Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2017-05-12T16:58:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas.pdf: 1982928 bytes, checksum: 704cbac648c3f7621a8bb8d5cf3116c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T16:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas.pdf: 1982928 bytes, checksum: 704cbac648c3f7621a8bb8d5cf3116c7 (MD5) Previous issue date: 2016-03-10 / A importância da expressão de proteínas de forma heteróloga tem crescido surpreendentemente, tendo em vista a progressiva necessidade de sua produção para aplicações na indústria farmacêutica, para uso terapêutico, ou uso comerciais, e estudo de estrutura e função. No entanto, a expressão das proteínas pode ser limitada por diversos fatores, podendo apresentar diversas dificuldades como a formação de corpos de inclusão ou proteínas com conformação incorreta, por exemplo. Estudos em hospedeiro para expressão de proteínas heterólogas tem sido desenvolvido, a fim de otimizar fatores como temperatura e concentração de indutor, com o intuito de melhorar a qualidade das proteínas obtidas. Neste estudo, inicialmente objetivou-se otimizar a expressão da transposase do elemento mariner mos1, em diferentes cepas de Escherichia coli BL21(DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21(DE3) pT-GROE, usando para subclonagem o vetor plasmidial de expressão pGEX-4T1. Analisando o melhor sistema de expressão para este elemento em particular, comparando as temperaturas de 30°C e 37°C para expressão e utilizando concentrações de 0,1mM; 0,5mM e 1,0mM de IPTG. Mesmo obtendo sucesso na expressão, com todas as condições de IPTG e em ambas as temperaturas testadas, o sistema de expressão não foi eficaz para obter proteínas de forma solúvel. Frente a este problema procuramos desenvolver um vetor de expressão de proteínas heterólogas que afim de tornar este processo mais rápido e mais eficiente, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O vetor para expressão foi desenhado in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento Strep-tagII para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Desta forma demonstramos que todas as cepas foram eficazes na expressão da transposase mos1, sendo a temperatura mais adequada de 37°C em todas as concentrações de IPTG, já que não houve nenhuma diferença quanto a mudança deste fator. Apresentamos um novo vetor de expressão de proteínas heterólogas, com a finalidade de facilitar a obtenção de proteínas heterólogas purificadas, tais problemas encontrados durante a tentativa de expressão da transposase. / The importance of heterologous protein expression has surprisingly grown in view of the progressive need for its production for applications in the pharmaceutical industry, for therapeutic use, or commercial use, and study of structure and function. However, the expression of the proteins may be limited by several factors, and may present several difficulties such as the formation of inclusion bodies or proteins with incorrect conformation, for example. Host studies for expression of heterologous proteins have been developed in order to optimize factors such as temperature and concentration of inducer in order to improve the quality of proteins obtained. In this study, we initially aimed to optimize transposase expression of the mariner element mos1 in different strains of Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21 (DE3) pTGROE, using for subcloning the pGEX-4T1 expression plasmid vector. Analyzing the best expression system for this particular element, comparing the temperatures of 30°C and 37°C for expression and using concentrations of 0.1 mM; 0.5mM and 1.0mM IPTG. Even with expression success, with all IPTG conditions and at both temperatures tested, the expression system was not effective in obtaining proteins in a soluble form. In view of this problem we have tried to develop an expression vector of heterologous proteins in order to make this process faster and more efficient, using only one event of cloning and transformation of the expression bacterium. The vector for expression was drawn in silico from an IPTG responsive Lac promoter, followed by a cell export signal (peptide-signal), a Strep-tagII fragment for purification and a site for thrombin, allowing cleavage of the protein from Interest of merged tags. Two sites for restriction endonucleases (BamHI and XbaI) were inserted which allow the cleavage of the cloned gene in the construct. In this way, we demonstrated that all strains were effective in the expression of the transposase mos1, with the most suitable temperature being 37 ° C in all concentrations of IPTG, since there was no difference in the change of this factor. We present a new expression vector of heterologous proteins, in order to facilitate the obtaining of purified heterologous proteins, such problems encountered during the attempt to express the transposase.

Submitted by Paula Castanho Borges (paulacastanhob@gmail.com) on 2018-07-18T19:31:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Paula DEFINITIVO.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) Previous issue date: 2018-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida das proteínas Cry1Ia10 e Cry8 contra larvas de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), buscando por potencial sinérgico. Para tanto, o gene cry8 foi amplificado por PCR a partir de um clone previamente construído, obtendo-se um fragmento de aproximadamente 3531 pb e subclonado no vetor de expressão pET-SUMO. Para a expressão dos genes cry1Ia10 e cry8, os DNAs recombinantes foram inseridos em células de Escherichia coli BL21 (DE3) e induzidos por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), resultando em proteínas de 94 kDa e 143 kDa, respectivamente, visualizadas em SDS-PAGE. As proteínas foram quantificadas através do software ImageQuant TL 8.1” (GE Healthcare), para que fosse possível a realização dos cálculos de diluição nas respectivas concentrações incorporadas à dieta artificial, a fim de estimar a CL50 e CL90 das duas proteínas testadas sozinhas e em conjunto. Com base na sequência de aminoácidos de proteínas da classe Cry8, análises filogenéticas foram realizadas para investigar proximidade evolutiva da proteína Cry8 utilizada neste trabalho com as demais proteínas na mesma classe. Através dessas análises, sugerimos que a proteína em questão pertence à subclasse Cry8Pa devido a elevada proximidade filogenética e similaridade com a proteína Cry8Pa2. Observou-se que as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 apresentaram ação inseticida contra larvas neonatas de A. grandis, obtendo-se as CL50 de 7,232 µg ml-1 e 4,422 µg ml-1 para Cry1Ia10 e Cry8 respectivamente. Quando combinadas as proteínas a CL50 é reduzida para 2,664 µg ml-1 e CL90 para 13,535 µg ml-1 apresentaram sinergismo, potencializando a ação inseticida das mesmas. Este estudo conclui que larvas de A. grandis são suscetíveis as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 e que a combinação entre elas aumenta a eficiência de controle, sugerindo que plantas piramidadas com estes genes são de interesse agronômico para o controle de A. grandis possibilitando o retardo do desenvolvimento de insetos resistentes. / The objective of this work was to evaluate the insecticidal effect of Cry1Ia10 and Cry8 proteins against Anthonomus grandis Boheman larvae (Coleoptera: Curculionidae), searching for synergistic potential. To do so, the cry8 gene was amplified by PCR from a previously constructed clone, obtaining a fragment of approximately 3531 bp and subcloned into the pET-SUMO expression vector. For the expression of the cry1Ia10 and cry8 genes, the recombinant DNAs were inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) cells, resulting in 94 kDa and 143 kDa proteins, respectively, visualized on SDS-PAGE. The proteins were quantified using ImageQuant TL 8.1 software (GE Healthcare) to allow the calculation of dilution in the respective concentrations incorporated into the artificial diet in order to estimate the LC50 and CL90 of the two proteins tested alone and together. Based on the amino acid sequence of Cry8 class proteins, phylogenetic analyzes were performed to investigate evolutionary proximity of the Cry8 protein used in this work with the other proteins in the same class. Through these analyzes, we suggest that the protein in question belongs to the subclass Cry8Pa due to its high phylogenetic proximity and similarity to the Cry8Pa2 protein. It was observed that the proteins Cry1Ia10 and Cry8 showed insecticidal action against neonatal larvae of A. grandis, obtaining the LC50 of 7.232 μg ml-1 and 4.422 μg ml-1 for Cry1Ia10 and Cry8 respectively. When combined the proteins at LC50 is reduced to 2,664 μg ml-1 and CL90 to 13,535 μg ml1 showed synergism, potentiating the insecticidal action of the same. This study concludes that A. grandis larvae are susceptible to Cry1Ia10 and Cry8 proteins and that the combination between them increases control efficiency, suggesting that pyramidal plants with these genes are of agronomic interest for the control of A. grandis, allowing the development of resistant insects.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T13:14:56Z No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:36:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae, inclusa no clado Asteridaee, ordem Lamiales, compreendendo aproximadamente 175 gêneros e 2800 espécies, onde muitos gêneros apresentam plantas com propriedades medicinais e ornamentais. A espécie Lippia alba, originária da América do Sul, também ocorre no Brasil e é uma das mais estudadas do gênero Lippia. Ela floresce durante o ano todo e recebe grande destaque no gênero, devido às suas inúmeras propriedades medicinais. O óleo essencial de Lippia alba é composto basicamente por sesqui e monoterpenos, que são as substâncias responsáveis por suas propriedades medicinais. O objetivo central do presente trabalho foi clonar e analisar a expressão de dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Através do alinhamento de genes codificadores de monoterpeno sintases caracterizadas, primers degenerados foram desenhados dentro de regiões conservadas e utilizados para se obter a clonagem de genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases foram clonados, LaTPS12 e LaTPS23. Após a clonagem, técnicas de RT-PCR semiquantitativo foram empregadas para análises de expressão desses dois genes em diferentes estágios foliares e em três diferentes quimiotipos de Lippia alba. Os resultados mostraram que em folhas situadas no quarto segmento nodal o gene LaTPS12 apresenta maior nível de expressão. A diferença na expressão do gene LaTPS23 foi menos acentuada nos três quimiotipos analisados em relação ao gene LaTPS12, que apresentou uma expressão diferencial. Análises filogenéticas foram realizadas comparando-se as seqüências desses dois genes com outros genes codificadores de terpeno sintases já caracterizadas de diferentes espécies de plantas. De acordo com essas análises, LaTPS12 e LaTPS23 pertencem à classe TPS-b, que é composta principalmente por monoterpeno sintases de angiospermas. / The genus Lippia belongs to Verbenaceae family, Asteridaee, order Lamiales. This family comprises about 175 genus and 2800 species, and many of them have medicals and ornamentals proprierties. Lippia alba is native from South America, and is also found in Brazil and is the most studied species of the genus Lippia. This plant blooms throughout the year and has great importance due to its medicinal properties. The Lippia alba essential oils are composed by sesquiterpenes and monoterpenes conferring its medicinal properties. The aim of this work was to clone and to analize gene expression of putative terpene synthases genes (TPS) in Lippia alba. Alignment of TPS genes was used to design degenerate primers into conserved domains for cloning of these genes in Lippia alba. We have cloned two putative TPS genes, LaTPS12 and LaTPS23. After cloning, semiquantitative RT-PCR was employed to expression analysis of these two genes in different leaf stages and among three different chemotypes of Lippia alba. The result of expression level showed that LaTPS12 occurred at higher level in leaves located in fourth nodal segment and showed a marked differential expression among the chemotypes. The difference of expression of the LaTPS23 was less prominent comparing the three studied chemotypes. We performed a phylogenetic analysis in order to compare the LaTPS12 and LaTPS23 to others TPS genes in different plant species. The results showed that these LaTPS12 and LaTPS23 belong to the class TPS-b, which comprises mainly angiosperms monoterpene synthases genes.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.