L’émergence récente de nouvelles thérapies antivirales efficaces est une avancée considérable pour lutter contre l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC). Cependant, un pic de carcinomes hépatocellulaires, représentant l'atteinte hépatique ultime liée à l'infection, est attendu dans la prochaine décennie. Approfondir les connaissances des différentes étapes du cycle viral et de l’interférence du VHC avec l'hépatocyte hôte permet de mieux comprendre la pathogénèse associée à ce virus. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'identifier le réseau de partenaires cellulaires et viraux de la protéine non-structurale NS2 du VHC et de mieux comprendre les mécanismes d'action et de régulation de cette protéine transmembranaire multi-fonctionnelle, qui est un acteur clé du clivage protéolytique de la polyprotéine virale et de la morphogénèse des virions. Dans une première partie, nous avons analysé comparativement les mécanismes moléculaires de l’activité enzymatique des protéines NS2 du VHC et de plusieurs hepacivirus non-humains, qui infectent des primates du Nouveau Monde (GBV-B) ou qui ont été récemment identifiés chez plusieurs autres espèces animales (NPHV, RHV, BHV et GHV). Des analyses phylogénétiques, des modèles structuraux tridimensionnels et des Études dans un contexte d'expression transitoire de précurseurs polypeptidiques viraux ou dans des modèles d'infection ont montré que l’activité des protéases NS2 de divers hepacivirus (1) s'exerce à la jonction NS2/NS3 sous la forme d'homodimères formant deux triades catalytiques composites ; (2) est régulée dans le contexte de la polyprotéine virale par quelques résidus de surface du domaine N-terminal de NS3 (NS3N) nécessaires à son activation ; (3) est efficace en l'absence complète de NS3N, suggérant un rôle négatif ou régulateur, plutôt qu'activateur de NS3N, contrairement au dogme en vigueur actuellement. Ces travaux soulignent l'importance fonctionnelle des mécanismes protéolytiques de NS2 conservés parmi les différents hepacivirus. Dans une deuxième partie, nous avons identifié un réseau de facteurs cellulaires et viraux interagissant avec NS2 au cours du cycle infectieux par un crible interactomique reposant sur la purification par affinité et l'analyse par spectrométrie de masse des complexes protéiques isolés de cellules hépatocytaires infectées, ainsi que par un test de complémentation enzymatique fonctionnelle. Par une approche d'ARN interférence, nous avons ensuite montré qu'un nombre limité de facteurs cellulaires interagissant avec NS2 sont impliqués dans la production et la sécrétion de particules virales infectieuses, incluant des protéines du complexe de la peptidase signal (SPCS) au sein du réticulum endoplasmique, des protéines chaperonnes (DNAJB11, HSPA5) et une protéine impliquée dans le transport intracellulaire (SURF4). Notamment, nos Études suggèrent que plusieurs membres du SPCS forment un complexe multi-protéique avec NS2, impliquant Également la glycoprotéine virale E2, qui jouerait un rôle dans une Étape précoce de l'assemblage ou lors de l’enveloppement de la particule virale. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'identifier pour la première fois une série limitée de facteurs hépatocytaires interagissant spécifiquement avec la protéine NS2 du VHC au cours de l'infection et de déterminer parmi ceux-ci les facteurs essentiels la morphogenèse virale. Par ailleurs, nos résultats ont permis d’enrichir les connaissances naissantes des hepacivirus non-humains récemment identifiés et de montrer que ceux-ci partageaient avec le VHC des mécanismes clés mis en jeu au cours du cycle viral, ce qui contribue consolider leur intérêt comme modèles animaux de substitution. / The recent emergence of a panel of direct acting antivirals will certainly help combat chronic hepatitis C in the future. However, in the current context worldwide, a peak of hepatitis C virus (HCV)-induced hepatocellular carcinoma is expected in the next decade. Deepening our understanding of HCV life cycle and HCV interference with host cells may help monitor HCV-associated pathogenesis. The aim of my PhD work was to identify the network of host and viral interactors of HCV nonstructural protein 2 and to unravel the mechanisms of action and regulation of this multifunctional, transmembrane protein, which is key both for the viral polyprotein cleavage and virion morphogenesis.In the first part of the work, we comparatively characterized molecular mechanisms underlying the enzymatic activity of NS2 proteins from HCV and from various non-human hepaciviruses that infect small New World primates (GBV-B) or that were recently identified in the wild in several mammalian species (NPHV, RHV, BHV, GHV). A combination of phylogenetic analyses, tridimensional structural models, and studies relying on the transient expression of viral polypeptide precursors or on infection models showed that NS2 proteases of the various hepaciviruses (1) act as dimers with two composite active sites to ensure NS2/NS3 junction cleavage, (2) are regulated in the polyprotein backbone via a hydrophobic patch at the surface of NS3 N-terminal domain (NS3N) that is essential to activate NS2 protease, and (3) are efficient in the complete absence of NS3N, which is unprecedented and suggests that NS3N has rather a negative or regulating role on NS2 activity. These data underline the functional importance of NS2 proteolytic mechanisms that are conserved across hepaciviruses.In the second part, we identified a network of cellular factors and viral proteins that interact with NS2 in the course of HCV infection using an interactomic screen based on affinity purification and mass spectrometry analysis of protein complexes retrieved form HCV infected hepatoma cells, as well as a split-luciferase complementation assay. Next, using a gene silencing approach, we found that a limited set of NS2 interactors among these host factors were involved in HCV particle assembly and/or secretion. This includes members of the endoplasmic reticulum signal peptidase complex (SPCS), chaperone proteins (DNAJB11, HSPA5) and a factor involved in intracellular transport (SURF4). Notably, our data are in favor of the existence of a multiprotein complex involving NS2, several members of the SPCS, and the viral E2 glycoprotein, which likely plays a role in an early step of HCV particle assembly or during particle envelopment. Altogether, my PhD work allowed us to identify a limited set of hepatocyte factors interacting with HCV NS2 during infection and to pinpoint those that are essential for HCV morphogenesis. Additionally, our results contributed to the molecular characterization of the recently identified non-human hepaciviruses and revealed that these hepaciviruses share with HCV key mechanisms in the course of their infectious life cycles. This highlights the value of non-human hepaciviruses as surrogate animal models of HCV infection.

Le mélanome cutané est le plus agressif des cancers de la peau. Une fois métastasé, les options thérapeutiques sont limitées et peu efficaces. Dans le but de trouver de nouveaux marqueurs d'agressivité du mélanome cutané, une étude protéomique comparative entre deux lignées de mélanome murin, génétiquement semblables mais avec des agressivités différentes, a permis d'identifier l'annexine A1 (ANXA1) comme une protéine pro-invasive. Le but de ce travail de thèse a été d'évaluer la valeur pronostique d'ANXA1 et de déterminer son rôle et son mode d'action dans les processus d'invasion des mélanomes humains. Lors d'une étude immunohistologique rétrospective sur deux centres (Clermont-Ferrand et Saint-Etienne), il a été observé, indépendamment de l'indice de Breslow, une corrélation inverse entre le taux d'ANXA1 dans les tumeurs primitives de 61 patients et le délai d’apparition des métastases. Cette association est due à l’implication d’ANXA1 dans les processus d’invasion. En effet,nous avons démontré dans différentes lignées de mélanome qu'ANXA1 extracellulaire stimule les récepteurs aux peptides formylés (FPRs) exprimés par ces cellules. Cette fixation aux FPRs induit les voies des MAPK et STAT3 qui entraînent l'activation des métalloprotéases (MMP2). L'induction des MMP2 par ANXA1 augmente significativement le pouvoir invasif des lignées de mélanome. Nous avons aussi démontré qu’ANXA1 est transloquée coté externe de la membrane cytoplasmique là où elle subit un clivage par une sérine protéase qui pourrait être la nicaline. Ce clivage qui se produit après la sérine 28 n'a pas été décrit et jouerait un rôle dans la capacité invasive des mélanomes en libérant un ou des peptide(s) proinvasif(s). A long terme, ce travail vise à utiliser ANXA1 comme marqueur pronostique et/ou cible thérapeutique du mélanome cutané. / Cutaneous melanoma is the most aggressive skin cancer. Treatment options are limited and inefficient when melanoma has metastasized. In order to identify new markers of melanoma dissemination, protein profiles of two genetically similar murine melanoma cell lines have been compared. Both B16F10 and B16Bl6 cells induced primary tumours after subcutaneous graft, however, only B16Bl6 melanomas develop metastases. Among proteins differentially expressed, annexin A1 (ANXA1) is overexpressed in the aggressive B16Bl6 melanoma.The aim of the present work was to assess ANXA1 prognostic value in human melanoma and todecipher its implication in the invasion process. We report that, regardless of Breslow index, ANXA1 expression in primary tumours of 61 patients is inversely correlated with time to metastasis. This correlation is due to ANXA1 involvement in the invasion processes. Indeed, we show that in different human melanoma cell lines, extra cellular ANXA1 stimulates Formylated Peptide Receptors (FPRs). FPRs/ANXA1 interaction induces MMP2 activity through MAP Kinase and STAT3 pathways. ANXA1-stimulated MMP2 induces a significant increase of cell invasion ability. We also show that ANXA1 is externalized and localized on the cell surface where it is cleaved by a serine protease, which could be nicalin. ANXA1 cleavage occurs after Serine 28, a so far not described site. These data suggest that ANXA1 cleavage might be associated with invasion ability of melanoma cells by release of proinvasive peptide(s).These findings identify ANXA1 as a melanoma proinvasive protein that might be a promising prognosis marker and therapeutic target.

Ce travail de thèse s'inscrit dans le contexte de la sûreté nucléaire, et plus précisément, de l'intégrité des circuits secondaires des Réacteurs à eau pressurisée (REP). L'étude porte donc sur le comportement à rupture de structures minces soudées dans le domaine haut de la transition fragile/ductile. Elle a pour objectif de développer le modèle en contrainte seuil initialement développé par Chapuliot, qui permet de prédire la non-rupture par clivage de cette structure soudée. Le modèle est identifié pour la soudure de l'acier au C-Mn de construction nucléaire, en s'intéressant plus particulièrement à la limite supérieure du domaine de transition.Une contrainte seuil, en-dessous de laquelle le clivage ne peut avoir lieu, est identifiée à partir d'essais de traction à basses températures sur éprouvettes axisymétriques entaillées prélevées dans le joint soudé. Cette contrainte seuil permet de définir le volume seuil, ou volume dans lequel les contraintes principales maximales dépassent la contrainte seuil au cours de l'essai.L'analyse au MEB des faciès des éprouvettes rompues montre que la zone fondue brute de solidification dans la ZAT est la zone la plus susceptible de cliver. La relation entre la probabilité de rupture fragile et le volume seuil dans cette zone est établie via une fonction de sensibilité, grâce à des essais sur éprouvettes CT et à leur simulation multi-matériaux. Le modèle ainsi identifié est testé pour prévoir la non rupture par clivage d'éprouvettes SENT prélevées dans le joint soudé et sollicitées en traction. Les résultats obtenus sont encourageants relativement à la transférabilité du modèle à la structure réelle

L'endothélium vasculaire est la première couche de cellules en contact avec le flux sanguin. Au cours de processus pathologiques, les cellules endothéliales subissent des remaniements notoires dus à la présence de nombreux facteurs. Dans ce cas, l'intégrité de l'endothélium, assurée principalement par les jonctions adhérentes endothéliales dont la V(ascular)E(ndothelial)-cadhérine est la protéine clé, est perturbée. La phospho-VE-cadhérine est une caractéristique des cellules endothéliales activées in vitro. Notre laboratoire a montré l'existence d'une forme phosphorylée de VE-cadhérine in vivo au cours de l'angiogenèse physiologique. Des tyrosines importantes ont été identifiées : la tyrosine 685, qui est la cible directe de la tyrosine kinase Src en réponse au VEGF ainsi que les tyrosines 658 et 731. De plus, la VE-cadhérine peut être sensible à la protéolyse. Dans ce travail, la phosphorylation de la VE-cadhérine a été étudiée dans un contexte pathologique d'inflammation et de cancer à l'aide de deux modèles murins de tumeurs hépatiques ou cérébrales. J'ai démontré l'existence in vivo d'une forme phosphorylée de VE-cadhérine sur le site Y658. L'analyse d'une tyrosine kinase particulière, Syk, par si RNA ainsi que par des expériences de phosphorylation in vitro suggèrent fortement l'implication de SYK dans cette phosphorylation. En parallèle, dans le cadre d'une étude sur plusieurs pathologies, nous avons mis en évidence la présence d'une forme circulante de VE-cadhérine. La VE-cadhérine, tant par sa phosphorylation que par sa présence dans les fluides biologiques, pourrait être une signature de l'endothélium activé (phosphorylation) et/ou agressé (protéolyse).

Depuis le séquençage complet du génome humain, la génomique se focalise sur la détection des modifications de l'ADN des gènes potentiellement impliqués dans les maladies humaines. Les modifications de l'ADN sont au niveau de la séquence ou épigénétique. Ces polymorphismes, fréquents, rares, connus ou inconnus, peuvent être identifiés par le développement de nouvelles méthodes de séquençage de l'ADN pour chaque individu. Ce projet a pour but le développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par MALDI-TOF MS. Elle repose sur l'utilisation d'une nouvelle classe d'ADN polymérases qui peut incorporer également des ribonucléotides. La chimère ARN/ADN, simple ou double brin, contient trois bases désoxynucléotides et une quatrième base sous sa forme ribonucléotide. Elle est ensuite clivée après chaque ribonucléotide par l'hydroxyde de sodium. Les fragments de clivage se terminent par un ribonucléotide qui possède un groupement 3'- phosphate terminal. Ils sont dessalés par des billes échangeuses de cation et leurs masses sont analysées par MALDI-TOF MS. La comparaison des masses de l'individu avec celles de la séquence de référence est significative d'un changement dans la séquence d'ADN. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimère d'ARN/ADN ont également été étudiées. Cette méthode est adaptée pour l'étude d'un grand nombre d'individus dans une région limitée du génome grâce à la capacité haut-débit du MALDI-TOF MS. Cette méthode, rapide et efficace, possède de nombreuses applications tel que: le génotypage, le génotypage allèle-spécifique en multiplex, le microhaplotypage en multiplex, l'analyse de la méthylation de l'ADN et le séquençage

La présente étude traite de la durabilité (vieillissement) en milieu humide d'assemblages structuraux constituants les tuyères de propulseurs à poudre. Les matériaux utilisés sont un alliage d'aluminium et un matériau composite, collés ensemble par un adhésif polymère.<br />L'adhésif se révèle être la partie la plus sensible à un environnement aqueux. La cinétique de diffusion de l'eau dans la colle semble être décrite convenablement par le modèle mathématique de Carter et Kibler.<br />La diminution des propriétés mécaniques du polymère massique et des assemblages structuraux semble liée à la pénétration de l'eau. Un modèle permettant d'évaluer indirectement l'énergie d'adhésion, et par extrapolation la résistance des assemblages en fonction du temps de vieillissement a été élaboré à partir du faciès de rupture des éprouvettes et de la cinétique de diffusion d'eau. L'influence d'un traitement organosilane de la surface d'aluminium sablée sur la cinétique de dégradation en milieu humide des assemblages a ensuite été étudiée.

L'objectif de cette thèse est de comprendre les micro-mécanismes physiques de propagation et d'arrêt de fissure de clivage dans l'acier de cuve 16MND5 et de proposer un modèle de prédiction robuste et physiquement fondé, en s'appuyant sur une campagne d'essais de rupture fragile sur éprouvettes de laboratoire finement instrumentées, associée à la modélisation numérique de ces essais. Dans un premier temps, des expériences ont été menées sur des éprouvettes CT25 de différentes épaisseurs à cinq températures (-150°C, -125°C, -100°C, -75°C, -50°C). Des trajets de fissures rectilignes et branchées (deux fissures se développant de manière quasi-symétrique) ont été observés. Pour estimer la vitesse de propagation, une caméra ultra-rapide a été utilisée, associée à la mise au point d'un protocole expérimental permettant d'observer la face de l'éprouvette dans l'enceinte thermique, sans givrage. Des observations à 500 000 images.s-1 ont permis de caractériser finement la vitesse instantanée de la fissure sur le ligament complet de la CT (~25 mm). En parallèle, pour pouvoir analyser les essais et l'impact de la viscosité sur la réponse mécanique autour de la fissure, le comportement élasto-viscoplastique du matériau a été étudié jusqu'à une vitesse de déformation de 104 s-1 pour les températures étudiées. La méthode des éléments finis étendus (X-FEM) a été utilisée dans le code de calcul CAST3M pour modéliser la propagation de fissure. Les simulations numériques associent l'approche locale de la rupture en dynamique non linéaire et un critère de propagation en contrainte critique de type RKR à une distance caractéristique. Les travaux réalisés ont permis de confirmer la forme du critère proposé par Prabel à -125°C, et d'identifier les dépendances de ce critère à la température et à la vitesse de déformation. A partir d'analyses numériques en 2D et 3D, un critère multi-température fonction croissante de la vitesse de déformation est proposé. Des modélisations prédictives ont permis de valider le critère sur deux géométries d'éprouvettes (CT et anneau) en mode I à différentes températures. Des observations MEB et des analyses 3D au microscope optique montrent que le mécanisme de rupture est le clivage associé à des zones de cisaillement ductile entre les différents plans de fissuration. L'étude de la fraction surfacique des marches de cisaillement et des contraintes de fermeture associées tend à justifier le critère mis en place. Un modèle analytique est proposé permettant de justifier le critère déduit des modélisations numériques. Ce modèle considère que les ligaments retiennent la lèvre de la fissure et induisent donc des contraintes de fermeture au niveau de la pointe de fissure qu'il faut compenser pour atteindre la contrainte de clivage effective en pointe de fissure. Cette résistance des ligaments est directement reliée à la loi de comportement du matériau et justifie la dépendance du critère de rupture identifié à la vitesse de déformation. Enfin, les branchements de fissure ont été analysés via le dépouillement des vidéos obtenues avec la caméra rapide qui mettent en évidence un amorçage initial rectiligne, puis un amorçage de fissures multiples de part et d'autre du plan de fissure qui conduisent à l'arrêt de la fissure initiale, l'une de ces fissures 'secondaires' conduisant ensuite à la rupture de l'éprouvette. Les rôles essentiels de l'épaisseur et du chargement dans ce mécanisme de branchement sont soulignés. L'augmentation de l'épaisseur réduit la fréquence d'apparition de ce mécanisme et finit même par l'annuler. Logiquement l'intensité du chargement doit être suffisamment importante pour créer cette zone plastique étendue : les essais qui présentent une propagation rectiligne sont les essais pour lesquels les chargements à l'amorçage sont les plus faibles.

L'enjeu principal de cette recherche est de questionner ce que l'analyse psychodynamique du travail peut apporter à l'anthropologie psychanalytique du sens moral. Une explicitation des références doctrinales est un préalable nécessaire pour discuter la façon dont la psychanalyse et la psychodynamique du travail conçoivent les réquisits du sens moral. La démarche clinique et critique adoptée au cours de cette thèse tend conjointement à décrire et comprendre l'expérience vécue des sujets rencontrés, et à discuter les constructions métapsychologiques censées rendre compte de cette même expérience. Selon notre point de vue, la psychodynamique du travail apporte des éléments de discussion essentiels, et pourtant insuffisamment pris en compte par la psychanalyse, pour élucider les conditions de construction et de suspension du sens moral. Nous développerons l'idée qu'en sus d'une théorie du corps affecté dans le rapport au réel, une anthropologie du sens moral ne peut se passer d'une théorie du travail.

La maladie d'Alzheimer est la forme de démence la plus répandue au monde. Dans cette maladie, la toxicité est, entre autres, causée par l’interaction entre les oligomères du peptide Aß et la protéine prion cellulaire (PrP[indice supérieur C]). Étant ancrée à la membrane plasmique, PrP[indice supérieur C] doit passer dans la voie de sécrétion cellulaire où elle peut subir un clivage endoprotéolytique nommé clivage ?. Ce clivage libère dans le milieu extracellulaire un fragment N-terminal de PrP[indice supérieur C] nommé PrPN1. Un domaine hydrophobe de PrP[indice supérieur C] est indispensable au clivage ? ainsi qu’à sa dimérisation, mais l’effet de la dimérisation de PrP[indice supérieur C] sur le clivage ? n'a toujours pas été vérifié. À la membrane plasmique, PrP[indice supérieur C] peut également être relâché (shed PrP[indice supérieur C]). Une des fonctions attribuées aux formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] (PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C]) est d’inhiber la toxicité causée par les oligomères de Aß dans la maladie d'Alzheimer. En effet, plusieurs évidences in vitro montrent le potentiel neuroprotecteur de rPrPN1 et de rshed PrP[indice supérieur C] contre des oligomères de Aß synthétiques. Par contre, aucunes évidences physiologiques ne confirment le potentiel neuroprotecteur des formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] contre Aß. De plus, il n'existe toujours aucunes évidences in vivo de l’interaction entre les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] et Aß. Ma première étude a permis de démontrer que la dimérisation de PrP[indice supérieur C] dans la voie de sécrétion cellulaire augmente son transport vers la membrane plasmique. Le transport accru de PrP[indice supérieur C] à travers la voie de sécrétion cellulaire se traduit par une augmentation de la sécrétion de PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C]. L'augmentation des formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] sous des conditions de dimérisation permet de réduire significativement la toxicité causée par Aß in cellulo. Ces résultats sont particulièrement intéressants puisqu’ils ouvrent la voie à une thérapie axée sur l’utilisation de protéines endogènes en l’occurrence PrPN1 et shed PrP[indice supérieur C] contre la maladie d'Alzheimer. Ma deuxième étude a permis de démontrer qu’une interaction physiologique entre Aß et les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C] est possible in vivo. Ces interactions induisent un changement conformationnel important et rapide menant à la formation d'agrégats amorphes. In vivo, j'ai constaté que PrPN1 et A[beta] co-agrège dans une fraction soluble au chlorure de guanidinium. J'ai aussi observé que le clivage ? de PrP[indice supérieur C] est favorisé chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ces résultats suggèrent que les formes sécrétées de PrP[indice supérieur C], et plus particulièrement PrPN1 issu du clivage ? de PrP[indice supérieur C], sont parties intégrantes d’un mécanisme de défense endogène et inductible contre les oligomères de Aß détournant ces espèces toxiques vers une voie alternative non-toxique.[symboles non conformes]

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr 5S sont transcrits par l'ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l'ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l'exonisation d'une molécule d'ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l'exon " 5S-like " est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L'exon " 5S-like " a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l'étude de l'expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l'accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l'efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors de la maturation de la graine, l'accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d'une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n'est détectée qu'après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l'ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l'ARNr 5S en fonction des besoins de la plante.