Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Background: Exacerbated or prolonged inflammatory responses can be detrimental to the host, then any antiinflammatory mediators act to regulate the properties of pro-inflammatory factors and ensure the homeostasis of the organic systems. Objectives: Aims: This study has focused in the regulation of expression and the immunomodulatory properties of annexin A1, a protein of 37 KDa, originally known as the second messenger action of glucocorticoids, in inflammatory and infectious processes. Methods: Using molecular (qPCR), biochemical (luminometry) and immunological (flow cytometry, immunofluorescence) tools, we investigated the endogenous and exogenous of ANXA1 and its mimetic peptide (Ac2-26) in different conditions in vitro and in vivo: fungi infection, HIV/SIV infecion, bowel inflammatory disease and renal ischemic injury. Results: The Ac2-26 pre-treatment of PMN and PBMC of human peripheral blood stimulated with opsonized-zymosan inhibited the production of reactive oxygen species in a dose-dependent manner. In parallel, incubation of phagocytes with the peptide was shown to decrease expression of TLR2 receptor, responsible for the recognition of zymosan on phagocyte, suggesting a regulatory mechanism of surface receptor by ANXA1 peptide. Due to last data, the expression of CCR5, chemokine receptor and HIV co-receptor, was investigated in the same in vitro conditions. CCR5 transcription was down-regulated in PBMC from HIV-infected and healthy subjects, partially by ANXA1/FPR pathway. Consistently, both PBMC subject groups showed an impairment of percentage of CCR5+CD4+ T cells after Ac2-26 incubation. In contrast, Ac2-26 showed an up-regulation of CCR5 surface expression in monocytes, however the peptide switched the profile of monocyte subsets, increasing CD14highCD16- and decreasing CD14lowCD16+ populations. The last one is the most susceptible to HIV infection. In conclusion, the data suggest that the action of N-terminal ANXA1 is cell-dependent and may contribute indirectly modulating the HIV-1. Coherently, the study in vivo of ANXA1 expression in a non-human model of AIDS, showed that ANXA1 is regulated during the progression of the disease in the main compartments of infection, the blood and the gut. In comparison with samples of uninfected animals, the ANXA1 transcripts in peripheral blood increased from acute to chronic SIV infection, whereas in the intestinal mucosa it was down-regulated, reaching baseline levels only in chronic infection. Analysis of typical markers of AIDS progression, showed that increased ANXA1 transcripts was significantly correlated with the activation of T cells. However, the expression of ANXA1 had a positive correlation with antiinflammatory cytokines in the blood and in the intestine and a inverse dynamics of viral load and depletion of CD4 T cells, suggesting that activation of its transcription is related to an attempt to reduce the immune depletion during infection. In addition, based on the described differential modulation of the ANXA1 in the gut of primates, another goal was to analyze the expression of ANXA1 in patients with IBD (inflammatory bowel disease) or not treated with immunosuppressive drugs. The correlation among those factors and clinical data were analyzed. In IBD patients, the expression of ANXA1 is reduced in level of mRNA in peripheral blood and protein in the colonic mucosa. In these patients, immunotherapy with infliximab (anti-TNF-alpha) modulates the transcription of ANXA1 and TNF-α, and even systemic lymphocyte activation in accordance with the duration of treatment and the side effects of drugs, such as bacteremia. The dynamics of ANXA1 added to other clinical and immunological factors appear to be associated with the course of IBD. Finally, acute and chronic inflammatory process induced by ischemia/reperfusion (I/R) procedure, revealed that exogenous ANXA1 mimetic peptide granted a remarkable protection against kidney I/R injury, preventing glomerular filtration rate and urinary osmolality decreases and acute tubular necrosis development by affording striking structural protection due to the abortion of neutrophil extravasation, attenuation of macrophage infiltration and regulation of endogenous annexin A1 expression in renal epithelial cells. Conclusions: In a general analysis of all studies presented, we conclude that exogenous ANXA1 and its derived peptides act as key molecules in the modulation of specific activation, immunophenotype and distribution of phagocytes and lymphocytes participating as a line of defense or targeting of infectious agents, via FPRs or not. And, emphasizing the importance of ANXA1 in the defense of homeostasis, although it was found that the pathways related to the regulation of endogenous ANXA1 is differentially activated in tissues and fluids under acute and chronic inflammation caused by viral infection, autoimmunity or hypoxia. / Introdução: As respostas inflamatórias exacerbadas ou prolongadas podem ser prejudiciais para o hospedeiro, então muitos mediadores antiinflamatórios atuam para regular as propriedades dos fatores pró-inflamatórios e garantir a homeostasia dos sistemas. Objetivos: Assim, o foco do presente trabalho foi estudar a regulação da expressão e as propriedades imunomodulatórias da anexina A1, uma proteína de 37 KDa, inicialmente conhecida como a segunda mensageira da ação dos glicocorticóides, em processos inflamatórios e infecciosos. Metodologia: Para tanto, por meio de técnicas moleculares (qPCR), bioquímicas (luminometria) e imunológicas (citometria de fluxo, imunofluorescência), foi investigado o papel endógeno da ANXA1 e exógeno do peptídeo N-terminal da ANXA1 em diferentes condições in vitro e in vivo: infecção fúngica, infecção viral por HIV-1 e SIV, doença inflamatória intestinal e injúria isquêmica renal. Resultados: O peptídeo N-terminal da ANXA1, Ac2-26, quando usado como tratamento prévio de PMN e PBMC do sangue periférico humano estimuladas por zymosan-opsonizado, inibe a produção de espécies reativas de oxigênio de modo dose-dependente. Paralelamente, a incubação dos fagócitos com o peptídeo demonstrou diminuir a expressão do receptor TLR2, responsável pelo reconhecimento de zymosan nos fagócitos, sugerindo um mecanismo de regulação de receptores de superfície pelo Ac2-26. Frente a este dado e a sinalização de ANXA1 via FPRs, a expressão do receptor de quimiocina e coreceptor do vírus HIV-1, CCR5, também foi investigada em tais condições in vitro. Os transcritos de CCR5 diminuíram em PBMCs de indivíduos HIV+ e saudáveis, parcialmente pela via ANXA1/FPR. Consistentemente, Ac2-26 também diminuiu a expressão do CCR5 na superfície de células T CD4+, os principais alvos do vírus. Em contraste, nos monócitos o peptídeo aumentou a expressão de CCR5, no entanto, induziu uma mudança na distribuição dos subfenótipos, diminuindo a quantidade dos monócitos com maior susceptibilidade a infecção por HIV-1 (CD14lowCD16+). A investigação da ANXA1 endógena em um modelo não humano de AIDS, realizado pela infecção de macacos por SIV, mostrou que a expressão transcricional da ANXA1 é regulada durante a progressão da doença nos principais compartimentos de infecção, o sangue e o intestino. Em comparação com as amostras de animais não-infectados, os transcritos de ANXA1 aumentaram gradualmente no sangue periférico entre as fases aguda e crônica da infecção por SIV, enquanto que na mucosa intestinal houve uma regulação negativa, atingindo os níveis basais apenas na infecção crônica. A análise de marcadores típicos da progressão da AIDS mostrou que a expressão de ANXA1 está relacionada à ativação de células T. No entanto, a expressão da ANXA1 tem uma correlação positiva com o número de transcritos de citocinas antiinflamatórias e uma correlação negativa com a carga viral e depleção de células T CD4+ no sangue e no intestino, sugerindo que a ativação da sua transcrição está relacionada a tentativa de diminuir a exaustão imunológica durante a infecção. Frente aos dados da modulação diferencial da ANXA1 no intestino de primatas, o próximo objetivo foi analisar a expressão da ANXA1 nos portadores de IBD (doença inflamatória intestinal) tratados ou não com drogas imunossupressoras. Nos indivíduos com IBD, a expressão da ANXA1 é diminuída em nível de RNAm, no sangue periférico, e proteína, na mucosa colônica. Nestes pacientes, a imunoterapia com infliximab (anti-TNF-α) modulou sistemicamente a transcrição da ANXA1 e do TNF-α, e ainda a ativação linfocitária e a bacteremia. Em suma, a dinâmica da ANXA1 somada a outros elementos imunológicos e clínicos parecem estar associados a progressão do curso das IBDs. Finalmente, os processos inflamatórios agudo e crônico induzidos pelo procedimento de isquemia e reperfusão (I/R) revelou que o peptídeo mimético ANXA1 exógeno protegeu significativamente contra a lesão por I/R renal. Os animais pré-tratados com Ac2-26 mostraram menores taxas de filtração glomerular, osmolalidade urinária e desenvolvimento da necrose tubular aguda, possivelmente, por manter a integridade tecidual devido ao bloqueio total do extravasamento de neutrófilos, à atenuação de infiltração de macrófagos e à regulação da expressão protéica da ANXA1 endógena em células epiteliais renais. Estes resultados apontam um importante papel da ANXA1 na defesa das células epiteliais contra a lesão de I/R e indicam que os neutrófilos são mediadores-chave para o desenvolvimento da lesão do tecido renal após I/R. Conclusões: Em uma análise geral do conjunto de estudos apresentados, é possível concluir que a ANXA1 exógena e seus peptídeos derivados atuam como moléculas chave na modulação específica da ativação, imunofenótipo e distribuição dos fagócitos e linfócitos que participam como linha de defesa ou como alvo de agentes infecciosos, por meio da ligação com os FPRs ou por uma via ainda não elucidada. E, enfatizando a relevância da ANXA1 na defesa da homeostasia, ainda foi constatado que as vias relacionadas à regulação da ANXA1 endógena são ativadas diferencialmente em tecidos e fluidos sob inflamação aguda e crônica iniciadas quer seja por infecção viral, autoimunidade ou hipóxia. / Doutor em Genética e Bioquímica

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

Orientador: Flávia Cristina Rodrigues-Lisoni / Coorientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Eny Maria Goloni Bertollo / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: O carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) representa o sexto câncer mais comum em todo o mundo, sendo o câncer na cavidade oral o mais comum entre as regiões anatômicas de abrangência do CECP. Há evidências de que o desenvolvimento e a progressão do câncer dependem não somente de suas características genéticas, mas também de interações de suas células com as células do microambiente tumoral. A carcinogênese também está relacionada com angiogênese e processos inflamatórios, que podem ser controlados pela ação de mediadores anti-inflamatórios, e entre esses, destacamos a proteína anti-inflamatória anexina A1 (ANXA1). Mas os mecanismos pelos quais a ANXA1 atua na tumorigênese e a sua relação com a interação entre células endoteliais e tumorigênicas não são bem conhecidos e, considerando seu papel na inflamação, compreendem um alvo importante para estudo. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo, analisar a interação de células endoteliais e tumorigênicas juntamente com a ação do peptídeo sintético Ac2-26 da proteína ANXA1(ANXA1Ac2-26) em linhagem de carcinoma de cabeça e pescoço, verificando como o peptídeo atua junto ao meio condicionado de células endoteliais e/ou de células tumorais, elucidando como os fatores excretados por ambas as células e o peptídeo atuam no processo tumorigênico. Para isso, a observação da morfologia foi realizada em microscópio invertido, o índice de proliferação pela curva de crescimento, a viabilidade celular foi determinada pelo... / Abstract: Head and Neck Squamous Cells Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the world, being cancer in the oral cavity the most common among the anatomical regions of HNSCC. There is evidence that the development and progression of cancer depends not only on its genetic characteristics, but also because of the interactions of cells, cancer and tumor microenvironment cells. Carcinogenesis is also related to angiogenesis and inflammatory processes which can be controlled by the action of anti-inflammatory mediators, among which we highlight the anti-inflammatory protein annexin A1 (ANXA1). But the mechanisms that ANXA1 acts in tumorigenesis and its relation to the interaction between endothelial and tumorigenic cells are not well known and considering their role in inflammation, comprise an important target for study. Therefore, the present study aimed to analyze the interaction of endothelial and tumorigenic cells with the action of the synthetic peptide Ac2-26 of the ANXA1 protein (ANXA1Ac2-26) in head and neck carcinoma cell line, verifying how the peptide acts with the conditioned medium of endothelial cells and/or tumor cells, elucidating how the factors excreted by both cells and the peptide acts in the tumorigenic process. For this, the morphology observation was performed under inverted microscope, proliferation index by growth curve, cell viability was determined by the colorimetric method MTS (IC50), cell migration by transwell bilayer method, genotoxicity by ... / Mestre

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV), pertence ao grupo de endemias consideradas prioritárias no mundo. É uma doença grave e com poucas opções de tratamento e, mesmo quando adequadamente tratada, possui um nível de letalidade de 5 a 7%. Apesar da expansão da doença, o tratamento para leishmaniose visceral não obteve avanços. O tratamento da leishmaniose possui apenas dois grupos de medicamentos utilizados: os antimonoiais e os não-antimoniais. Os compostos nitroheterocíclicos foram utilizados pois acredita-se que a eficácia desta classe de compostos está na habilidade desses compostos inibirem a tripanotiona redutase. Os compostos foram obtidos por via sintética e refinados pelo método QSAR por remodelagem molecular. Foram obtidos séries de compostos nitroheterocíclicos, onde a série BSF (derivados 5-nitro-2-furfurilideno - azometínicos) foi utilizada para avaliar a bioatividade in vitro destes compostos frente à Leishmania. Para avaliação da atividade anti-Leishmania foram usadas formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum. Os métodos utilizados para determinar a atividade anti-Leishmania dos compostos da série BSF foram os métodos colorimétrico 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] 2,5 brometo de difeniltetrazólio (MTT), apoptose por Anexina V e reação de Griess (dosagem de NO). Ao comparar os resultados com os respectivos controles positivos e com a Anfotericina B, foi observado que a atividade anti-Leishmania em formas promastigotas de L. L. infantum dos compostos foi menos significativa quando comparado com anfotericina B. Porém, ao comparar os resultados de macrófagos infectados e citotoxicidade com a anfotericina B, os compostos mostraram resultados expressivos, ao apresentarem baixa taxa de citotoxicidade e significativa diminuição da proliferação intracelular. A expressiva produção de nitrito pelos macrófagos infectados tratados com os compostos da série BSF sugere-se que estes compostos possuam uma ação indireta de potencialização de produção de NO nas células hospedeiras. Os resultados in vitro utilizando derivados nitroheterocíclicos mostraram atividade destes sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares, e são compostos em potencial para avaliação de efeito in vivo contra leishmaniose visceral / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) belongs to the group of endemics prioritized worldwide. It is a serious disease with few treatment options, and even when adequately treated, it has a lethality level of 5 to 7%. Despite the expansion of the disease, treatment for visceral leishmaniasis has not made progress. Treatment of leishmaniasis has used only two groups of drugs: antimonial and non-antimonial. Nitro-heterocyclic compounds were used in this study because it is believed that the effectiveness of this class of compounds is the ability to inhibit trypanothione reductase. The compounds were obtained synthetically and refined by QSAR method molecular remodeling. Nitro-heterocyclic series of compounds were obtained, where the BSF series (derived from 5-nitro-2-furfurylidene - azometínicos) was used to evaluate the in vitro bioactivity of these compounds against the Leishmania. To evaluate the anti-Leishmania activity, promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum were used. The methods used to determine the anti-Leishmania activity of the BSF series compounds were colorimetric methods 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), apoptosis by Annexin V, and Griess reaction (IN dosage). By comparing the results with the respective positive controls and with amphotericin B, it was observed that the anti-Leishmania activity of L. L. infantum promastigotes of the compounds was less significant when compared with amphotericin B. However, comparing the results of infected macrophages and cytotoxicity with amphotericin B, compounds showed significant results, presenting low cytotoxicity rate and significant decrease in intracellular proliferation. The significant nitrite production by infected macrophages treated with the BSF series compounds suggested that these compounds have an indirect potentiation action in the NO production in the host cells. In vitro results using nitro-heterocyclic derivatives showed their activity on these promastigotes and intracellular amastigotes, and presented them as potential compounds for in vivo effect evaluation against visceral leishmaniasis

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

Submitted by SARA DE SOUZA COSTA null (sarah_sc_0705@hotmail.com) on 2017-03-30T13:36:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Sara de Souza Costa.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-04-06T13:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_ss_me_sjrp.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T13:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_ss_me_sjrp.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) Previous issue date: 2017-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As lesões uterinas são causas importantes de desconforto, infertilidade e óbito entre as mulheres no Brasil e no mundo. O câncer de endométrio é um tumor maligno frequente e sua incidência vem aumentando nas últimas décadas. Enquanto, o tumor uterino benigno mais comum, o leiomioma, acomete cerca de 40% das mulheres na idade reprodutiva, sendo relacionado à menorragia, dismenorreia e infertilidade. Investigações indicam que o microambiente tumoral é crucial para o avanço do câncer, sendo caracterizado, principalmente, pela composição alterada da matriz extracelular, alta densidade de microvasos e abundância de células inflamatórias, como mastócitos (MCs). MCs desgranulados liberam fatores quimiotáticos e proteases, como triptase e quimase, para o meio extracelular, contribuindo na degradação da matriz extracelular, promoção da angiogênese, propiciando ambiente favorável para invasão tumoral e remodelação tecidual por meio de proteólises seletivas na matriz e ativação de metaloproteinases. Outro aspecto importante no crescimento tumoral é a proteína anti-inflamatória Anexina A1 (ANXA1), relacionada à regulação dos processos de crescimento e migração/invasão celular, sendo seus efeitos mediados por receptores para peptídeos formilados (FPRs), especialmente FPR1 e FPR2. Diante da importância dos MCs e da ANXA1/FPR no desenvolvimento tumoral, o objetivo desta investigação foi analisar a heterogeneidade dos MCs e a expressão das proteínas ANXA1, FPR1 e FPR2 em biópsias humanas das variáveis clínico-patológicas de útero normal: hiperplasia endometrial simples (HES), adenomiose, leiomiomas e adenocarcinoma (ADC) endometrial de graus I e II. Os MCs foram quantificados de acordo com seu estado de ativação e expressão das proteases triptase e quimase. A expressão da ANXA1 e seus receptores FPR1 e FPR2 nos MCs e tecidos uterinos foram analisadas nas diferentes biópsias estudadas. Nossos resultados mostraram MCs intactos e desgranulados, no endométrio e miométrio normais e aumentados na HES, margens tumorais nos leiomiomas, adenomiose e ADC endometrial de graus I e II, e diminuídos significantemente na região tumoral do leiomioma. Com relação à heterogeneidade, os MCs triptase-positivos foram observados em maior quantidade. As expressões endógenas da ANXA1 e do FPR1 foram observadas nos tecidos uterinos e MCs, com ausência para o FPR2. As modulações dos MCs, da proteína ANXA1 e de modo específico do receptor FPR1, nas variáveis clínico-patológicas das lesões uterinas investigadas indicam o envolvimento dessas células e a interação ANXA1/FPR1 no desenvolvimento de inflamação e neoplasia uterina. / Uterine lesions are important causes of discomfort, infertility and death among women in Brazil and in the world. Endometrial cancer is a frequent malignant tumor and its incidence has been increasing in the last decades. Besides, the most common benign uterine tumor, leiomyoma, affects about 40% of women at reproductive age, being related to menorrhagia, dysmenorrhea and infertility. Investigations indicate that the tumor microenvironment is crucial for the advancement of cancer, being characterized mainly by the altered composition of the extracellular matrix, high microvessel density and abundance of inflammatory cells, such as mast cells (MCs). Degranulated MCs release chemotactic and protease factors, such as tryptase and chymase, to the extracellular medium, contributing to the degradation of the extracellular matrix, promoting angiogenesis, providing a favorable environment for tumor invasion and tissue remodeling through selective proteolysis in the matrix and activation of metalloproteinases. Another important aspect of tumor growth is the anti-inflammatory protein Annexin A1 (ANXA1), related to the regulation of growth and migration / invasion processes, and its effects mediated by receptors for formylated peptides (FPRs), especially FPR1 and FPR2. The objective of this investigation was to analyze the heterogeneity of the MCs and the expression of the ANXA1, FPR1 and FPR2 proteins in human biopsies of clinical-pathological variables of normal uterus: simple endometrial hyperplasia (HES), adenomyosis, leiomyomas and endometrial adenocarcinoma (ADC) of grades I and II. MCs were quantified according to their state of activation and expression of tryptase and chymase proteases. Expression of ANXA1 and its FPR1 and FPR2 receptors in the MCs and uterine tissues were analyzed in the different biopsies studied. Our results showed intact and degranulated MCs in the normal endometrium and myometrium and increased MCs in HES, tumor margins in leiomyomas, adenomyosis and endometrial ADC of grades I and II, but significantly decreased in the leiomyoma tumor region. In relation to the heterogeneity, it was observed that the tryptase-positive MCs were observed in greater quantity. Endogenous expressions of ANXA1 and FPR1 were observed in uterine tissues and MCs, but absent for FPR2. Modulations of MCs and ANXA1 protein expression and the specificity of FPR1 receptor immunolabeling in the clinical-pathological variables of the investigated uterine lesions indicate the involvement of these cells and the interaction ANXA1/FPR1 in the development of inflammation and uterine neoplasia.

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma. / Asthma is a chronic inflammatory disease characterized by airways hyperreactivity, eosinophil accumulation, mucus secretion as well as remodeling. During the establishment of the inflammatory process, endogenous mediators are released in order limit the progression of the pathological process (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Glucocorticoid hormones are considered as critical based on their potent anti-inflammatory activity, which is at least partially dependent on the release of intermediate factors such as the protein annexin-1 (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). In this study, we investigated the role of annexin-1 (AnxA1) and its derived peptide Ac2-26 (50 200 g/animal) on the experimental model of allergic asthma in mice. BALB/c (AnxA1+/+) and AnxA1 knockout mice (AnxA1-/-) were sensitized with subcutaneous injection of ovalbumin (OVA 50 g) plus aluminum hydroxide (5 mg). On day 14, animals were boosted intraperitoneally with OVA (25 g) and on days 19, 20 and 21 post-sensitization, mice were challenged intranasally with OVA (25 g). Treatment was performed by intranasal administration of Ac2-26 peptide (50 - 200 g), 1 h before each challenge. The analyses were made 24 h after the last provocation and included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to methacholine (3-27 mg/ml) by invasive plethysmography, ii) morphology by classical histological techniques; iii) collagen quantification and iv) cytokine generation evaluated by ELISA. It was noted that AnxA1-/- mice, when sensitized and challenged with OVA showed exacerbation of airways hyperreactivity, eosinophils present in the bronchoalveolar lavage and peribronchial tissue, collagen deposition and increased levels of IL-13 as compared to AnxA1+/+. In parallel, it was showed that treatment of AnxA1+/+ mice with the Ac2-26 peptide markedly inhibited airways hyperreactivity, peribronchial eosinophil accumulation, mucus production and the generation of IL-13 and eotaxin-1 and -2. Taken together our results show that AnxA1-/- mice were more responsive to antigen stimulation, which is an indicative that AnxA1 plays an important regulatory role in the murine allergic inflammatory response. In addition, the inhibitory effect of the Ac2-26 peptide on the allergic lung inflammation clearly indicated that it seems to be a promising anti-inflammatory and anti-allergic agent to be used in the asthma therapy.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma. / Asthma is a chronic inflammatory disease characterized by airways hyperreactivity, eosinophil accumulation, mucus secretion as well as remodeling. During the establishment of the inflammatory process, endogenous mediators are released in order limit the progression of the pathological process (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Glucocorticoid hormones are considered as critical based on their potent anti-inflammatory activity, which is at least partially dependent on the release of intermediate factors such as the protein annexin-1 (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). In this study, we investigated the role of annexin-1 (AnxA1) and its derived peptide Ac2-26 (50 200 g/animal) on the experimental model of allergic asthma in mice. BALB/c (AnxA1+/+) and AnxA1 knockout mice (AnxA1-/-) were sensitized with subcutaneous injection of ovalbumin (OVA 50 g) plus aluminum hydroxide (5 mg). On day 14, animals were boosted intraperitoneally with OVA (25 g) and on days 19, 20 and 21 post-sensitization, mice were challenged intranasally with OVA (25 g). Treatment was performed by intranasal administration of Ac2-26 peptide (50 - 200 g), 1 h before each challenge. The analyses were made 24 h after the last provocation and included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to methacholine (3-27 mg/ml) by invasive plethysmography, ii) morphology by classical histological techniques; iii) collagen quantification and iv) cytokine generation evaluated by ELISA. It was noted that AnxA1-/- mice, when sensitized and challenged with OVA showed exacerbation of airways hyperreactivity, eosinophils present in the bronchoalveolar lavage and peribronchial tissue, collagen deposition and increased levels of IL-13 as compared to AnxA1+/+. In parallel, it was showed that treatment of AnxA1+/+ mice with the Ac2-26 peptide markedly inhibited airways hyperreactivity, peribronchial eosinophil accumulation, mucus production and the generation of IL-13 and eotaxin-1 and -2. Taken together our results show that AnxA1-/- mice were more responsive to antigen stimulation, which is an indicative that AnxA1 plays an important regulatory role in the murine allergic inflammatory response. In addition, the inhibitory effect of the Ac2-26 peptide on the allergic lung inflammation clearly indicated that it seems to be a promising anti-inflammatory and anti-allergic agent to be used in the asthma therapy.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-α e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante Δugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa Δugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante Δugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese. / Aspergillus fumigatus is the main etiological agent of invasive aspergillosis, the main opportunistic fungal infection of Hematologial Unitys patients, especially those with long-term neutropenia. Upon filamentation, this angioinvasive fungus can activate and damage the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), which in response switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. This activation is characterized by the expression of pro-inflammatory molecules such cytokines, chemokines and adhesion molecules. Recently, our group performed the comparison of HUVEC activation upon interaction with a wild type and the UGM1 mutant strains of A. fumigatus. The Δugm1 strain, which presents an increased production of the cell wall galactosaminogalactan, showed a hyper adherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation, when compared with the wild type strain. The receptors involved in the pathogen-host interaction or the signaling pathways after endothelial activation by A. fumigatus remain unknown. Thus, the aim of this study was to investigate the differentially expressed proteins in HUVECs upon interaction with A. fumigatus, using the 2D-DIGE proteomic approach. Briefly, HUVECs were challenged with germlings of A. fumigatus wild type Af293 and Δugm1 strains and then submitted to protein extraction. The total HUVEC protein extracts were labeled with different CyDyes and fractionated by 2D electrophoresis. Quantitative analysis to determine the differences in protein abundance amongst interacted cells vs. control endothelial cells was performed using the software DeCyder. Five differentially expressed proteins were identified by MS/MS including galectin-1 and annexin A2, both overexpressed after the interaction. These two proteins are described elsewhere to be associated with host-pathogen interaction. Besides, galectin-1 showed an ~25% increase after interaction with the Δugm1 strain and it is plausible that this particular protein could be a putative receptor for galactose-containing polymers of the A. fumigatus cell wall and annexin A2 could be involved in signalizing pathways upon interaction. However, other experimental evidences, under development, are necessary to confirm this hypothesis.