A neuroproteção é um dos tópicos mais relevantes aplicados à neurociência. As junções comunicantes (JC), formadas pelas conexinas (Cx) estão envolvidas na neurodegeneração após lesão. Estudos com animais KO apresentam resultados contraditórios sobre papel das JCs. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel das Cxs a partir do trauma mecânico na retina, modelo que permite a visualização do foco, penumbra, e áreas adjacentes à lesão. Observamos regulação distinta das Cx36 e Cx43 durante a neurodegeneração. A Cx36 não se alterou e a Cx43 apresentou desorganização e aumento da imunorreatividade após 7 dias, concomitantemente com GFAP. Células amácrinas apoptóticas encontram-se acopladas a células vizinhas por Cx36. O papel funcional das JCs foi avaliado, utilizando bloqueadores, para verificar a viabilidade/morte de células. Carbenoxolone (CBX), reduziu o espalhamento da apoptose, após 4h, enquanto a quinina, teve o mesmo efeito após 1h. A distribuição de núcleos apoptóticos confirmou que a utilização de bloqueadores de JCs reduz a propagação da apoptose. A quinina, mas não o CBX, diminuiu a expressão de caspases iniciais e efetoras. O controle da permeabilidade de canais de JCs pode participar de estratégias de neuroproteção. / The neuroprotection stands out as one of the most pursued hot topics in applied neurosciences. The gap junctions (GJ), formed by connexin (Cx) are involved in neurodegeneration injury. Studies using KO animal models endowed apparently contradictory results in relation to the role of coupling in neuroprotection. The aim of this study was to analyze the role of Cx-mediated communication in focal lesion induced by mechanical trauma in the retina, a model that alow the visualization of the focus, penumbra and adjacent areas. We observed distinct regulation of Cx36 and Cx43 during neurodegeneration. The Cx36 did not change during the lesion progression and Cx43 showed disorganized pattern and upregulated after 7 days, the same as GFAP. Apoptotic amacrine cells are coupled with health neighborhood cells by Cx36. The functional role of GJ was evaluated using blockers to verify the viability/cell death. Carbenoxolone (CBX) reduced the spread of apoptosis after 4h while quinine had the same effect after 1h. The distribution of apoptotic nuclei confirmed that the use of GJ blockers reduced the propagation of apoptosis. Quinine, but not CBX, decreases initial and effector caspases expression. The control of GJ channels permeability can participate in neuroprotection strategies.

Atualmente, as pesquisas sobre a as células epiteliais biliares expressam uma grande quantidade de conexina 43. O presente estudo avaliou influência do genótipo de camundongos Cx 43 +/- ou Cx 43 +/+, sobre a hiperplasia de ductos biliares, após a ligação do ducto biliar comum (colédoco). Neste estudo, foram utilizados seis grupos de camundongos BALB/c fêmeas de ambos os genótipos, que foram submetidos à ligação do ducto biliar com fio de seda por meio de procedimento cirúrgico, sendo eutanasiados nos tempos de 48 horas, 7 e 14 dias. Aproveitando-se o campo microscópico, cinco estruturas hepáticas: hepatócitos, arteríolas, vênulas, ductos biliares e veia centrolobular foram quantificados para verificar a existência de possível diferença entre os genótipos. Observou-se na análise quantitativa, diferença significante somente quanto ao número de vasos sanguíneos entre os dois grupos, sendo que as outras estruturas hepáticas quantificadas não apresentaram diferenças significativas. A proliferação celular foi avaliada pela técnica western blot para a proteína PCNA (Proliferation Cell Nuclear Antigen), somente dos grupos de 48 horas pós-cirúrgico, quando ocorre o pico de proliferação. Quanto à análise quantitativa do western blot, não houve diferenças significativas quanto ao genótipo. Já na das bandas protéicas, observou-se maior concentração nos camundongos controle, indicando maior número de células em divisão. / The goal in this study was evidence, after duct biliar common ligation (coledoco), using mice geneticly modified with connection in one of the alels to connexin 43 (Cx 43+/-) and comparing them to the group control (Cx 43+/+), in order to find out the participation of this protein, even though the epithelials biliary cells express a big quantity of cx 43. The experimental outline were made up of three mice groups BALB/c females of different genotypes which were subdued to surgery procedure using a wire of silk 3.0 and euthanased in each 48 hours during 7 to 14 days. Also using the microscopic view the fives hepatics structures such as, hepatocites, arterioles, veins, bile ductules and centrelobular vein were quantified, trying to obtain possible differences among the genetypes and to do the qualification of protein concentration was used the western blot to PCNA in order to compare the cells divided in 48 hours. It has observed in the quantitative analysis, strong difference only in the blood vein number among the two groups, however the orders quantitative hepatics structures did not present strong differences. About the quantitative analysis related to western blot did not have strong differences in the genotype, and finally in the proteic staff it has observed bigger concentration in the mice control showing bigger number of cells in division.

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

O infarto do miocárdio (IM), uma das principais causas de morte nas sociedades industrializadas, é sempre acompanhado por uma notável alteração da modulação autonômica, caracterizada por hiperatividade simpática e diminuição do tono parassimpático ao coração. O bloqueio da atuação do simpático cardíaco tem sido amplamente utilizado como estratégia terapêutica eficaz para redução da morbi-mortalidade em pacientes com IM. Entretanto, há evidências de que o restabelecimento da função parassimpática ao coração pode ser igualmente benéfica, uma vez que a diminuição do parassimpático cardíaco é um fator de risco independente de morte súbita. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da inibição da acetilconinesterase plasmática (AChE), por meio da administração endovenosa do brometo de piridostigmina (PIR), sobre o eletrocardiograma (ECG), hemodinâmica e modulação autonômica apos o IM agudo em ratos. Ratos foram anestesiados com uretana e mantidos a uma temperatura de 36-37 ºC. Tiveram eletrodos subcutâneos para registro do ECG implantados, e a artéria e veia femoral cateterizadas para medida direta de PA e administração de drogas, respectivamente. Experimentos preliminares foram realizados para determinação de uma dose de PIR que não causasse grande repercussão hemodinâmica. A atividade da acetilcolinesterase plasmática, bem como o tono autonômico cardíaco também foram avaliados em ratos normais. Em outro protocolo, ratos anestesiados, sob registro contínuo do ECG e PA, tiveram o ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda ligado para provocar um extenso IM e, após 10 min, foram tratados com PIR (0,25 mg/kg, i.v) ou salina (solução fisiológica 0,9%), e os registros foram acompanhados por 4 h. Ratos controles tiveram o tórax aberto, mas a artéria coronária foi mantida intacta. Ao final, os ratos tiveram o coração retirado para avaliação da extensão da isquemia miocárdica e para o estudo da conexina 43. A administração endovenosa de PIR foi efetiva em reduzir a atividade da AChE e provocou uma discreta redução da FC (438±8 para 387±10 bpm), sem alteração da PA. Ratos tratados com PIR tiveram menor tono simpático e maior tono vagal cardíaco que os ratos que receberam salina. O tratamento com PIR diminuiu a incidência de arritmias nos animais com IM e aumentou a porcentagem de ratos que sobreviveram até a 4ª hora após o infarto (72 vs 58% nos não tratados). A PIR também preveniu o aumento do intervalo QTc, observado após o IM em ratos não tratados (=-2±4, vs 33±13 ms). A quantidade de conexina 43 foi marcadamente reduzida pelo IM em ratos não tratados (0,7±0,1 vs 2,2±0,4 ua), redução esta que não ocorreu nos ratos com IM tratados com PIR (1,3±0,3 ua). Por fim, foi realizado um ensaio, in vitro, em cardiomiócitos da linhagem H9c2 em cultura, e foi observado que a PIR preveniu a degradação da Cx43 induzida por meio isquêmico durante 4 horas. Portanto, a administração aguda de PIR provocou uma bradicardia pouco intensa, sem repercussões hemodinâmicas importantes, aumentou o tono vagal cardíaco, preveniu o prolongamento do intervalo QTc, diminuiu a incidência de arritmias, e preveniu a degradação da Cx43 nos corações dos ratos infartados. / Myocardial infarction (MI), a leading cause of death in industrialized societies, is always accompanied by a remarkable change in cardiovascular autonomic modulation, characterized by sympathetic overactivity and decreased vagal tone to the heart. The blockade of the cardiac sympathetic activity has been widely used as an effective therapeutic strategy to reduce morbidity and mortality in patients with MI. However, there is evidence that improvement of parasympathetic function can also be beneficial since reduction of cardiac vagal function is an independent risk factor for sudden death. The aim of this study was to evaluate the influence of inhibition of plasma acetilconinesterase (AChE), by intravenous administration of pyridostigmine bromide (PYR) on the electrocardiogram (ECG), hemodynamics and cardiovascular autonomic modulation shortly after MI in rats. Rats were anesthetized with urethane and maintained on a heating pad. Subcutaneous electrodes to record the ECG were installed and catheters were inserted into femoral artery and vein for measurement of blood pressure and drug administration, respectively. Preliminary experiments were performed to determine a dose of PYR that would not cause major hemodynamic consequences. Plasma AChE activity, and cardiac autonomic tone were also evaluated in normal rats. Then, anesthetized rats under continuous recording of ECG and BP, had the anterior descending branch of the left coronary artery ligated to elicit extensive MI and, after 10 min, were treated with PYR (0.25 mg/kg, iv) or saline (0.9% NaCl) and monitored for the next 4 h. Control rats had the chest open, but coronary artery was kept intact. At the end, the rats had the heart removed to determine the size of myocardial isquemia and to study connexin 43. Intravenous administration of PYR was effective in reducing AChE activity of and caused a mild reduction in HR (438±8 to 387±10 bpm) with no change in BP. Also, rats treated with PYR had lower sympathetic and higher cardiac vagal tone as compared to untreated rats. The treatment with PYR decreased the incidence of arrhythmias after MI and increased the percentage of rats that survived until the 4th hour after infarction (72 vs 58 % in untreated). PYR also prevented the increase in QTc interval observed after MI in untreated rats (=-2±4 vs 33±13 ms). The amount of connexin 43 was markedly reduced by MI in untreated rats (2.24±0.46 vs 0.72±0.14 au), nevertheless, this reduction was not observed in infarcted rats that received PYR (1.31±0.29 au). Finally, an in vitro assay was performed on the line H9c2 cardiomyocytes in culture, and it was observed that PYR prevented the degradation of Cx43 induced by ischemic medium for 4 hours. Therefore, the acute administration of PYR caused mild bradycardia without hemodynamic repercussions, increased vagal tone, prevented the prolongation of the QTc interval and decreased the incidence of arrhythmias and prevented the degradation of Cx43 in infarcted rat hearts.

As junções comunicantes são canais protéicos formados entre células adjacentes que permitem a passagem de moléculas e íons menores do que 1kDa; conexinas são proteínas que formam estas junções. Vêm sendo demonstradas na literatura a diminuição da capacidade de comunicação celular e alterações na expressão e/ou localização das conexinas em neoplasias. Este estudo foi realizado com o intuito de se verificar a influência da deleção de um dos alelos da Cx43 na carcinogênese pulmonar. Para tanto, camundongos geneticamente manipulados heterozigotos (Cx43± ou selvagens (Cx43±) de ambos os sexos receberam 3g/kg de uretana aos 15 e 17 dias de idade, e foram sacrificados após 25 semanas. As quantificações macro e microscópicas das lesões revelaram que os camundongos Cx43± apresentaram maior multiplicidade de adenomas pulmonares. Estes apresentavam também maior taxa de proliferação celular, avaliada pela quantificação de núcleos positivos para o PCNA. As expressões das Cxs 26, 32, 43 e 46, presentes no epitélio pulmonar, foram avaliadas por PCR em tempo real (RT-PCR) e por imunoistoquímica. A expressão da Cx43 revelou-se cerca de 50% menor em camundongos Cx43± quando comparada à dos correspondentes Cx43+/+, como esperado. Estudos in vitro mostraram que os pneumócitos de tipo II (APTII) extraídos de camundongos Cx43±, apresentaram capacidade de comunicação menor do que os APTII de camundongos Cx43+/+. Quando submetidos ao tratamento com uretana, a expressão de Cx 43 aumentou em 100% no tecido pulmonar. As demais Cxs tiveram a expressão reduzida pelo tratamento e não foram evidenciadas no epitélio pulmonar livre de lesões após o tratamento com uretana. Não foi detectada a expressão da Cx43 e da Cx32 nos adenomas provenientes dos camundongos Cx43±. A expressão das Cxs 26 e 46 foi correlacionada com o fenótipo papilífero das lesões. Constatou-se que a Cx32 acumulava-se no citoplasma das células epiteliais pulmonares e teve sua expressão, juntamente com a da Cx43, associada ao sexo, provavelmente contribuindo para a menor susceptibilidade das fêmeas aos adenomas induzidos pela uretana. Em conclusão, a redução da expressão da Cx43 conferiu maior susceptibilidade ao desenvolvimento de adenomas pulmonares pela uretana. Este foi o primeiro estudo in vivo mostrando a influência da deleção de um único alelo da Cx43 na carcinogênese / Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43 in carcinogenesis

As junções comunicantes são canais protéicos formados entre células adjacentes que permitem a passagem de moléculas e íons menores do que 1kDa; conexinas são proteínas que formam estas junções. Vêm sendo demonstradas na literatura a diminuição da capacidade de comunicação celular e alterações na expressão e/ou localização das conexinas em neoplasias. Este estudo foi realizado com o intuito de se verificar a influência da deleção de um dos alelos da Cx43 na carcinogênese pulmonar. Para tanto, camundongos geneticamente manipulados heterozigotos (Cx43± ou selvagens (Cx43±) de ambos os sexos receberam 3g/kg de uretana aos 15 e 17 dias de idade, e foram sacrificados após 25 semanas. As quantificações macro e microscópicas das lesões revelaram que os camundongos Cx43± apresentaram maior multiplicidade de adenomas pulmonares. Estes apresentavam também maior taxa de proliferação celular, avaliada pela quantificação de núcleos positivos para o PCNA. As expressões das Cxs 26, 32, 43 e 46, presentes no epitélio pulmonar, foram avaliadas por PCR em tempo real (RT-PCR) e por imunoistoquímica. A expressão da Cx43 revelou-se cerca de 50% menor em camundongos Cx43± quando comparada à dos correspondentes Cx43+/+, como esperado. Estudos in vitro mostraram que os pneumócitos de tipo II (APTII) extraídos de camundongos Cx43±, apresentaram capacidade de comunicação menor do que os APTII de camundongos Cx43+/+. Quando submetidos ao tratamento com uretana, a expressão de Cx 43 aumentou em 100% no tecido pulmonar. As demais Cxs tiveram a expressão reduzida pelo tratamento e não foram evidenciadas no epitélio pulmonar livre de lesões após o tratamento com uretana. Não foi detectada a expressão da Cx43 e da Cx32 nos adenomas provenientes dos camundongos Cx43±. A expressão das Cxs 26 e 46 foi correlacionada com o fenótipo papilífero das lesões. Constatou-se que a Cx32 acumulava-se no citoplasma das células epiteliais pulmonares e teve sua expressão, juntamente com a da Cx43, associada ao sexo, provavelmente contribuindo para a menor susceptibilidade das fêmeas aos adenomas induzidos pela uretana. Em conclusão, a redução da expressão da Cx43 conferiu maior susceptibilidade ao desenvolvimento de adenomas pulmonares pela uretana. Este foi o primeiro estudo in vivo mostrando a influência da deleção de um único alelo da Cx43 na carcinogênese / Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43Gap junctions are communicating protein channels formed between adjacent cells that allow the exchange of molecules and ions smaller than 1kDa; connexins are proteins that form these junctions. Studies in the literature have been showing the lower level of cell communication capacity and alterations in the expression and/or localization of connexins in neoplasia. This study was performed to verify the influence of the deletion of one allele of Cx43 on lung carcinogenesis. Genetically manipulated heterozygous (Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43± or wild type mice (Cx43+/+) were injected with 3g/kg of at the age of 15 and 17 days and were euthanized after 25-weeks. Macroscopic and microscopic quantification of pulmonary lesions revealed that Cx43± mice presented higher multiplicity of pulmonary adenomas. These presented also a higher cell proliferation index, as evaluated by counting PCNA positive nuclei. Cxs 26, 32, 43 and 46 expressions in the pulmonary epithelium were investigated by Real-Time PCR and by immunohistochemistry. Cx43 expression was about 50% lower in Cx43± mice, in comparison to Cx43+/+ mice, as expected. In vitro studies showed that the APTII cells extracted from Cx43± mice presented a reduced communication capacity. When treated with urethane, the expression of Cx43 was increased by 100%. Other Cxs were down-regulated after the treatment with urethane, and were not observed lung areas devoid of adenomas after the treatment with urethane. Cx43 and Cx32 were not detected in Cx43± mouse adenomas. However, Cx26 and Cx46 were correlated with papillary lesions. Cx32 was cumulated in the cytoplasm of the lung epithelial cells and its expression, together Cx43, were associated with the sex, maybe contributing to the lower susceptibility of the female mice to urethane. In conclusion, the reduced expression of Cx43 determines a higher susceptibility to the development of pulmonary adenomas by urethane. This study was the first in vivo showing the influence of the deletion of one allele of Cx43 in carcinogenesis

Duzentos e quarenta e cinco neoplasias de glândula perianal de cães dos arquivos do Departamento de Patologia da FMVZ/ USP, de 1984 à 2004, foram revisadas histologicamente. A grande maioria dos casos (34%) foi classificada como adenoma moderadamente diferenciado, grupo II, em machos com mais de oito anos de idade o que reflete a dependência androgênica dessas neoplasias. A análise quantitativa da proliferação celular e apoptose nos diferentes tipos histológicos de neoplasias, hiperplasia e tecido normal dessas glândulas determinou um padrão paralelo de aumento de ambas as quantificações. Com os resultados do índice de crescimento ajustado obtivemos que, embora os carcinomas tenham um nível de proliferação celular muito maior que os adenomas (grupo I), esses têm um potencial de crescimento maior, levando-se em conta a apoptose. Investigamos, também, a expressão de Cx43, 26 e 32 nessas glândulas perianais com métodos imunoistoquímicos. A Cx 43 expressava-se em glândulas perianais normais, hiperplásicas, adenomas (grupo I) e adenomas moderadamente diferenciados. Nos adenomas pouco diferenciados (grupo II), a expressão estava reduzida e não se expressava nos carcinomas (grupo III). A Cx 26 acumulava-se no citoplasma nas glândulas normais, hiperplásicas, adenomas (grupo I) e adenomas moderadamente diferenciados (grupo II). Nos adenomas pouco diferenciados (grupo II), a expressão estava reduzida e, ausente, nos carcinomas. A Cx 32 não foi identificada em nenhum dos grupos (I, II e III) ou glândulas normais e hiperplásicas. Concluindo, Cx 43 e Cx26 são importantes para a homeostasia de glândula perianal normal, podendo estar associadas aos receptores de andrógenos presentes em suas células. Este foi o primeiro estudo mostrando a apoptose e sua influência na fase promocional da carcinogênese e, também, o primeiro estudo mostrando a expressão de Cx43, Cx 26 citoplasmática e ausência de expressão da Cx 32 em glândulas perianais normais, hiperplásicas e neoplásicas em cães / Two hundred and forty five neoplasms of the perianal glands of dogs from the archives of the Department of Pathology of the FMVZ/USP, 1984 to 2004, have been reviewed hystologically. Most of the cases (34%) were classified as moderately differentiated adenomas, group II, in males over 8 years of age, which showed an androgenic dependence of these neoplasms. The quantitative analysis of the cellular proliferation and apoptosis, in the different hystologic types of neoplasia, hyperplasia and normal tissue of these glands, determined a parallel pattern of increase in both quantifications. The values of the net growth index showed that although carcinomas have a much higher level of proliferation than adenomas (group I), these latter have a much higher potential of growth, taking into account the effect of the apoptosis. The occurrence of Cx 43, 26 and 32 in these perianal glands was also investigated by immunohystochemical methods. Cx 43 expression was present in normal, hyperplasic, adenomas (group I) and moderately differentiated adenomas perianal glands. In poorly differentiated adenomas (group II), the expression was reduced and was absent in carcinomas. Cx 26 was accumulated in the cytoplasm in normal, hyperplasic, adenomas (group I) and moderately differentiated adenomas glands. In poorly differentiated adenomas (group II), the expression was reduced and was absent in carcinomas. Cx 32 was not found in all groups (I, II, III), normal and hyperplasic glands. In conclusion, Cx 43 and Cx 26 are important for homeostasis of normal canine perianal glands, being able to be associated with the androgen receptors present in their cells. This was the first study showing the apoptosis and its influence on the promotional phase of carcinogenesis and, also, the first study showing the occurrence of Cx 43, cytoplasmatic Cx 26 and no expression of Cx 32 in normal, hyperplasic and neoplastic canine perianal glands

Atualmente, as pesquisas sobre a as células epiteliais biliares expressam uma grande quantidade de conexina 43. O presente estudo avaliou influência do genótipo de camundongos Cx 43 +/- ou Cx 43 +/+, sobre a hiperplasia de ductos biliares, após a ligação do ducto biliar comum (colédoco). Neste estudo, foram utilizados seis grupos de camundongos BALB/c fêmeas de ambos os genótipos, que foram submetidos à ligação do ducto biliar com fio de seda por meio de procedimento cirúrgico, sendo eutanasiados nos tempos de 48 horas, 7 e 14 dias. Aproveitando-se o campo microscópico, cinco estruturas hepáticas: hepatócitos, arteríolas, vênulas, ductos biliares e veia centrolobular foram quantificados para verificar a existência de possível diferença entre os genótipos. Observou-se na análise quantitativa, diferença significante somente quanto ao número de vasos sanguíneos entre os dois grupos, sendo que as outras estruturas hepáticas quantificadas não apresentaram diferenças significativas. A proliferação celular foi avaliada pela técnica western blot para a proteína PCNA (Proliferation Cell Nuclear Antigen), somente dos grupos de 48 horas pós-cirúrgico, quando ocorre o pico de proliferação. Quanto à análise quantitativa do western blot, não houve diferenças significativas quanto ao genótipo. Já na das bandas protéicas, observou-se maior concentração nos camundongos controle, indicando maior número de células em divisão. / The goal in this study was evidence, after duct biliar common ligation (coledoco), using mice geneticly modified with connection in one of the alels to connexin 43 (Cx 43+/-) and comparing them to the group control (Cx 43+/+), in order to find out the participation of this protein, even though the epithelials biliary cells express a big quantity of cx 43. The experimental outline were made up of three mice groups BALB/c females of different genotypes which were subdued to surgery procedure using a wire of silk 3.0 and euthanased in each 48 hours during 7 to 14 days. Also using the microscopic view the fives hepatics structures such as, hepatocites, arterioles, veins, bile ductules and centrelobular vein were quantified, trying to obtain possible differences among the genetypes and to do the qualification of protein concentration was used the western blot to PCNA in order to compare the cells divided in 48 hours. It has observed in the quantitative analysis, strong difference only in the blood vein number among the two groups, however the orders quantitative hepatics structures did not present strong differences. About the quantitative analysis related to western blot did not have strong differences in the genotype, and finally in the proteic staff it has observed bigger concentration in the mice control showing bigger number of cells in division.