Metastasis Associated in Colon Cancer 1 (MACC1) ist ein prognostischer und prädiktiver Biomarker für Tumorprogression und Fernmetastasierung von Darmkrebs. Der exponentielle Anstieg der MACC1-verbundenen Publikationen seit dessen Entdeckung im Jahr 2009 verdeutlicht Mitwirkung von MACC1 am Krankheitsfortschritt vieler solider Tumore. Dies umfasst sich nicht nur die erhöhte Tumorinvasion und Metastasierung, sondern ebenso erhöhte Tumorangiogenese, dessen Stammzellfähigkeit und die Vermeidung von Apoptose. Obwohl unsere Forschungsarbeiten in den letzten Jahren neue Erkenntnisse über die Auswirkung von MACC1 in der Tumorprogression brachten, ist über dessen Proteinstruktur und der damit verbundenen Funktion in physiologischen Prozessen wenig bekannt. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Rolle von MACC1 in der Clathrin-abhängigen Endozytose (CME) untersucht. Nach massenspektrometrischer Analyse des MACC1-Interaktoms wurde die Proteinbindung von MACC1 und den CME-verbundenen Faktoren CLTC, DNM2 und AP-2α, bzw. dem CME-Cargo TfR experimentell bestätigt. Davon ausgehend wurde der Endozytoseweg von TfR und MACC1-abhängige Änderungen in dessen Oberflächenverteilung, Internalisierung, Recycling und Proteinabbau mittels neu etablierter Methoden untersucht und ergab einen deutlichen Einfluss von MACC1 auf die Internalisierung und das Recycling von TfR. Daraufhin wurden durch Sequenzanalyse der MACC1-Proteinstruktur vorhergesagte N-terminale Interaktionsbereiche mit CME-Faktoren betrachtet, die eine Clathrin-Box sowie NPF- bzw. DPF-Motive umfassen. Deletionsvarianten von MACC1 wurden zunächst auf ihre Interaktionsfähigkeit mit CLTC, DNM2 und TfR getestet, deren subzelluläre Lokalisation bestimmt, sowie deren Einfluss auf den Endozytoseweg von TfR geprüft. Das erhöhte Recycling von TfR in Abhängigkeit von MACC1 wurde für EGFR als wichtigen Vertreter von krebsrelevanten Rezeptor-Tyrosinkinasen überprüft. Die Analyse des TfR-EGFR gekoppelten frühen Endozytosewegs ergab eine erhöhte Recyclingrate des Rezeptors in verschiedenen MACC1-überexprimierenden Zelllinien. Um den Einfluss der N-terminalen Interaktionsbereiche von MACC1 auf den Endozytoseweg von EGFR zu verstehen, wurden die MACC1-Deletionsvarianten nicht nur auf Änderungen im Verlauf der EGFR-Endozytose geprüft, sondern ebenfalls auf die Aktivierung des Rezeptors sowie nachgelagerter Signaltransduktoren wie PI3K/AKT und ERK1/2. Die Wichtigkeit der Interaktionsbereiche von MACC1 wurde durch eine Analyse der EGF-induzierten Zellproliferation bestätigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit, die die Rolle von MACC1 in der Endozytose beschreiben, erweitern die Interventionsmöglichkeiten gegenüber der Fernmetastasierung solider Tumore und könnten helfen, das Überleben betroffener Patienten zu verlängern. / Metastasis Associated in Colon Cancer 1 (MACC1) is a newly discovered prognostic and predictive biomarker associated with tumor progression and metastasis development. Since our first report concerning MACC1 in 2009, MACC1-related research has been exponentially increasing. At present, MACC1 involvement in the progression of many cancer types has become increasingly clear. MACC1 does not only promote invasion and metastasis formation, but it also induces angiogenesis, stemness and prevents apoptosis. Although in the last years our research concerning MACC1 gained new insights into cancer progression, little is known about its structural role and functions in physiological processes. In this thesis, I will address for the first time the role of MACC1 during CME (clathrin-mediated endocytosis). Importantly, MACC1’s role in CME was first suggested by interactome analysis. Thus, MACC1’s CME interactors (CLTC, DNM2, AP2α and TfR), were first identified and validated. In addition, MACC1’s impact on TfR endocytic traffic was addressed by studying its effect on surface distribution, uptake, recycling and degradation of the receptor with pioneering and newly established methods. As a result of this research, MACC1 shows a clear impact on TfR internalization and recycling. Thus, the present work dissects the MACC1 protein structure containing predicted CME domains such as clathrin box, NPFs and DPF. By deleting these domains, first the impact on the binding between MACC1 and CLTC, DNM2 and TfR were analyzed. Also, we characterized the distribution of MACC1 in the cell depending on the presence of its CME domains, and then I addressed their specific impact during TfR endocytic traffic. After we elucidated the MACC1-dependent increase in TfR recycling, we compared its newly discovered function during EGFR endocytic traffic. By analyzing TfR -EGFR coupled early endocytic traffic during EGF-stimulated internalization in MACC1 overexpressing cell lines, we discovered that MACC1 promotes faster recycling of EGFR to PM, in two different cell lines. In order to understand the MACC1 CME domains impact on EGFR endocytic traffic, we dissected not only EGFR endocytic fate in MACC1 CME mutant cell lines but also the impact on EGFR trans-activation after EGF-stimulated internalization and downstream signaling, in particular, AKT and ERK1/2. To conclude with functional analysis, we also addressed MACC1 CME domains impact on cell proliferation revealing that CME domains integrity is important for efficient cell proliferation. The present work sheds new light on MACC1’s role during endocytosis, opening a possibility of intervention on metastasis development in CRC to improve the survival of patients.

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This study aimed to understand how the identity of Manitobans with early malignancy is affected through diagnosis, decision making and treatment. Using grounded-theory methodology, semi-structured interviews were conducted with 18 adult patients with early breast, colon, lung, prostate and gynecological cancers, before and after adjuvant treatment decision making. 15 adult friends and family members were also interviewed. Significant findings include: 1) After diagnosis, the “cancer identity” emerged as a new aspect of the patient’s identity; 2) Establishing a post-diagnosis routine was a significant source of distress for patients; 3) Ability to re-establish routine post-diagnosis may be enhanced by providing earlier notification of medical appointment times and information regarding how different treatment options will affect the patient’s identity. This study provides new insight into the experience of patients with malignancy in Manitoba. Additionally, it presents recommendations, based on the insights and concerns of its participants, for improving the cancer journey of Manitobans. / May 2017

Das Kolonkarzinom ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. Etwa 50 % der Patienten entwickeln Fernmetastasen. Diese haben eine sehr schlechte Überlebensprognose. Deshalb fokussiert die Forschung auf die Identifizierung neuer, molekularer Marker für eine verbesserte Metastasierungsvorhersage. Identifizierte Hochrisiko-Patienten könnten somit rechtzeitig eine individualisierte, intensivere Therapie erhalten. MACC1 (Metastasis-associated in colon cancer 1) ist ein neu identifiziertes Gen, das in Kolonkarzinomen und deren Fernmetastasen überexprimiert wird. Die Domänenstruktur von MACC1 ist kennzeichnend für Proteine der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der zellulären Funktion von MACC1 und seiner Rolle in der Tumorprogression sowie die Evaluierung von MACC1 als molekularer Metastasierungsmarker. MACC1-überexprimierende Tumorzellen zeigten in Abhängigkeit von der Domänenstruktur in in vitro Assays ein erhöhtes migratorisches, invasives und proliferatives Potential. Der Einfluss von MACC1 auf die Metastasierungskapazität von Tumorzellen konnte auch im Tiermodell belegt werden. Der Hepatocyte-growth-factor (HGF) induziert die epitheliale-mesenchymale Transition MACC1-exprimierender Zellen und die nukleäre Translokation von MACC1. Die Expression des HGF-Rezeptors Met war in diesen Zellen stark erhöht. Reportergen-Studien bestätigten die transkriptionelle Regulation von Met durch MACC1. Die Analyse humaner Kolonkarzinome ergab eine signifikant höhere MACC1 Expression in Primärtumoren mit metachroner Fernmetastasierung. MACC1 ist ein neu identifizierter Regulator des HGF/Met-Signalweges und trägt somit entscheidend zur Determinierung des metastatischen Potentials von Tumorzellen bei. MACC1 hat großes Potential als neuer, prognostischer Marker für die Metastasierung des Kolonkarzinoms und ist ein Kandidatengen als Ziel effektiver, molekularer Interventionsstrategien zur Metastasierungs-Prävention. / Colon cancer is one of the most frequent malignant diseases worldwide. About 50% of the patients develop distant metastasis. These patients have only few therapy options and very poor survival rates. Therefore cancer research focuses on the identification of novel molecular markers to provide a better prognosis of the metastatic risk. Identified high-risk patients would get access to an early, individualized therapy. MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) is a newly identified gene that is overexpressed in colon carcinomas and their distant metastases. The MACC1 domain structure is characteristic for proteins of the receptor tyrosine kinase signalling pathways. Aim of this study was the analysis of the cellular function of MACC1, its role in tumor progression and its evaluation as a molecular, prognostic marker for metastasis. MACC1 overexpressing tumor cells revealed higher migratory, invasive, and proliferative potential in in vitro assays. The impact of MACC1 on the metastatic potential of tumors was also shown in mouse models. The hepatocyte growth factor (HGF) induced epithelial-mesenchymal-transition in MACC1 positive cells and MACC1´s nuclear translocation. Expression of the HGF receptor Met was strongly elevated in these cells. Reporter gene experiments confirmed the transcriptional regulation of Met by MACC1. Analyses in human colon carcinomas showed a significantly higher MACC1 expression in tumors that developed distant metastases. MACC1 is a newly identified regulator of the HGF/Met signalling pathway. It contributes decisively to the metastatic capacity of tumor cells. MACC1 has great potential as new prognostic marker for colon cancer metastasis and is a promising candidate as target for effective, molecular intervention strategies for metastasis prevention.

La progression tumorale est la conséquence de multiples altérations génotypiques et phénotypiques; L’une d’entre elles, nécessaire à la formation de métastases, est l’acquisition d’une résistance à l’anoïkis, forme d’apoptose induite par la perte d’attachement à la matrice extra-cellulaire. Afin d’étudier l’anoïkis, nous avons utilisé deux lignées colorectales humaines isogéniques : la lignée SW480 dérivée de la tumeur primaire et sensible à l’anoïkis et la lignée SW620 dérivée d’une métastase ganglionnaire de cette même tumeur et résistante à l’anoïkis. Nous avons établi que dans les cellules SW480, l’anoïkis est une forme d’apoptose intrinsèque c'est-à-dire débutant à la mitochondrie et donc sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2. Parmi celles-ci, nous avons trouvé que seule la protéine proapoptotique à BH3-seul Bim était régulée différemment dans les deux lignées : tandis que son expression augmente de manière très significative dans les cellules SW480 cultivées en suspension, elle n’augmente que très peu dans les cellules SW620. De manière très intéressante, et malgré cette différence, les deux lignées se sont montrées être sensibles au BH3-mimétique ABT-737 mais seulement lorsqu’elles sont cultivées en suspension. Ces résultats indiquent que, qu’elles soient sensibles ou non à l’anoïkis, les cellules détachées sont « prédisposées à la mort » et que des composés semblables à l’ABT-737 tels que le Navitoclax ou l’ABT-199 pourraient avoir des propriétés anti-métastiques dans les tumeurs solides. Dans la seconde partie de ce travail, nous montrons que la protéine transmembranaire CDCP1 ( CUB Domain Containing Protein 1) semble nécessaire mais non suffisante pour protéger ces cellules contre l’anoïkis. CDCP1 est un substrat de Src mais sa phosphorylation sur tyrosine n’est pas impliquée dans cette protection. Finalement, nous avons identifié deux nouvelles protéines qui interagissent avec CDCP1 : l’ITGB4 et l’EphA2 / Tumour progression is the consequence of multiple genotypic and phenotypic alterations. One of these, necessary for the formation of metastasis, is acquisition of a resistance to anoïkis, a form of apoptosis triggered by loss of attachment to the extra-cellular matrix. In order to study anoïkis, we used two isogenic human colon cell lines : SW480 cells derived from the primary tumour and sensitive to anoïkis, and SW620 cells derived from a lymph node metastasis in the same patient which are resistant to anoikis. We found that anoikis signaling in SW480 cells is a form of intrinsic apoptosis thus starting at the mitochondria and under the control of Bcl-2 family proteins. Among the members of this family, the BH3-only proapoptotic protein Bim was the only one that we found to be differentially regulated between the two cell lines: whereas Bim expression augments strongly during the culture in suspension of SW480, it only slightly does so in SW620 cells. Most interestingly, despite this difference, both cell lines turned to be sensisitive to the BH3-mimetic ABT-737 but only when they are in suspension. This shows that, whether or not they a sensitive to anoikis, detached colon cancer cells are “primed for death” and thus that ABT-737 related compounds such as Navitoclax or ABT-199 might have anti-metastatic properties in solid tumours. In the second part of this work, we show that the transmembrane protein CDCP1 (CUB Domain Containing Protein 1) appears be necessary but not sufficient to protect these cells against anoïkis. CDCP1 is a Src substrate but its tyrosine phosphorylation is not involved in this protection. Finally, we have identified two new proteins interacting with CDCP1: ITGB4 and EphA2.

Milk fat globule membrane surrounds the fat droplets of milk. It is a biopolymer containing primarily membrane glycoproteins and polar lipids which contribute to its properties as a possible neutraceutical. The aims of the studies were to determine if dietary milk fat globule membrane: (1) confers protection against colon carcinogenesis; and (2) promotes gut mucosal integrity while decreasing inflammation compared to diets containing corn oil or anhydrous milk fat. Aim 1. Three dietary treatments differing only in the fat source were formulated: (1) AIN-76A, corn oil; (2) AIN-76A, anhydrous milk fat; and (3) AIN-76A, 50% milk fat globule membrane, 50% anhydrous milk fat. Each diet was formulated to contain 50 g/kg diet of fat and to be identical in macro and micro nutrient content. To assess protection against colon carcinogenesis, male, weanling Fischer-344 rats were randomly assigned to one of the three dietary treatments. Animals were injected with 1,2-dimethylhydrazine once per week at weeks 3 and 4. After 13 weeks animals were sacrificed, colons were removed, and aberrant crypt foci were counted by microscopy. Rats fed the milk fat globule membrane diet (n = 16) had significantly fewer aberrant crypt foci (20.9 ± 5.7) compared to rats fed corn oil (n = 17) or anhydrous milk fat (n = 16) diets (31.3 ± 9.5 and 29.8 ± 11.4 respectively; P < 0.05). Aim 2. Male BALB/c mice were randomly assigned to one of two diets: AIN- 76A, corn oil or AIN-76A, 50% milk fat globule membrane, 50% anhydrous milk fat. After 5 weeks mice were injected with saline vehicle control or lipopolysaccharide and gavaged with dextran-FITC. To assess gut mucosal integrity and inflammation, serum samples were assayed for dextran-FITC 24 and 48 hours after gavage, and a panel of 16 cytokine concentrations was analyzed. Serum concentrations of IL-6, IL-10, IL-17, MCP-1, IFNγ, and TNFα decreased and gut permeability decreased 45% in lipopolysaccharide challenged mice fed milk fat globule membrane diet compared to control diet at 24 hours (P < 0.05). Overall, the results of these aims suggest that diets containing milk fat globule membrane are protective against colon carcinogenesis, inhibit the inflammatory response, and protect against gastrointestinal stress.

<p>This thesis deals with recognition and elimination of tumours by T lymphocytes and their use in adoptive immunotherapy.</p><p>The first tumour-draining lymph node; the sentinel node, is identified by peritumoural injection of a tracer. This is the hypothesised location for the activation of tumour-reactive lymphocytes. Accordingly, proliferation and IFN-γ production in response to autologous tumour extract was detected in sentinel nodes from patients with colon and urinary bladder cancer. Reactivity in metastatic nodes was generally lower or absent, but the non-responsiveness could be subdued in long-term cultures by addition of tumour antigen and IL-2. A novel padlock-probe based method was developed for measuring the T cell receptor Vβ repertoire. Common Vβ gene expansions were detected in tumour-infiltrating lymphocytes and sentinel nodes. Thus, tumour antigens are recognised in sentinel nodes by Th1 lymphocytes, resulting in a clonally expanded cell population that can be further propagated <i>ex vivo</i>.</p><p>Regulatory T cells (Tregs) may contribute to tumour-induced immunosuppression. Immunohistochemical stainings against the pan-T cell marker CD3 and Treg marker FOXP3 was performed on tumour tissue from 20 historical urinary bladder cancer patients. The ratio of FOXP3⁺ to CD3⁺ cells was lower in patients alive 7 years post-cystectomy, suggesting that Tregs in bladder cancer have prognostic implications.</p><p>Lymphocytes were isolated from sentinel nodes from sixteen patients with advanced or high-risk colon cancer. <i>In vitro</i> expansion with addition of autologous tumour extract and IL-2 mainly promoted the outgrowth of CD4⁺ Th1 lymphocytes, which were safely re-transfused to the patients. Four patients responded with complete tumour regression. Survival time in the Dukes’ D patients was significantly increased compared with conventionally treated controls (2.6 versus 0.8 years; p=0.048).</p><p>In conclusion, human solid tumours are recognised in sentinel nodes and <i>in vitro</i> expanded sentinel node-acquired CD4⁺ T lymphocytes seem useful in the treatment of patients with disseminated cancer.</p>

Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt.<br><br> Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist. / The development of colon cancer is associated with several nutritional, life style, and environmental factors. Among the environmental factors probably involved are substances formed during food processing and taken up with food. One of these substances is the heterocyclic aromatic amine (HAA) 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), which is formed during the heating of proteinaceous food such as meat and fish. In rodent studies the target organs for HAA-derived cancer development are identical with human organs showing high tumor incidences in western countries. Whether there is an association between exposure to PhIP and high tumor incidences in humans is still uncertain. The amount of PhIP administred to rodents in several studies was far above the levels of human exposure towards HAA. Thus, the aim of this study was to elucidate whether low concentrations of the substance are able to induce finger-print colon cancer gene mutations, preneoplastic lesions or tumors in rats. Animals fed with high amounts of PhIP developed fewer lesions than animals fed with a human-relevant concentration of PhIP. However none of the groups developed tumors of the colon. Both groups showed finger-print mutations for colon cancer, but not in a dose-dependent manner. Sequencing showed that the mutations were different from the known mutation spectum of PhIP. The susceptibility of the F344 rats to PhIP used in this study differed from that in previous feeding studies, with both groups showing much less lesions of the colon. Differences in composition and processing of the animal diets as well as animal maintenance and –origin may explain this discrepancy. For the first time an association between low doses of PhIP in the diet and induction of inflammation was shown. Signs of inflammation were observed macroscopically as well as in histological slices, but the mechanism of its induction remains to be clarified.<br><br> Taken together the results suggest that a chronical exposure to low doses of PhIP alone is not sufficient to explain the high incidences of colon cancer in western countries.

Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab. / Since the detection of glutathione peroxidase-2 (GPx2) it was assumed that reducing hydroperoxides is the only function of this enzyme in the crypt ground of the colon. But further studies showed that GPx2 is also highly expressed in tumor tissue. However, it is not known whether it acts a pro- or anticarcinogenic manner at this site. In vitro and in vivo experiments elucidate antiinflammatory features of GPx2, based on these findings additional functions of GPx2 are discussed. In this dissertation the physiological function of GPx2 was investigated. For this purpose in wild type and GPx2-knockout mice, changes of enzyme expression and colon morphology were analyzed. The mice were fed three diets containing different selenium concentrations: selenium deficient, selenium adequate and selenium supplemented. Under physiological conditions the mitosis rate is highest in the proliferating zone in the crypt ground of the colon. The majority of apoptotic cells are located at the tip of the crypt. The knockout of GPx2 significantly increased the rate of apoptosis in the crypt ground. The greatest effect was documented on the selenium deficient diet. Here, changes of the colonic morphology were detectable, because the shift of the proliferating zone towards the tip of the crypt lead to an extension of the crypts. In the wild type mice no apoptotic cells were detected on the crypt ground. Under physiological conditions GPx1, in contrast to GPx2, is mainly expressed on the top of the crypt, and this enzyme is no longer detectable under selenium deficiency. The knockout of GPx2 increased the expression of GPx1 in the crypt ground of the colon on all three selenium diets. It is likely that this over expression of GPx1 compensates for the loss of GPx2. However the massive apoptotic rate in the crypt ground shows that GPx1 can not compensate the complete function of GPx2. These results elucidate that GPx2 not only functions as a hydroperoxide reducer, but that it is also important for the maintenance of the stem cell character and the homeostasis of cells. The question if GPx2 influences the inflammation triggered by the coloncarcinogenic process was next assessed in this dissertation. Therefore the AOM/DSS model was used to trigger the carcinogenic process through inflammation. The amount of aberrant crypt foci (ACF) and tumors in the colon were analyzed in both wild type and GPx2-knockout mice. However initially the inflammation status was compared between the two genotypes. The inflammation of the colon was stronger in the GPx2-knockout mice than in wild type. These results support the postulated antiinflammatory features of GPx2. The loss of GPx2 may influence the inflammation process by decelerating the regeneration of the tissue caused by the increased apoptotic rate in the proliferating zone. Additionally, the GPx2-knockout mice developed more tumors in the colon. Therefore the inflammation of the colon correlated with the development of tumors. The loss of GPx2 may have enhanced both tumor initiation and progression. But the expression of GPx2 also stimulated the growth of tumors. These results indicate that an adequate GPx2-expression can protect from colonic inflammation, and therefore decrease the risk of developing colon cancer. Whether GPx2 acts in a pro- or anticarcinogenic manner appears to depend on the state of the carcinogenic process.

This thesis deals with recognition and elimination of tumours by T lymphocytes and their use in adoptive immunotherapy. The first tumour-draining lymph node; the sentinel node, is identified by peritumoural injection of a tracer. This is the hypothesised location for the activation of tumour-reactive lymphocytes. Accordingly, proliferation and IFN-γ production in response to autologous tumour extract was detected in sentinel nodes from patients with colon and urinary bladder cancer. Reactivity in metastatic nodes was generally lower or absent, but the non-responsiveness could be subdued in long-term cultures by addition of tumour antigen and IL-2. A novel padlock-probe based method was developed for measuring the T cell receptor Vβ repertoire. Common Vβ gene expansions were detected in tumour-infiltrating lymphocytes and sentinel nodes. Thus, tumour antigens are recognised in sentinel nodes by Th1 lymphocytes, resulting in a clonally expanded cell population that can be further propagated ex vivo. Regulatory T cells (Tregs) may contribute to tumour-induced immunosuppression. Immunohistochemical stainings against the pan-T cell marker CD3 and Treg marker FOXP3 was performed on tumour tissue from 20 historical urinary bladder cancer patients. The ratio of FOXP3+ to CD3+ cells was lower in patients alive 7 years post-cystectomy, suggesting that Tregs in bladder cancer have prognostic implications. Lymphocytes were isolated from sentinel nodes from sixteen patients with advanced or high-risk colon cancer. In vitro expansion with addition of autologous tumour extract and IL-2 mainly promoted the outgrowth of CD4+ Th1 lymphocytes, which were safely re-transfused to the patients. Four patients responded with complete tumour regression. Survival time in the Dukes’ D patients was significantly increased compared with conventionally treated controls (2.6 versus 0.8 years; p=0.048). In conclusion, human solid tumours are recognised in sentinel nodes and in vitro expanded sentinel node-acquired CD4+ T lymphocytes seem useful in the treatment of patients with disseminated cancer.