Anexina A5 (ANXA5) é uma proteína intracelular humana de 36kDa com alta afinidade pela fosfatidilserina que é seletivamente externalizada na superfície de células apoptóticas. A apoptose apresenta um papel importante na fisiologia normal e em numerosos estados patológicos. A aplicação clínica da ANXA5 em imagem da apoptose tem sido desenvolvida em oncologia, transplante de órgãos e doenças cardiovasculares. Várias estratégias para radiomarcação da proteína têm sido descritas, incluindo marcação direta, derivatização com quelante bifuncional (BFC), produção de proteína mutante ou peptídeos análogos. Muitas técnicas de marcação com 99mTc têm sido descritas utilizando diferentes núcleos, tais como [Tc=O]+3, [99mTc]HYNIC, [TcºN]+2 e [Tc(CO3)]+1. Neste estudo, avaliamos a influência do núcleo de 99mTc no comportamento biológico e propriedades físico-químicas da anexina radiomarcada. A radiomarcação utilizando o núcleo [TcºN]+2 foi realizada em duas etapas incluindo a reação do 99mTcO4 - com SDH na presença de SnCl2 e PDTA para obter o intermediário 99mTcN-SDH, seguida da adição de ANXA5. Os resultados obtidos não estão em acordo com a literatura, apesar da alta eficiência na produção do intermediário. O núcleo [Tc=O]+3 foi produzido usando a etilenodicisteina 7 (EC) como BFC. Para derivatização empregou-se o TSTU para obter o éster succinato correspondente. Diferentes razões de ANXA5:EC foram estudadas e todas as condições de marcação resultaram em alta pureza radioquímica, porém diferenças foram observadas na lipofilicidade, estabilidade, distribuição biológica e afinidade por células apoptóticas. A ANXA5-HYNIC também produziu a proteína radiomarcada com alta pureza radioquímica. A estabilidade das ANXA5 radiomarcadas foi avaliada após incubação à temperatura ambiente, a 28°C e em incubação em soro humano a 37°C. A análise destes resultados demonstrou que a ANXA5- EC-99mTc (razão 10-2) foi o composto mais estável em todas as condições estudadas. O ensaio de coeficiente de partição demonstrou que os compostos do EC apresentam uma menor lipossolubilidade em relação a ANXA5-HYNIC-99mTc. A atividade biológica das anexinas radiomarcadas foi avaliada em células PC-3 com apoptose radioinduzida demonstrando que a ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) foi a proteína com maior porcentagem de ligação específica. A biodistribuição in vivo das anexinas radiomarcadas demonstrou uma alta captação na região abdominal, especialmente para a ANXA5-HYNIC-99mTc. Os resultados indicam que ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) pode ser uma alternativa atrativa para o uso da ANXA5-HYNIC-99mTc em imagem de receptores de fosfatidilserina. / Annexin A5 (ANXA5) is an intracellular human protein of 36 kDa with high affinity for membrane-bound phosphatidylserine that is selectively exposed on the surface of cells undergoing apoptosis. Apoptosis is important in normal physiology and innumerous pathologic states. Clinical applications for ANXA5 imaging are being developed in oncology, organ transplantation and cardiovascular diseases. Many strategies to radiolabel the protein have been described, including direct labeling, derivatization through a bifunctional chelanting agent (BFC), production of mutated protein or peptide analogs. Several 99mTc-labeling techniques have been reported using different cores, including [Tc=O]+3, [Tc]HYNIC, [TcºN]+2 and [Tc(CO3)]+1. In this study, we evaluated the influence of 99mTc cores on biological behavior and physico-chemical properties of radiolabeled annexin. Radiolabeling procedure using [TcºN]+2 core was a two-step procedure including the reaction of 99mTcO4 - with SDH in the presence of SnCl2 and PDTA to obtain the intermediate 99mTcN-SDH, and successive addition of ANXA5. The results obtained were not satisfactory, despite the high efficiency in the production of the intermediate. The [Tc=O]+3 core was produced using the ethylenedicysteine (EC) as BFC. TSTU was 9 employed in the derivatization to produce the corresponding hydroxysuccinimide ester. Different ANXA5:EC ratios were studied and all labeling conditions resulted in high radiochemical yield but with differences in lipophilicity, stability, biological distribution and affinity for apoptotic cells. The HYNIC-ANXA5 also produced the labeled protein with high radiochemical yield. The stability of the radiolabeled ANXA5 was evaluated after storing at room temperature, at 2 - 8° C and in human serum at 37° C. The analysis of these results showed that the 99mTc-EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the most stable compound in all the studied conditions. Partition coefficient assay resulted in lower lipophilicity for EC-complexes than 99mTc-HYNIC-ANXA5. The biological activity of radiolabeled annexins was studied in PC-3 cells with radiation induced apoptosis showing that 99mTc- EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the protein with higher percentage of specific binding. In vivo biodistribution of the radiolabeled annexins showed a high uptake in the abdominal region, especially for the HYNIC compound. The results indicated that 99mTc-EC-ANXA5 (10-2) may be an attractive alternative to 99mTc-HYNIC-ANXA5 for the in vivo imaging of phosphatidylserine receptors.

Anexina A5 (ANXA5) é uma proteína intracelular humana de 36kDa com alta afinidade pela fosfatidilserina que é seletivamente externalizada na superfície de células apoptóticas. A apoptose apresenta um papel importante na fisiologia normal e em numerosos estados patológicos. A aplicação clínica da ANXA5 em imagem da apoptose tem sido desenvolvida em oncologia, transplante de órgãos e doenças cardiovasculares. Várias estratégias para radiomarcação da proteína têm sido descritas, incluindo marcação direta, derivatização com quelante bifuncional (BFC), produção de proteína mutante ou peptídeos análogos. Muitas técnicas de marcação com 99mTc têm sido descritas utilizando diferentes núcleos, tais como [Tc=O]+3, [99mTc]HYNIC, [TcºN]+2 e [Tc(CO3)]+1. Neste estudo, avaliamos a influência do núcleo de 99mTc no comportamento biológico e propriedades físico-químicas da anexina radiomarcada. A radiomarcação utilizando o núcleo [TcºN]+2 foi realizada em duas etapas incluindo a reação do 99mTcO4 - com SDH na presença de SnCl2 e PDTA para obter o intermediário 99mTcN-SDH, seguida da adição de ANXA5. Os resultados obtidos não estão em acordo com a literatura, apesar da alta eficiência na produção do intermediário. O núcleo [Tc=O]+3 foi produzido usando a etilenodicisteina 7 (EC) como BFC. Para derivatização empregou-se o TSTU para obter o éster succinato correspondente. Diferentes razões de ANXA5:EC foram estudadas e todas as condições de marcação resultaram em alta pureza radioquímica, porém diferenças foram observadas na lipofilicidade, estabilidade, distribuição biológica e afinidade por células apoptóticas. A ANXA5-HYNIC também produziu a proteína radiomarcada com alta pureza radioquímica. A estabilidade das ANXA5 radiomarcadas foi avaliada após incubação à temperatura ambiente, a 28°C e em incubação em soro humano a 37°C. A análise destes resultados demonstrou que a ANXA5- EC-99mTc (razão 10-2) foi o composto mais estável em todas as condições estudadas. O ensaio de coeficiente de partição demonstrou que os compostos do EC apresentam uma menor lipossolubilidade em relação a ANXA5-HYNIC-99mTc. A atividade biológica das anexinas radiomarcadas foi avaliada em células PC-3 com apoptose radioinduzida demonstrando que a ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) foi a proteína com maior porcentagem de ligação específica. A biodistribuição in vivo das anexinas radiomarcadas demonstrou uma alta captação na região abdominal, especialmente para a ANXA5-HYNIC-99mTc. Os resultados indicam que ANXA5-EC-99mTc (razão 10-2) pode ser uma alternativa atrativa para o uso da ANXA5-HYNIC-99mTc em imagem de receptores de fosfatidilserina. / Annexin A5 (ANXA5) is an intracellular human protein of 36 kDa with high affinity for membrane-bound phosphatidylserine that is selectively exposed on the surface of cells undergoing apoptosis. Apoptosis is important in normal physiology and innumerous pathologic states. Clinical applications for ANXA5 imaging are being developed in oncology, organ transplantation and cardiovascular diseases. Many strategies to radiolabel the protein have been described, including direct labeling, derivatization through a bifunctional chelanting agent (BFC), production of mutated protein or peptide analogs. Several 99mTc-labeling techniques have been reported using different cores, including [Tc=O]+3, [Tc]HYNIC, [TcºN]+2 and [Tc(CO3)]+1. In this study, we evaluated the influence of 99mTc cores on biological behavior and physico-chemical properties of radiolabeled annexin. Radiolabeling procedure using [TcºN]+2 core was a two-step procedure including the reaction of 99mTcO4 - with SDH in the presence of SnCl2 and PDTA to obtain the intermediate 99mTcN-SDH, and successive addition of ANXA5. The results obtained were not satisfactory, despite the high efficiency in the production of the intermediate. The [Tc=O]+3 core was produced using the ethylenedicysteine (EC) as BFC. TSTU was 9 employed in the derivatization to produce the corresponding hydroxysuccinimide ester. Different ANXA5:EC ratios were studied and all labeling conditions resulted in high radiochemical yield but with differences in lipophilicity, stability, biological distribution and affinity for apoptotic cells. The HYNIC-ANXA5 also produced the labeled protein with high radiochemical yield. The stability of the radiolabeled ANXA5 was evaluated after storing at room temperature, at 2 - 8° C and in human serum at 37° C. The analysis of these results showed that the 99mTc-EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the most stable compound in all the studied conditions. Partition coefficient assay resulted in lower lipophilicity for EC-complexes than 99mTc-HYNIC-ANXA5. The biological activity of radiolabeled annexins was studied in PC-3 cells with radiation induced apoptosis showing that 99mTc- EC-ANXA5 (ratio 10-2) was the protein with higher percentage of specific binding. In vivo biodistribution of the radiolabeled annexins showed a high uptake in the abdominal region, especially for the HYNIC compound. The results indicated that 99mTc-EC-ANXA5 (10-2) may be an attractive alternative to 99mTc-HYNIC-ANXA5 for the in vivo imaging of phosphatidylserine receptors.

A proteína Anexina A1 (ANXA1), sintetizada e liberada por fagócitos pela ação de glicocorticóides, é uma proteína anti-inflamatória, pois inibe o influxo de neutrófilos para o foco da inflamação, e induz os mecanismos de eferocitose em neutrófilos e macrófagos. Nosso grupo mostrou que a ANXA1 regula a expressão do receptor ativado por proliferadores de peroxissomos (PPAR) em macrófagos. Em continuidade, o presente trabalho investigou o mecanismo da ANXA1 sobre a expressão de PPARγ em macrófagos, e se este controle ocorre em demais leucócitos e tecido adiposo. Para tanto, macrófagos, neutrófilos peritoneais, linfócitos do baço, tecido adiposo epididimal foram obtidos de camundongos machos Balb/c selvagens (wild type, WT) ou geneticamente deficientes para ANXA1 (ANXA1-/-). Os resultados obtidos mostraram que a ANXA1 controla a expressão proteica e gênica de PPARγ em macrófagos, já que os níveis proteico (Western Blot, WB) e de RNAm (Real-time PCR) para PPARγ constitutivo, bem como induzidos pelos tratamentos in vitro com bezafibrato ou pioglitazona estavam reduzidos em macrófagos de animais ANXA1-/- em comparação com os níveis de macrófagos de animais WT, e o efeito parece ser dependente de CREB (WB), já que os níveis constitutivos deste fator de transcrição estavam maiores em macrófagos de animais ANXA1-/-. O tratamento in vitro com cicloheximida (CHX), um inibidor da síntese proteica, reduziu a expressão de PPARγ estimulada por bezafibrato ou LYSO-7 em macrófagos de animais WT, reforçando o papel da ANXA1 na expressão gênica de PPARγ. O FPR2 parece não estar envolvido no efeito, uma vez que o pré-tratamento de macrófagos com o antagonista de FPR2 (WRW4) não modificou a expressão de PPARγ em macrófagos de animais WT. O efeito modulador da ANXA1 ocorre em neutrófilos, mas não em tecido adiposo e linfócitos de animais ANXA1-/-. Ademais, a deficiência de ANXA1 não alterou a apoptose espontânea de neutrófilos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram uma possível via adicional da ANXA1 sobre a resolução da inflamação, controlando a expressão de PPARγ em fagócitos. / Annexin A1 (ANXA1), is a protein synthetized and released by phagocytes due to the action of glucocorticoids, and an anti-inflammatory protein that inhibits neutrophil influx to site of inflammation and induces the mechanisms of efferocytosis in neutrophils and macrophages. Our group has already demonstrated that ANXA1 regulates the expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in macrophages. The present work aimed to investigate the role of ANXA1-dependent mechanisms on the expression of PPARγ in macrophages, and if said role also extends to other leukocytes and adipose tissue. For such, macrophages, peritoneal neutrophils, spleen lymphocytes, epididymal adipose tissue were obtained from male Balb/c wild type mice or from mice lacking ANXA1 genetically (ANXA-/-). Obtained results have demonstrated that ANXA1 regulates both proteic and genic expression of PPARγ in macrophages, as protein (Western Blotting, WB) and mRNA (Real-Time PCR) levels of constitutive PPARγ were reduced in macrophages from ANXA1-/- mice in comparison with the observed levels of macrophages from WT mice; the same is true for increased protein and mRNA levels as induced by in vitro treatments with bezafibrate or pioglitazone. This effect appears to be CREB-dependent (WB), as the constitutive levels of this transcription factor were found to be increased in macrophages from ANXA1-/- mice. In vitro treatment with cycloheximide (CHX), an inhibitor of proteic synthesis, reduced the bezafibrate or LYSO-7 (PPAR pan agonist, 10 µM / 2h) induced expression of PPARγ in WT mice, which further suggests a role for ANXA1 in PPARγ genic expression. FPR2 does not seem to be involved with these effects of ANXA1, as pre-treatment of macrophages from WT mice with an FPR2-antagonist (WRW4) did not alter expression of PPARγ. The modulating effect of ANXA1 can be verified in neutrophils of ANXA-/- mice, but not in adipocytes and lymphocytes from the same animals. Moreover, deficiency of ANXA1 did not affect spontaneous apoptosis of neutrophils. Altogether, the obtained results show the existence of a probable additional pathway with which ANXA1 promotes inflammation resolution, also controlling the expression of PPARγ in phagocytes.

O estudo das propriedades das membranas celulares, assim como sua interação com íons e moléculas é de fundamental importância para o entendimento de processos biológicos complexos, como a formação do tecido ósseo. O osso natural é constituído por compostos orgânicos, especialmente proteínas como o colágeno, e por minerais, como a hidroxiapatita. O processo pelo qual ocorre a formação do componente inorgânico é chamado de biomineralização, um processo complexo mediado pela liberação de vesículas da matriz (VM), secretadas em locais específicos a partir de osteoblastos. Essas VM são ricas nas principais biomoléculas envolvidas nesse processo, como as proteínas anexina, em especial a anexina V (AnxA5), que exercem papel importante como, formação de canais de cálcio e ligação com o colágeno, criando assim um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita a partir de fibrilas de colágeno. No presente estudo foi possível incorporar colágeno e AnxA5 em sistemas modelo para estudos de biomineralização, utilizando-se monocamadas de Langmuir e os filmes Langmuir-Blodgett (LB). As monocamadas foram formadas com os principais grupos carregados de lipídios encontrados nas VM: fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilserina (PS). As monocamadas formadas por lipídios, colágeno e AnxA5 foram depositadas sobre discos de titânio utilizando-se a técnica dos filmes LB. Os filmes formados foram expostos a uma solução que simula o pH e força iônica do fluido corpóreo, de maneira a mimetizar a precipitação de hidroxiapatita. As amostras foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia vibracional na região do infravermelho (FTIR) e difração de raios X (EDX). Além disso, estudou-se as propriedades de molhabilidade e energia livre de superfície das amostras de titânio modificadas. Colágeno e AnxA5 interagiram com os lipídios, como mostrado nas isotermas. Interação preferencial foi observada no sistema binário contendo DPPC e DPPS e na presença de íons cálcio, como ocorre nos sistemas naturais. A presença das proteínas e dos fosfolipídios nos filmes LB sobre as superfícies de titânio foram essenciais para formação de nanopartículas de hidroxiapatita biomimética. / The study of the properties of cell membranes, as well as their interaction with ions and molecules, is of fundamental importance for the understanding of complex biological processes, such as the formation of bone tissue. The natural bone consists of organic compounds, especially proteins like collagen, and minerals, such as hydroxyapatite. The process which the formation of the inorganic component takes place is called biomineralization, a complex process mediated by the release of matrix vesicles (MV), secreted at specific sites from osteoblasts. These MVs are rich in the main biomolecules involved in this process, such as annexin proteins, especially annexin V (AnxA5), which play an important role as calcium channels formation and binding with collagen, thus creating a suitable microenvironment for formation initial and propagation of the hydroxyapatite crystals from collagen fibrils. In the present study, it was possible to incorporate collagen and AnxA5 into model systems for biomineralization studies using Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett (LB) films. The monolayers were formed with the main lipid groups found in MVs: phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). The monolayers formed by lipids, collagen and AnxA5 were deposited on titanium plates using the LB film technique. The films were exposed to a solution that simulates the pH and ionic strength of the body fluid in order to mimic the precipitation of hydroxyapatite. The samples were characterized by scanning electron microscopy (SEM), infrared vibration spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction (XRD). In addition, the wettability and surface free energy properties of the modified titanium samples were studied. Collagen and AnxA5 interacted with lipids, as shown in the isotherms. Preferential interaction was observed in the binary system containing DPPC and DPPS and in the presence of calcium ions, as occurs in natural systems. The presence of the proteins and the phospholipids in the LB films on the titanium surfaces were essential for the formation of biomimetic hydroxyapatite nanoparticles.

O processo de biomineralização óssea é a deposição de cristais de fosfato de cálcio, na forma de hidroxiapatita formando o tecido ósseo. São mediados pelas vesículas da matriz (MVs) que são liberadas no local específico do início da biomineralização. As MVs contêm altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias diversas proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições específicas. Neste trabalho uma atenção especial foi dada a duas proteínas presentes nas MVs: Anexina V (AnxA5) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). A Anexina V é responsável pela formação de um canal de cálcio por meio da associação desta proteína tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. A NPP1 possui a função principal de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP), formando adenosina monofosfato (AMP) e pirofosfato (PPi). Assim, experimentos de expressão de Anexina V e NPP1 foram realizados com o intuito de iniciar os estudos de interação entre as duas proteínas, por meio de reconstituição em lipossomos. A expressão de Anexina V foi realizada em células E. coli BL21(DE3) e induzida por isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG); para purificação, três procedimentos foram necessários, utilizando coluna de níquel, coluna Desalting e coluna de troca iônica (Mono-Q). Experimentos de dicroísmo circular foram realizados com amostras de Anexina V após purificação e mostraram que todas as amostras apresentavam estruturas em -hélice. Pelo método da gota pendente foi estudada a interação de Anexina V com íons Ca2+ (10 mM) em monocamadas constituídas por dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e de uma mistura de composição lipídica 9:1 de DPPC e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS). Os dados obtidos mostraram alta afinidade de Anexina V por monocamadas constituídas de (9:1) DPPC:DPPS na presença de íons Ca2+. A expressão de NPP1 foi realizada com transfecção por meio de eletroporação do DNA recombinante em células COS-1, e seleção com antibiótico G418 após 24 horas de cultivo. Amostras de fração de membrana controle e NPP1 recombinante foram preparadas após 60 horas de cultivo celular e foi observada atividade catalítica na amostra de fração de membrana da NPP1. Todas as amostras de expressão, tanto de Anexina V e NPP1, foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A padronização da Anexina V foi obtida com sucesso, porém com relação à NPP1, experimentos ainda devem ser realizados a fim de padronizar a obtenção desta proteína recombinante em quantidade suficiente para continuar os estudos. / The bone biomineralization process is the deposition of calcium phosphate crystals in the form of hydroxyapatite forming the bone tissue. They are mediated by matrix vesicles (MVs) that are released at the specific site of the onset of biomineralization. MVs contain high concentrations of Ca2+ ions and inorganic phosphate (Pi), providing a suitable microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. To occur properly, several proteins/enzymes are needed, as well as microenvironments with very particular conditions. In this work, special attention should be given to two proteins present in the MVs: Annexin V (AnxA5) and nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase (NPP1). Annexin V is responsible for the formation of a calcium channel through the association of this protein with both the outer and the inner face of the MVs membrane. NPP1 has the main function of hydrolyzing adenosine triphosphate (ATP), adenosine monophosphate (AMP) and pyrophosphate (PPi).Thus, experiments of expression of Annexin V and NPP1 were performed with the aim of initiating the interaction studies between the two proteins, through reconstitution in liposomes. Annexin V expression was performed in E.coli BL21 (DE3) and the cells were induced by isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG); for purification, three procedures were required using a nickel column, a Desalting column and an ion exchange column (Mono-Q). Circular dichroism experiments were performed with Annexin V samples after purification and showed that all samples contain -helix structures. Using the pendant drop method, the interaction of Annexin V with (10 mM) Ca2+ ions was studied in monolayers composed of dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC) and a mixture of lipid composition 9:1 DPPC and dipalmitoyl-phosphatidyl-serine (DPPS). Data showed high affinity of Annexin V by monolayers constituted of (9: 1) DPPC:DPPS in the presence of Ca2+ ions. NPP1 expression was performed with transfection by electroporation of the recombinant DNA into COS-1 cells and selection with G418 antibiotic after 24 hours of culture. Samples of the control membrane fraction and recombinant NPP1 were prepared and the activity of the membrane fraction of NPP1 was observed in the samples. All expression samples, both AnxA5 and NPP1, were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The standardization of Annexin V has been obtained with success, but regarding NPP1, experiments have yet to be performed to standardize the production of this recombinant protein and to obtain enough quantity to continue the study.

Orientador: Ana Paula Girol / Coorientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Eliane Gonçalves de Freitas / Banca: Carla Patrícia Carlos / Resumo: O processo inflamatório causado pelo tabagismo está relacionado a diferentes tipos de doenças como enfisema pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e aterosclerose. Neste cenário, a proteína anti-inflamatória AnxA1 pode representar uma alternativa terapêutica. Por essas razões, o objetivo da pesquisa foi avaliar os efeitos do peptídeo mimético Ac2-26 da proteína AnxA1, em modelo de tabagismo. Ratas Wistar foram divididas em 3 grupos (n=10/grupo): expostos ao fumo não tratados (F) e tratados com o peptídeo (F+Ac2-26) e controles (C). Os grupos de animais expostos ao fumo foram colocados em um equipamento específico da Unidade Didática e de Pesquisa Experimental (UDPE) das Faculdades Integradas Padre Albino (FIPA), e expostos à queima de 10 cigarros comerciais, um após o outro, 2x/dia, por 5 semanas. O grupo C foi mantido no mesmo regime, porém na ausência da fumaça do cigarro e tratamento. Para avaliar a eficácia do Ac2-26, animais F+Ac2-26 foram administrados intraperitonealmente com o peptídeo (1mg/kg), 1x/dia, antes da primeira exposição ao cigarro. As ratas foram pesadas e tiveram a pressão arterial aferida no início e final do experimento. No período final, a ventilação pulmonar foi verificada por meio da pletismografia e também foram realizadas imagens de raios-X. Os animais foram eutanasiados e coletados o lavado bronco alveolar (LBA) para quantificações de células inflamatórias e citocinas, o sangue para dosagens bioquímicas de citocinas e hemoglobina e os... / Abstract: The inflammatory process caused by smoking is related to different kinds of diseases such as pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and atherosclerosis. In this scenario, an anti-inflammatory protein AnxA1 may represent a therapeutic alternative. For these reasons, the objective of this research was to analyze the effects of the mimetic peptide Ac2-26 of the AnxA1 protein, in a smoking model. Wistar rats were divided into 3 groups (n = 10/group). The groups of animals exposed to smoke were placed in a specific equipment of the Didactic and Experimental Research Unit (UDPE) of the Integrated Colleges Padre Albino (FIPA), and exposed to the burning of 10 cigarettes, one after another, 2x / day for 5 weeks. To evaluate the efficacy of Ac2-26, CS+Ac2-26 animals were administered intraperitoneally with peptide (1mg / kg), 1x / day, prior to first exposure to the cigarette. Group C was maintained in the same regimen, but in the absence of cigarette smoke or treatment. The rats were weighed and had blood pressure measured at the beginning and ending of the experiment. In the final period, pulmonary ventilation was verified through plethysmography and also performed ray-X images. The animals were euthanized and collected the alveolar bronchus (BAL) for quantification of inflammatory cells and cytokines, the blood for biochemical measurements of cytokines and hemoglobin and organs, lung and trachea, for histopathological and immunohistochemical studies. The physiological analyzes showed weight loss, increased blood pressure, reductions and in the pulmonary frequency and ventilation, as well as macroscopic alternative in the lung dimensions by X-ray images in group CS. While, in CS+Ac2-26, these values were similar to controls. The histopathological analyzes showed enlargement of the intra-alveolar spaces and increased lymphoid tissue (BALT), and loss of the ... / Mestre

A proteína Anexina A1 (ANXA1), sintetizada e liberada por fagócitos pela ação de glicocorticóides, é uma proteína anti-inflamatória, pois inibe o influxo de neutrófilos para o foco da inflamação, e induz os mecanismos de eferocitose em neutrófilos e macrófagos. Nosso grupo mostrou que a ANXA1 regula a expressão do receptor ativado por proliferadores de peroxissomos (PPAR) em macrófagos. Em continuidade, o presente trabalho investigou o mecanismo da ANXA1 sobre a expressão de PPARγ em macrófagos, e se este controle ocorre em demais leucócitos e tecido adiposo. Para tanto, macrófagos, neutrófilos peritoneais, linfócitos do baço, tecido adiposo epididimal foram obtidos de camundongos machos Balb/c selvagens (wild type, WT) ou geneticamente deficientes para ANXA1 (ANXA1-/-). Os resultados obtidos mostraram que a ANXA1 controla a expressão proteica e gênica de PPARγ em macrófagos, já que os níveis proteico (Western Blot, WB) e de RNAm (Real-time PCR) para PPARγ constitutivo, bem como induzidos pelos tratamentos in vitro com bezafibrato ou pioglitazona estavam reduzidos em macrófagos de animais ANXA1-/- em comparação com os níveis de macrófagos de animais WT, e o efeito parece ser dependente de CREB (WB), já que os níveis constitutivos deste fator de transcrição estavam maiores em macrófagos de animais ANXA1-/-. O tratamento in vitro com cicloheximida (CHX), um inibidor da síntese proteica, reduziu a expressão de PPARγ estimulada por bezafibrato ou LYSO-7 em macrófagos de animais WT, reforçando o papel da ANXA1 na expressão gênica de PPARγ. O FPR2 parece não estar envolvido no efeito, uma vez que o pré-tratamento de macrófagos com o antagonista de FPR2 (WRW4) não modificou a expressão de PPARγ em macrófagos de animais WT. O efeito modulador da ANXA1 ocorre em neutrófilos, mas não em tecido adiposo e linfócitos de animais ANXA1-/-. Ademais, a deficiência de ANXA1 não alterou a apoptose espontânea de neutrófilos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram uma possível via adicional da ANXA1 sobre a resolução da inflamação, controlando a expressão de PPARγ em fagócitos. / Annexin A1 (ANXA1), is a protein synthetized and released by phagocytes due to the action of glucocorticoids, and an anti-inflammatory protein that inhibits neutrophil influx to site of inflammation and induces the mechanisms of efferocytosis in neutrophils and macrophages. Our group has already demonstrated that ANXA1 regulates the expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in macrophages. The present work aimed to investigate the role of ANXA1-dependent mechanisms on the expression of PPARγ in macrophages, and if said role also extends to other leukocytes and adipose tissue. For such, macrophages, peritoneal neutrophils, spleen lymphocytes, epididymal adipose tissue were obtained from male Balb/c wild type mice or from mice lacking ANXA1 genetically (ANXA-/-). Obtained results have demonstrated that ANXA1 regulates both proteic and genic expression of PPARγ in macrophages, as protein (Western Blotting, WB) and mRNA (Real-Time PCR) levels of constitutive PPARγ were reduced in macrophages from ANXA1-/- mice in comparison with the observed levels of macrophages from WT mice; the same is true for increased protein and mRNA levels as induced by in vitro treatments with bezafibrate or pioglitazone. This effect appears to be CREB-dependent (WB), as the constitutive levels of this transcription factor were found to be increased in macrophages from ANXA1-/- mice. In vitro treatment with cycloheximide (CHX), an inhibitor of proteic synthesis, reduced the bezafibrate or LYSO-7 (PPAR pan agonist, 10 µM / 2h) induced expression of PPARγ in WT mice, which further suggests a role for ANXA1 in PPARγ genic expression. FPR2 does not seem to be involved with these effects of ANXA1, as pre-treatment of macrophages from WT mice with an FPR2-antagonist (WRW4) did not alter expression of PPARγ. The modulating effect of ANXA1 can be verified in neutrophils of ANXA-/- mice, but not in adipocytes and lymphocytes from the same animals. Moreover, deficiency of ANXA1 did not affect spontaneous apoptosis of neutrophils. Altogether, the obtained results show the existence of a probable additional pathway with which ANXA1 promotes inflammation resolution, also controlling the expression of PPARγ in phagocytes.

Las proteínas de la familia de las anexinas se caracterizan su unión a los fosfolípidos de la bicapa lipídica de forma dependiente de calcio, a través de los motivos "repetición anexina" presentes en su secuencia. Esta capacidad ha sido descrita mediante ensayos in-vitro, aunque poco se conoce de la funcionalidad de este comportamiento en los sistemas biológicos. Además del calcio, otros componentes celulares, como el citoesqueleto de actina, podrían modular in-vivo la unión de anexinas a las membranas biológicas.En trabajos previos nuestro grupo determinó in-vivo como la anexina A6 era capaz de reclutarse hacia el compartimento endocítico en paralelo a la internalización de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), uno de cuyos componentes mayoritarios es el colesterol. En el presente trabajo describimos como el colesterol por si sólo es capaz de inducir este reclutamiento, de forma independiente de calcio. En primer lugar, se determinó que existía una población de anexina A6, asociada a membranas (totales o endosomales) aisladas en ausencia de calcio, y que ésta era liberada al solubilizar el colesterol presente en la bicapa (con digitonina). Además, la acumulación de colesterol en el compartimento endocítico tardío (mediante el tratamiento de las células con la droga U18666A) inducía el reclutamiento in-vivo de anexina A6 hacia éstas membranas, proceso observado mediante fraccionamiento celular (aislamiento de endosomas e immunodetección por western blot) e immunocitoquímica (co-localizando, en estos endosomas a la anexina con el lípido no esterificado -marcado con filipina-). El incremento de la asociación colesterol-dependiente se observó asimismo para la anexina A6 añadida de forma exógena (a membranas aisladas carentes de anexina endógena) descartando la afectación del tráfico intracelular como causa del efecto observado. A continuación se determinó la funcionalidad derivada de la interacción de otro tipo de lipoproteínas involucradas en el metabolismo de colesterol, las HDL (de alta densidad), con la superficie de células CHO. Describimos la activación de Ras de forma subsiguiente a la unión de la partícula a la membrana. involucrando a uno de sus receptores más importantes, el Scavenger Receptor Type B-I (SR-BI). Al estudiar el efecto de la sobreexpresión de anexina A6 sobre esta señalización a partir de las HDL y su receptor SR-BI, en células CHO, se observó una disminución de la activación de Ras y Raf (pero no del resto de MAPKs). Por otro lado, la observación in-vivo (videomicroscopía) de la distribución celular de anexina A6-GFP sobreexpresada en células CHO, muestra como incrementos del calcio intracelular ejercen un reclutamiento masivo y muy rápido de la anexina A6 hacia la membrana plasmática (o dominios subyacentes a ésta), siguiendo un patrón similar al observado para algunas GAPs (GTPase activating proteins). Esta observación, así como la interacción ya descrita in-vitro entre la anexina A6 y p120GAP, sugiere la hipótesis que la translocación calcio-dependiente de la anexina hacia la membrana modularía la concentración de p120GAP, colaborando así en la desactivación de Ras. En este sentido, observamos como la sobreexpresión de anexina A6 induce, en células CHO, un incremento de la asociación de p120 GAP a fracciones de membrana enriquecidas en Ras.La caracterización de estos dominios de concentración de anexina A6 en la membrana indica que se trata de lipid rafts (dominios enriquecidos en colesterol) con presencia de citoesqueleto de actina. Postulamos que, en la célula viva, el calcio, el colesterol y el citoesqueleto de actina colaboran determinando la localización de la anexina en la membrana, desde donde actuaría como un modulador de la señalización a través de Ras. / The annexin family of proteins is characterized by the presence of a tandemly repeated calcium dependant - phospholipid binding domain, called "annexin repeat". However, other cell constituents, like actin cytoskeleton or cholesterol, have been proposed to play a role in annexin binding to biological membranes. In this sense, here we demonstrate in-vivo that cholesterol itself is able to modulate the intracellular distribution of membrane-associated annexin A6, in a calcium - independent manner. Concretely, cholesterol accumulation in the late endocytic compartment, upon treatment of the cells with "U18666A", is accompanied by annexin VI recruitment to this structures. Also, treatment of crude membrane extracts from early or late endosomes with digitonin, a cholesterol-sequestering agent, is able to displace a significant membrane-bound population of annexin VI, associated in a calcium independent manner. Finally, we demonstrate that this redistribution correlates with an increased binding of recombinant GST-annexin VI to cholesterol-enriched endocytic membranes in-vitro.After determining the role of cholesterol in mediating annexin VI recruitment to membranes, we aimed to characterize the signalling pathway activated upon HDL (one of the key lipoproteins in cholesterol metabolism) binding to the cell surface of CHO cells. Here we describe that HDL activates MAP kinases through the small GTPase Ras. We involve in this activation one of the most physiologically important receptors for HDL, the "Scavenger Receptor Type B-I" (SR-BI). We then analyzed this activation pathway in an annexin VI-overexpressing derived cell line, finding that annexin VI partially inhibits the signalling through the small GTPase Ras and blocks the subsequent activation of Raf. This diminished Ras activation is completely dependant on the presence of the enzyme PKC, and does not ultimately lead to a deficient MAPK activation. We also observed that annexin VI overexpression promoted the association of p120 GAP (one of the Ras inactivators and also an annexin VI-interacting protein) with Ras - enriched membrane fractions, suggesting an increased Ras - p120 GAP complex formation in these cells. In summary, we suggest that annexin VI is able to modulate signalling activation from the membranes and that, in this process, both calcium- and cholesterol-mediated membrane recruitment of annexin VI are involved.

Orientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Paula Rahal / Banca: Jorge Chahine / Banca: Carla Patrícia Carlos / Banca: Érika Cristina Pavarino / Resumo: Os avanços recentes nos mecanismos de inflamação e a descoberta de vários mediadores endógenos anti-inflamatórios levaram a novas investigações sobre as possibilidades terapêuticas. A demonstração, em estudos científicos, da ação anti-inflamatória da proteína anexina A1 (ANXA1) e do seu peptídeo mimético Ac2-26, têm sido fonte de sucesso para o desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta da interação biofísica da piplartina (PL) com a região N-terminal da ANXA1 abriu um novo e instigante campo de investigação para o nosso grupo de pesquisa. Diante destas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atuação da PL nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), ativadas pelo lipopolissacarídeo (LPS). Ainda, se a interação Ac2-26/PL influência nas ações anti-inflamatórias da PL, favorecendo ou atenuando os seus efeitos nos processos inflamatórios. Inicialmente foi utilizada a Espectroscopia de Absorbância UV-Vis e de Fluorescência para investigar as interações entre o ligante PL e Ac2-26. In vitro, as células HUVEC foram ativadas pelo LPS (10 μg/mL), nos tempos de 8, 24, 48 e 72 horas, seguido pelos tratamentos com Ac2-26 (1µM) e/ou PL (10µM), demonstrando resultados expressivos em 24 e 72 horas. Os efeitos foram avaliados nos seguintes aspectos: proliferação celular, viabilidade celular, dosagens da quimiocina MCP-1 e das citocinas IL-8 e IL-1β e expressão da proteína α-tubulina. A presença de um anel trimetoxiaromático na estrutura da PL, o... / Abstract: Recent advances in inflammation mechanisms and the discovery of several endogenous anti-inflammatory mediators have led to further investigations into the therapeutic possibilities. The demonstration, in scientific studies, of the annexin A1 protein (ANXA1) anti-inflammatory action and its peptide mimetic Ac2-26, have been a source of success for the development of new drugs. The discovery of the biophysical interaction of piplartin (PL) with the N-terminal region of ANXA1 opened a new and exciting field of investigation for our research group. In view of these considerations, the objective of the present study was to investigate the role of PL in lipopolysaccharide (LPS) activated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Also, if the interaction Ac2-26/PL influences the anti-inflammatory actions of PL, favoring or attenuating its effects on inflammatory processes. Initially, UV-Vis Absorbance Spectroscopy and Fluorescence were used to investigate the interactions between the PL ligand and Ac2-26. In vitro, HUVEC cells were activated by LPS (10 μg/mL) at 8, 24, 48 and 72 hours, followed by treatments with Ac2-26 (1μM) and/or PL (10μM), demonstrating expressive results in 24 and 72 hours. The effects were evaluated in the following aspects: cell proliferation, cell viability, MCP-1 chemokine and IL-8 and IL-1β cytokines and α-tubulin protein expression. The presence of a trimethoxyaromatic ring in the PL structure, which may favor an interaction with tubulin, motivated ... / Doutor

A esquizofrenia é um dos transtornos psiquiátricos mais importantes, porque afeta pessoas jovens, com evolução em geral para incapacitação funcional e prejuízo social, atingindo cerca de 1% da população. Apresenta igual distribuição entre os sexos, manifestando-se clinicamente no final da adolescência, tendo seu pico entre 15-25 anos, com um forte fator hereditário na sua etiologia. A farmacoterapia tem provado ser o ponto chave na terapêutica da esquizofrenia. É também conhecida a alta incidência de processos inflamatórios em pacientes esquizofrênicos. Os processos apoptóticos alteram a rede neuronal e estão envolvidos na patogênese de várias doenças neurodegenerativas, entre elas, a esquizofrenia. As anexinas pertencem a uma família de proteínas que ligam ambos o cálcio e os fosfolipídios e formam canais de cálcio voltagem dependentes dentro de bicamadas lipídicas planas (Pollard and Rojas, 1988). São associadas com a regulação dos processos de fagocitose, sinalização celular, apoptose e migração leucocitária; sendo uma proteína inibidora citosólica da fosfolipase A2, podem regular vários componentes da reação inflamatória, tais como as citocinas (Damazo, 2006). Fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina envolvida em inflamações sistêmicas e é membro de um grupo de citocinas que estimulam a reação de fase aguda. O fator de necrose tumoral causa a morte apoptótica da célula, proliferação celular, diferenciação, inflamação, origina tumores e replicação viral. O objetivo deste estudo foi avaliar a anexina V e níveis séricos de TNF-E em pacientes com diagnóstico de esquizofrenia e controles. Houve uma diferença significativa na anexina-V e níveis de TNF-E entre pacientes e controles (p <0,001). Os altos níveis de anexina em pacientes com diagnóstico de esquizofrenia podem ser responsáveis pelos níveis reduzidos de TNF-E, devido à sua ação antiinflamatória.