com han demostrat els diversos estudis desenvolupats en el nostre laboratori, és un fàrmac amb un gran potencial en el tractament de l'obesitat. Tot i haver-se descrit àmpliament els diversos efectes del tungstat en diferents models experimentals, el mecanisme d'acció n'és encara desconegut. Els resultats preliminars indiquen que la leptina i la seva via de senyalització juguen un paper important en les accions del tungstat sobre l'homeòstasi energètica. Donat que l'hipotàlem és una de les dianes més importants de la leptina i que és des d'aquí on aquesta hormona regula el balanç energètic, la nostra hipòtesi de treball és que el tungstat desenvolupa part de les seves accions a aquest nivell per poder regular el guany de pes corporal i la ingesta dels animals tractats. Amb la intenció de veure si el tungstat tenia efectes centrals directes, es va administrar una injecció via intraperitoneal de tungstat de sodi a rates wistar, i se'n van mesurar els nivells detectables a líquid céfaloraquidi mitjançant espectrometria de masses. Els resultats van mostrar que el tungstat passa la barrera hematoencefàlica. El segon punt va ser veure que quan el tungstat s'administra per via central (injecció intracerebroventricular al tercer ventricle de l'hipotàlem), dóna lloc a la reducció del guany de pes i la ingesta dels animals tractats, i també incrementa els nivells de fosforilació de les principals proteïnes de la via de la leptina: JAK2, AKT i ERK1/2, mostrant que el tungstat té efectes centrals directes. In vitro, es va tractar la línia cel·lular hipotalàmica N29 amb tungstat 100µM o leptina 1nM. El tungstat va incrementar la fosforilació de les proteïnes JAK2, ERK1/2 i AKT, però l'activació de cada una d'aquestes cinases no depenia de cap de les altres, mostrant que els seus efectes són independents. A més, el tractament amb tungstat regula l'expressió gènica de c-myc a través de la seva acció sobre la via JAK/STAT, i l'expressió de c-fos i Agrp a través de l'acció sobre la via ERK1/2, amb dos efectes altre cop independents.Es van realitzar estudis de proteòmica, comparant els nuclis hipotalàmics ARC, PVN i LHA entre animals prims i obesos, tractats i no tractats amb tungstat per via oral. Els resultats van mostrar que el tractament amb aquesta molècula altera l'expressió de diferents proteïnes, moltes d'elles involucrades amb la plasticitat neuronal i el creixement axonal, suggerint un rol important de la molècula en aquestes accions. Tenint en compte que en l'obesitat, les connexions neuronals entre els diferents nuclis hipotalàmics són defectives, aquest resultat és molt prometedor.Tots els resultats exposats suggereixen que el tungstat de sodi actua, en alguns aspectes, com un mimètic de la leptina a nivell neuronal, modulant la via de transducció del senyal de l'hormona i possiblement, modulant la plasticitat neuronal. Aquests efectes obririen noves vies pel tractament de l'obesitat. / Sodium tungstate is an antiobesity drug targeting peripheral tissues, but also modulates hypothalamic gene expression when orally administered, raising the possibility of a direct effect of sodium tungstate in the central nervous system. To assess whether sodium tungstate could have direct central effects, first, we administered a single intraperitoneal injection of sodium tungstate to wistar rats and its levels were measured in cerebrospinal fluid through mass spectrometry. Sodium tungstate crossed the blood brain barrier, reaching a concentration of 1.31±0.07 mg/l in cerebrospinal fluid 30 min after ip injection. Second, when centrally administered (a single intracerebroventricular injection into the third ventricle) sodium tungstate decreased body weight gain and food intake and increased the phosphorylation state of the main kinases and proteins involved in leptin signalling. In vitro, N29/4 neural cells were treated with 100µM sodium tungstate or 1nM leptin. Sodium tungstate increased the phosphorylation of janus kinase-2 (JAK2), extracellular signal-regulated kinase-1/2 (ERK1/2) and protein kinase-B (AKT), but the activation of each kinase did not depend on each other. Thus, it regulated c-myc gene expression through the JAK2/STAT system and c-fos and agrp gene expression through the ERK1/2 pathway simultaneously and independently. Proteomic studies were also performed, comparing the ARC, PVN and LHA hypothalamic nuclei from lean, obese and treated with sodium tungstate (orally) or not treated animals. The results show that treatment alters many different proteins, some of them involved in neuronal plasticity and axonal growth.All these data demonstrate that sodium tungstate had direct neural effects activating the leptin signalling pathway and increasing the activity of several kinases involved in the leptin signalling system in an independent way. Sodium tungstate also alters the expression of different proteins involved in neuronal plasticity, making it a suitable candidate to repair the neuronal connections altered because of the obesity. All these results present sodium tungstate as a suitable and promising candidate for improving central leptin sensitivity and managing obesity.

El tema de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos de neurodegeneración asociados al envejecimiento cerebral y el papel que desempeñan los astrocitos como neuroprotectores utilizando modelos animales in vitro e in vivo.Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y su función es muy importante, además de dar soporte trófico a las neuronas tienen una función anticitotóxica y modulan la actividad neuronal. El papel de los astrocitos y su activación en el envejecimiento es un proceso poco conocido. Un mayor conocimiento de esta célula glial puede ayudarnos a entender los cambios fisiopatológicos que conlleva el paso de los años en el cerebro humano. El envejeciemiento cerebral es un factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas y en esta tesis se ha estudiado especialmente la enfermedad de Alzheimer por su alta incidencia en la población de edad avanzada.En esta tesis hemos establecido y caracterizado dos modelos para el estudio del envejecimiento de los astrocitos in vitro y hemos evaluado su capacidad neuroprotectora.Primero hemos evaluado los cambios en el estrés oxidativo, la captación de glutamato y la expresión proteica en astrocitos corticales de rata en cultivos de 10 y 90 días in vitro (DIV). Observamos un aumento de estrés oxidativo e inflamación con generación de especies reactivas de oxígeno y una disminución de la actividad mitocondrial a los 90 DIV.La expresión de las proteínas nitrosiladas, la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD-1), la hemoxigenasa 1 (HO-1) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en los astrocitos envejecidos. La captación de glutamato en los astrocitos de 90 DIV era mayor que en los astrocitos de 10 DIV probablemente debido a la regulación al alza del transportador glutamato/aspartato. Los astrocitos envejecidos tenían una menor capacidad de mantener la supervivencia neuronal. Estos hallazgos indican que los astrocitos pueden perder en parte su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. En nuestro segundo modelo hemos estudiado los cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en cultivos primarios de astrocitos de la corteza de ratones neonatos de senescencia acelerada SAMP8 comparados con los de ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Hemos demostrado un incremento de la hiperfosforilación de tau y de actividad de quinasa de Gsk3&#946; y Cdk5, que regulan la fosforilación de tau, en los astrocitos de SAMP8. La inhibición de Gsk3&#946; por litio o la de Cdk5 por roscovitina reducen la fosforilación de tau en Ser396. Además, hemos detectado un aumento de estrés oxidativo y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial en los astrocitos de los ratones SAMP8. Los astrocitos SAMP8 muestran una disminución en la captación de glutamato comparada con la de los controles SAMR1. Interesantemente, la supervivencia de las neuronas SAMP8 y SAMR1 en cocultivo con astrocitos SAMP8 estaba reducida de manera significativa. Nuestros resultados sugieren que estas preparaciones in vitro son adecuadas para el estudio a nivel molecular y celular de los procesos subyacentes en el envejecimiento temprano de este modelo murinoAdemás hemos estudiado la función neurotrófica de los astrocitos observando si un aumento de su capacidad neurotrófica mejora la funcionalidad neuronal en el envejecimiento. El factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento.Por último hemos estudiado in vitro e in vivo si en un ambiente de estrés oxidativo, como se produce durante el envejecimiento, los astrocitos tienen una respuesta más elevada al péptido betamieloide.La neurotoxicidad por el péptido betamieloide (A&#946;) está propuesto como el primer paso de una cascada de eventos perjudiciales para la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los efectos tóxicos del A&#946; sobre los astrocitos podrían contribuir a desarrollar cambios neurodegenerativos que conducen a la EA. Hemos estudiado los efectos de A&#946;42 sobre ls cultivos de los astrocitos humanos en la presencia o ausencia de los agentes prooxidantes como butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor de síntesis glutatión y FeSO4 que libera hierro redox activo. Condiciones prooxidantes potenciaron la toxicidad del A&#946;, que se demostraron por la generación de radicales libres, cambios inflamatorios y apoptosis en los astrocitos humanos. Un tratamiento similar fue ensayado en la rata in vivo. Una mezcla del A&#946;40 y A&#946;42 o sólo del A&#946;42 fue infundida intracerebroventricularmente durante 4 semanas. Otros grupos animales eran simultáneamente infundidos con BSO y Fe. Un análisis realizado 4 meses más tarde mostró un mayor deterioro cognitivo en el laberinto acuático de Morris con el tratamiento de A&#946; conjuntamente con los tratamientos con agentes prooxidantes. Agentes prooxidantes también potenciaron la patología del tejido cerebral, así los estudios histológicos mostraron una mayor reactividad astroglial, depósitos de A&#946; y daño oxidativo en las neuronas hipocámpicas sensibles a EA. / The subject of this thesis has been the study of neurodegeneration mechanisms associated with the aging brain and the role played by the astrocytes as neuroprotective using animal models in vitro and in vivo. In the first study, we evaluate the neuroprotective capacity of astrocytes in an in vitro experimental model of aging.Changes in oxidative stress, glutamate uptake and protein expression were evaluated in rat cortical astrocytes cultured for 10 and 90 days in vitro (DIV). Aged astrocytes had a reduced ability to maintain neuronal survival. These findings indicate that astrocytes may partially loose their neuroprotective ability during aging. In the next study, we examine changes in tau phosphorylation, oxidative stress and glutamate uptake in primary cultures of cortical astrocytes from neonatal senescence-accelerated prone mice (SAMP8) and senescence-accelerated resistant mice (SAMR1). Our findings suggest that this in vitro preparation is suitable for studying the molecular and cellular processes underlying early aging in this murine model.In the next study glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) was assayed for its neurotrophic effects against the neuronal atrophy that causes cognitive deficits in old age. Aged Fisher 344 rats with impairment in the Morris water maze received intrahippocampal injections of either a lentiviral vector encoding human GDNF in astrocytes or the same vector encoding human green fluorescent protein as a control. Astrocyte-secreted GDNF enhanced neuron function as shown by local increases in synthesis of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine and serotonin. Spatial learning and memory testing showed a significant gain in cognitive abilities due to GDNF exposure, whereas control-transduced rats kept their performance at the chance level. These results confirm the broad spectrum of the neurotrophic action of GDNF and open new gene therapy possibilities for reducing age-related neurodegeneration.Finally we studied the effects of A&#946; on cultures of human astrocytes in the presence or absence of pro-oxidant agents. Pro-oxidant conditions potentiated A&#946; toxicity, as shown by the generation of free radicals, inflammatory changes and apoptosis. A similar treatment was assayed in rats in vivo. Pro-oxidant agents also potentiate brain tissue pathology. This was demonstrated in histological studies that showed highly increased astrocyte reactivity in AD-vulnerable areas, A&#946; deposits and oxidative damage of AD-sensitive hippocampal neurons.

L'escorça prefrontal (EPF) és necessària per dur a terme funcions cerebrals superiors com la presa de decisions, la memòria de treball o l'atenció. S'han descrit diferents alteracions anatòmiques i funcionals en aquesta regió cerebral en malalties psiquiàtriques com l'esquizofrènia i la depressió.El receptor 5-HT(1A) té una funcionalitat dual actuant com a autoreceptor en les dendrites i el soma de les neurones serotoninèrgiques i com a heteroreceptor en àrees postsinàptiques com l'EPF i l'hipocamp. Ha estat implicat en la fisiopatologia de diferents malalties psiquiàtriques, entre elles, l'esquizofrènia o la depressió. Per aquest motiu la modulació del receptor 5-HT(1A) sembla ser una possible diana terapèutica per aquest tipus de trastorns.Els objectius de la present tesi són estudiar els efectes d'agonistes del receptor 5-HT(1A) (clàssics -8-OH-DPAT- i de nou desenvolupament -F15599, F13640) sobre l'activitat de l'EPF tant a nivell neuronal com poblacional i caracteritzar les subpoblacions de receptors implicades en els efectes provocats per aquests agonistes. A més, caracteritzar en models animals un nou antagonista del receptor 5-HT(1A) (DU 125530) per validar la seva possible aplicació per la potenciació del tractament antidepressiu.Per dur a terme els objectius plantejats es van utilitzar tècniques electrofisiològiques de registre extracel·lular unitari i registres del potencial de camp en animal anestesiat a més d'estudis de microdiàlisi intracerebral.Les conclusions obtingudes en la present tesi són:1. Agonistes del receptor 5-HT(1A) amb diferent estructura química provoquen majoritàriament, però amb patrons de resposta distintius, excitacions de les neurones piramidals d'EPF mitjançant un mecanisme depenent de circuit que implica les interneurones GABAèrgiques de la mateixa EPF. Aquesta excitació podria facilitar la neurotransmissió dels nuclis aminèrgics mesencefàlics a aquesta àrea i afavorir l'activitat de l'EPF en tasques com la memòria de treball.2. Els diferents agonistes 5-HT(1A) emprats en la present tesi (8-OH-DPAT, F15599 i F13640) inhibeixen les neurones serotoninèrgiques del nucli del rafe dorsal però actuen amb diferent potència relativa sobre els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics vs. els autoreceptors presinàptics. Així, dels tres fàrmacs testats, l'F15599 mostra un perfil novedós amb una acció preferent sobre els heteroreceptors corticals comparat amb l'F13640 i la 8-OH-DPAT. L'eficàcia de l'F15599 en models animals de depressió i dèficits cognitius el fa interessant per al tractament de malalties psiquiàtriques, evitant els efectes secundaris produïts per activació de l'autoreceptor.3. El DU 125530 és un antagonista del receptor 5-HT(1A) molt potent en models animals, capaç d'antagonitzar tant respostes a nivell d'autoreceptor com a nivell d'heteroreceptor postsinàptic. Aquest fàrmac permet potenciar l'augment de serotonina produït per antagonistes selectius de la recaptació de serotonina però també bloqueja els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics. Així, l'augment de funció serotoninèrgica produït pel bloqueig dels autoreceptors sembla que no es tradueix en un major efecte antidepressiu possiblement degut al bloqueig dels receptors 5-HT(1A) postsinàptics.4. A part de les diferències regionals en la funcionalitat del receptor 5-HT(1A) ja conegudes, la present tesi planteja possibles diferències a nivell cel&#8729;lular entre subpoblacions de receptors 5-HT(1A) situats en tipus neuronals diferents (piramidals vs. GABAèrgiques i vs. serotoninèrgiques). El disseny de fàrmacs amb capacitat d'actuar preferentment sobre els receptors situats en tipus cel·lulars determinats podria ser una estratègia interessant pel tractament de malalties psiquiàtriques. / The 5-HT(1A) receptor is an inhibitory receptor acting as autoreceptor in serotonergic neurons and as heteroreceptor at postsynaptic areas such as the prefrontal cortex (PFC). The PFC has shown to be a key area for cognitive processes such as working memory or attention and is altered in different psychiatric disorders, such as schizophrenia and depression. Moreover, the 5-HT(1A) receptor seems to be involved in the physiopathology and etiology of psychiatric disorders, suggesting that the modulation of this receptor could be an interesting strategy for the treatment of schizophrenia and depression. This thesis is based in the hypothesis that proposes that psychoactive drugs modulate cortico-mesencephalic circuitries involving PFC and mesencephalic monoaminergic nuclei. Specifically, 5-HT(1A) receptors of PFC may have a key role in this modulation. Under this hypothesis, the general aim of the thesis was to study the effects of 5-HT(1A) agonists and antagonists on the unitary and population activity of PFC and raphe nuclei.To carry out this work, we performed single unit and local field potential recordings as well as intracerebral microdialysis studies in anaesthetized animals.The main conclusions of this study are:- 5-HT(1A) agonists cause mainly excitations on PFC pyramidal neurons through a mechanism involving PFC GABAergic interneurons. This excitation could facilitate monoaminergic neurotransmission to PFC and favor PFC activity in cognitive tasks.- Different 5-HT(1A) agonists display different relative potency modulating the activity of PFC vs. raphe neurons. Whereas classical agonists act preferentially on serotonergic neurons, F15599 can modulate preferentially the activity of PFC pyramidal neurons, showing interesting characteristics for the treatment of depression and cognitive/negative symptoms in schizophrenic patients.- Despite DU125530 is a potent 5-HT(1A) antagonist in animal models, antagonizing effects at presynaptic and postsynaptic levels and potentiating the increase of serotonin induced by SSRIs, it's not able to improve antidepressant treatment when administered with fluoxetine to depressed patients.- Besides the regional differences in 5-HT(1A) receptor functionality already known, the thesis suggests possible differences at the cellular level among 5-HT(1A) receptors of different cell types. Designing drugs targeting preferentially specific cell types could be an interesting strategy for the treatment of psychiatric disorders.

La aterosclerosis, engrosamiento de la pared arterial, puede progresar gradualmente hasta complicarse con la aparición de un trombo ocasionando una obstrucción brusca de una arteria con obliteración del flujo en el órgano irrigado por dicha arteria. Según su localización, esta oclusión puede dar lugar a un accidente cerebrovascular (CVA), una obstrucción arterial periférica o a un síndrome coronario agudo (ACS). Dentro de los ACS podemos encontrar la angina inestable, el infarto agudo de miocardio con y sin elevación de ST y la muerte súbita. Estas manifestaciones agudas de la enfermedad cardíaca comparten un mismo fenómeno patofisiológico: la aterotrombosis coronaria y resultan de una isquemia aguda del miocardio. Aunque se han producido grandes avances en el tratamiento de esta enfermedad, la medicina actual no es capaz de predecir el riesgo de sufrir patología cardiovascular. Pese a la gran influencia de los factores de riesgo clásicos tales como la dislipemia, la diabetes, la hipertensión y la obesidad, una proporción importante de los eventos ocurren en individuos que no presentan ninguno de estos factores. De ello deriva la actual necesidad de identificar nuevos biomarcadores que mejoren la predicción global de riesgo de enfermedad cardiovascular. En los últimos años la proteómica se ha convertido en una estrategia básica para el estudio del perfil proteico y de asociaciones proteicas complejas en una muestra biológica. Mediante el uso de técnicas proteómicas se pueden determinar modificaciones en la estructura de una proteína, así como sus niveles de expresión y la presencia de modificaciones post-traduccionales, que pueden estar asociadas a una patología determinada y tener valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico. Se han propuesto muchas moléculas como marcadores de la aterotrombosis, pero los resultados no son consistentes y la mayoría de ellos no ha llegado a utilizarse en la práctica clínica. Por eso cada vez hay una mayor necesidad de integrar las técnicas proteómicas en el descubrimiento de nuevos biomarcadores lo que permitirá conocer nuevos mediadores y vías patofisiológicas sin una asociación previa a las patologías cardiovasculares. En este trabajo se han aplicado técnicas de proteómica diferencial para el estudio de los cambios que se dan a nivel sérico en la fase aguda tras un infarto agudo de miocardio (AMI) de nueva presentación. Mediante la comparación del perfil proteómico de pacientes AMI e individuos sanos se han detectado importantes cambios en el patrón de distribución de dos grupos de proteínas: relacionadas con el metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y relacionadas con el metabolismo del retinol, vía no asociada hasta el momento con el AMI. Dentro de las proteínas del metabolismo de las HDL encontramos cambios en la fase aguda post-AMI en la apolipoproteína J y la transtiretina (TTR). Ésta última también muestra cambios en situaciones de alto riesgo cardiovascular como la hipercolesterolemia familiar. A su vez, también se han detectado cambios en la proteína mayoritaria de las HDL, la apolipoproteína A-I, pero en este caso en una fase más tardía post-AMI y en pacientes diabéticos. Las proteínas relacionadas con el metabolismo del retinol que muestran un perfil diferencial son la TTR y la proteína plasmática de unión a retinol (RBP4). En una segunda parte de este trabajo se han estudiado los cambios proteómicos que se dan a nivel de tejido cardíaco en un modelo experimental porcino de AMI y se ha encontrado por primera vez una asociación de la vía de señalización del receptor del hidrocarburo de arilo con el daño producido por la reperfusión posterior a un AMI.. Además se ha visto que la aplicación de un procedimiento cardioprotector como es el post-condicionamiento isquémico atenua la activación de dicha vía inducida por la reperfusión. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of morbidity and mortality. Atherosclerosis, the underlying mechanism of cardiovascular diseases, progresses gradually until the blood flow is compromissed leading to the precipitaton of an acute ischemic event such as acute coronary syndrome (ACS) or ictus. Identifying subjects at risk of developing an acute ischemic event remains one of the great challenges of cardiovascular medicine. Classical approaches, such as the presence of cardiovascular risk factors, are unable to accurately predict cardiovascular events. During the last years several studies have been focussed on the search for new plasma biomarkers of acute ischemic events. Although many potential molecules have been described, the results have not been consistent enough and most of them are not used in clinical practice. Until now, the only group of accepted biomarkers for the diagnosis of acute myocardial ischemic events are troponins. Nevertheless, these structural proteins are released to the circulation as a consequence of an irreversible injury of the myocardium. Therefore there is still a need for the identification of new biomarkers that will allow the early detection of an ischemic event before the irreversible necrosis of the myocardium occurs. Proteomic technologies allow the identification of molecules related to new pathways that together with traditional markers could act as a multibiomarker for diagnosis, prognosis and treatment, and therefore become a key tool for the development of new approaches in the prevention of cardiovascular diseases. In this study by applying proteomic technologies such as bi-dimensional electrophoresis we have compared the serum proteomic profile of patients with an acute new-onset myocardial infarction (AMI) to that of healthy individuals and found important changes in two main group of proteins: HDL-related proteins (apolipoproteins J and A-I, and TTR) and retinol metabolism associated proteins (TTR and RBP4). In a second part of the work by the study of proteomic changes that occur in the myocardial tissue after an AMI in a swine experimental model we have found, for the first time, an association of the aryl hidrocarbon receptor signalling pathway with the reperfusion injury after an AMI. Moreover, we have found an attenuation of the same pathway in response to a cardioprotective approach such as ischemic post-conditioning.

Desde su descubrimiento a finales de los 90, PTEN se ha convertido en uno de los genes supresores de tumores más importantes que se conocen. Se sitúa entre los 20 supresores tumorales mutados con mayor frecuencia, un fenómeno que llega a ocurrir hasta en el 80% de los casos, en función del tipo de cáncer. Una de las herramientas esenciales para el estudio de la biología de PTEN y su papel en el proceso tumoral es el empleo de modelos animales modificados genéticamente. Su uso permite estudiar los mecanismos moleculares de la enfermedad, pero también la evaluación a nivel preclínico de nuevas terapias y fármacos antineoplásicos. Dado que la deleción en homocigosis del gen resulta letal durante el desarrollo embrionario, el uso de modelos inducibles o específicos de tejido ha supuesto un gran avance en el campo. En la primera parte de este trabajo, se han generado dos nuevos modelos murinos para el estudio de neoplasias sólidas o hematopoyéticas causadas por la pérdida de PTEN. Una vez establecidos los modelos de estudio, se emplearon para evaluar inhibidores con potencial terapéutico sobre este tipo de neoplasia. El primero de éstos fue el inhibidor de mTORC1 Everolimus, el cual mostró efectos beneficiosos sobre tumores de endometrio e hiperplasia de tiroides. Por otro lado, se estudió la respuesta al Sorafenib, un inhibidor multiquinasa, el cual resultó efectivo para el tratamiento de lesiones de tiroides y próstata, pero no para neoplasias de endometrio. Si bien ambos fármacos permitieron ralentizar la progresión tumoral, ninguno de ellos eliminó la enfermedad. Durante los últimos años, ha ganado importancia la conexión entre el proceso inflamatorio y la patología tumoral. Una de las principales vías de señalización implicadas es NF-κB. Por este motivo, en la última parte del presente trabajo, se estudió el impacto de dicha vía en neoplasias inducidas por la pérdida de PTEN. La deleción simultánea de PTEN e IKKβ provocó una disminución de la incidencia de hiperplasia de tiroides en ratones, sin afectar a la progresión de neoplasias de endometrio y próstata. Sorprendentemente, la ablación de ambos genes en el sistema hematopoyético no impidió el desarrollo de neoplasias, pero afectó gravemente al fenotipo de las mismas.