Grapevine anthracnose is an important disease, responsible for severe yield losses in humid regions around the world. This study aimed to: i: identify the causal agents of grapevine anthracnose in Brazil; ii: characterize Elsinoë ampelina isolates from Brazil and Australia by means of phylogenetic analyses, morphological features and pathogenicity tests; iii: develop an efficient method for conidial production of E. ampelina; iv: develop and validate a standard area diagram set (SADs) for assessing anthracnose severity on grapevine leaves; and v: study the temporal and spatial progression of anthracnose in a Brazilian vineyard. To identify the causal agents of the disease, leaves, stems and berries with anthracnose symptoms were collected from 38 vineyards in southern and southeastern Brazil and 39 E. ampelina and 13 Colletotrichum spp. isolates were obtained. For E. ampelina isolates, the internal transcribed spacer (ITS), histone H3 (HIS3) and elongation factor 1-α (TEF) sequences were analysed. HIS3 was the most informative region with 55 polymorphic sites. Seven Colletotrichum species were identified: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum and C. cliviae. In pathogenicity tests, only E. ampelina isolates caused anthracnose symptoms on Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' and Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. To characterize E. ampelina from Brazil and Australia, 35 isolates were analysed. ITS and TEF sequences of all isolates were monomorphic. The haplotype network generated from HIS3 dataset showed four distinct haplotypes. High genetic variability was observed in two Brazilian isolates, haplotype EA4, which may have lost the intron region during species evolution. Colonies showed variable coloration, wrinkled texture, absence of spores and slow growth. Brazilian isolates produced conidia larger than conidia from Australian isolates. To induce the conidial production, mycelial fragments were shake-incubated in rainwater and distilled water for 7 days. Isolates produced different concentrations of conidia and the conidial germination was more than 88.5%. In infectivity tests, conidia caused typical anthracnose symptoms on leaves. The SADs developed comprises six true colour diagrams with severity ranging from 1.1 to 27.4%. The use of the SADs improved the accuracy, precision, agreement and inter-rater reliability of the estimates conducted by 12 raters. The temporal and spatial dynamics of anthracnose was carried out in a \'Niagara Rosada\' vineyard in 2014 and 2015. The incidence of vines with diseased leaves, stems and berries and the severity disease on leaves were recorded. Anthracnose symptoms occurred rapidly after bud break and ontogenic resistance was observed for all organs assessed. The monomolecular model showed the best fit to the incidence progress. Temporal analyses suggest that the progress of anthracnose incidence and severity over time is governed mainly by the primary inoculum due to age-related resistance of the vine organs. Spatial analyses showed a predominantly random spatial pattern of diseased vines. In conclusion, this thesis presents a more in-depth understanding of the aetiology and epidemiology of an important grapevine disease. / Antracnose da videira é uma importante doença, responsável por severas perdas de produtividade em regiões húmidas em diversos locais do planeta. Este estudo objetivou: i: identificar o agente causal da antracnose da videira no Brasil; ii: caracterizar isolados de Elsinoë ampelina do Brasil e Austrália através de análises filogenéticas, morfologia e testes de patogenicidade; iii: desenvolver um método eficiente para produção de conídios de E. ampelina; iv: desenvolver e validar uma escala diagramática para avaliar a severidade de antracnose em folhas; e v: estudar o progresso temporal e espacial da antracnose em um vinhedo brasileiro. Para identificar os agentes causais da doença, folhas, ramos e bagas com sintomas de antracnose foram coletados em 38 vinhedos das regiões sul e sudeste do Brasil e 39 isolados de E. ampelina e 13 isolados de Colletotrichum spp. foram obtidos. Para isolados de E. ampelina, sequências de espaçador interno transcrito (ITS), histona H3 (HIS3) e fator de elongação 1-α (TEF) foram analisadas. HIS3 foi a região mais informativa com 55 sítios polimórficos. Foram identificadas sete espécies de Colletotrichum: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum e C. cliviae. Nos testes de patogenicidade, somente isolados de E. ampelina causaram sintomas de antracnose em Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' e Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. Para a caracterização de E. ampelina do Brasil e Austrália, 35 isolados foram analisados. Sequências de ITS e TEF de todos os isolados foram monomórficas. A rede de haplótipos gerada a partir de sequências de HIS3 resultou na formação de quatro haplótipos. Alta diversidade genética foi observada em dois isolados brasileiros, haplótipo EA4, sugerindo a perda do intron durante a evolução da espécie. Colônias apresentaram coloração variável, textura enrugada, ausência de esporos e lento crescimento. Isolados brasileiros apresentaram conídios maiores que conídios de isolados australianos. Para induzir a esporulação, fragmentos de micélio foram agitados e incubados em água da chuva e água destilada durante 7 dias. Isolados produziram diferentes concentrações de conídios e a germinação foi superior a 88,5%. Nos testes de infectividade, os conídios causaram sintomas de antracnose em folhas. A escala diagramática desenvolvida compreende seis diagramas em cores reais com severidade variando de 1,1 a 27,4%. O uso da escala diagramática melhorou a acurácia, precisão, concordância e reprodutibilidade das estimativas conduzidas por 12 avaliadores. A dinâmica temporal e espacial da antracnose foi conduzida em vinhedo de \'Niagara Rosada\' em 2014 e 2015. A incidência de videiras com folhas, ramos e bagas sintomáticos e a severidade em folhas foram registradas. Os sintomas de antracnose ocorreram rapidamente após a brotação sendo observada resistência ontogênica em todos os órgãos avaliados. O modelo monomolecular mostrou o melhor ajuste para o progresso da incidência. As análises temporais sugerem que o progresso da incidência e severidade durante o tempo é influenciado principalmente pelo inóculo inicial devido à resistência ontogênica dos órgãos. As análises espaciais mostraram um padrão espacial predominantemente aleatório de videiras sintomáticas. Em conclusão, esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da etiologia e epidemiologia de uma importante doença da videira.

O método empregado na produção de fungos entomopatogênicos teve poucas alterações em mais de 40 anos de utilização no Brasil. A produção adotada nas biofábricas em larga escala é basicamente através da fermentação sólida em arroz com elevado uso de mão de obra e longo tempo de produção. Assim, o presente estudo consistiu em desenvolver estratégias que possam ser implementadas nas diferentes etapas do sistema de produção de Metarhizium anisopliae ESALQ1037, como adição ao arroz de materiais inertes (bagaço de cana-de-açúcar, maravalha, esponja vegetal e palha de arroz) e outros substratos (milheto, flocos de arroz e sagu) para separação dos grãos de arroz e aumento da aeração, uso de blastosporos como inóculo em sistemas bifásicos tendo como substrato sólido o arroz ou mistura de farelos (trigo, milho, aveia, arroz, soja e algodão) ou suportes de crescimento e esporulação (bagaço de cana-de-açúcar, vermiculita, tecido de lã, palha de arroz e maravalha). Foi testado o uso da esterilização por fervura em substituição à autoclavagem e recuperação de conídios por extração em água como substituto ao peneiramento, além de armazenamento em condições de alta e baixa temperatura e umidade: 97%UR e 22ºC; 97%UR e 4ºC; 0%UR e 22ºC; 0%UR e 4ºC. O meio líquido M11 (a base de 45g L-1 glicose e 36g L-1 extrato de levedura) foi o mais adequado para produção de blastosporos (3,0 x 108 blastosporos/mL) e biomassa. A inoculação de blastosporos em arroz resultou em produção maior e mais rápida de conídios (4,51 x 108 conídios/g) em 7 dias de crescimento fúngico. O farelo de trigo inoculado com blastosporos produzidos em meio M11 resultou em maior produção de conídios (1,2 x 109 conídios/g) quando comparado aos farelos e arroz inoculados com suspensão de conídios (máximo de 7,8 x 108 conídios/g). O bagaço de cana-de-açúcar autoclavado seco foi o suporte que resultou em maior produção do fungo quando associado ao meio líquido. A adição ao arroz de bagaço de cana-de-açúcar umedecido, maravalha e esponja vegetal não umedecidas promoveu incremento na produção de conídios (> 3,3 x 109 conídios/g) quando comparado ao arroz somente (1,00 x 109 conídios/g). A exposição do arroz à fervura por 10 e 15 minutos resultou em produção de conídios semelhante à produção em arroz autoclavado, sem a presença de contaminantes. Farelo de trigo foi o substrato mais promissor para produção do fungo especialmente quando misturado ao farelo de arroz (1,75 x 109 conídios/g) na fermentação sólida. Conídios extraídos do arroz por peneiramento ou lavagem em água e recuperados com ou sem a adição de argilas, terra de diatomácea e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias a 22°C e 97% UR. A 22°C e 0% UR, somente os conídios extraídos do arroz por peneiramento e os extraídos em água e recuperados com a adição de argila preta e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias. Estratégias testadas neste estudo para produção e extração de conídios de M. anisopliae são alternativas viáveis para serem incorporadas na produção em larga escala e reduzir o tempo de fermentação e mão de obra, aumentando a eficiência de conversão de substrato em conídios. / The method used in the production of entomopathogenic fungi had few changes in more than 40 years of use in Brasil. The production of large-scale biofactories is basically through solid fermentation in rice with high labor and long production time. Thus, the present study consisted in developing strategies that could be implemented in the different stages of the production system of Metarhizium anisopliae ESALQ1037, as addition to rice of inert materials (sugarcane bagasse, shavings, vegetable sponge, rice straw) and other substrates (millet, rice flakes and sago) for separation of rice grains and increased aeration, use of blastospores as inoculum in biphasic systems having as a solid substrate the rice or mixture of bran (wheat, corn, oats, rice, soybean and cotton) or growth and sporulation supports (sugarcane bagasse, vermiculite, wool, rice straw and shavings). The use of boiling sterilization to replace autoclaving and recovery of conidia by water extraction as a substitute for sieving was tested, as well as storage under high and low temperature and humidity conditions: 97% RH and 22 ºC; 97% RH and 4°C; 0% RH and 22°C; 0% RH and 4°C. The M11 liquid medium (the base of 45g L-1 glucose and 36g L-1 yeast extract) was the most suitable for the production of blastospores (3.0 x 108 blastospores / mL) and biomass. The inoculation of blastospores in rice resulted in larger and faster production of conidia (4.51 x 108 conidia / g) in 7 days of fungal growth. The wheat bran inoculated with blastospores produced in M11 medium resulted in higher conidia production (1.2 x 109 conidia / g) when compared to the bran and rice inoculated with conidial suspension (maximum of 7.8 x 108 conidia / g). The dried autoclaved sugarcane bagasse was the carrier that resulted in higher fungus production when associated with the liquid medium. The addition of moistened sugarcane bagasse and non-moistened shavings and vegetable sponges promoted increase in the production of conidia (> 3.3 x 109 conidia / g) when compared to rice only (1.0 x 109 conidia / g). Exposure of the boil rice for 10 and 15 minutes resulted in conidial production similar to the production in autoclaved rice without the presence of contaminants. Wheat bran was the most promising substrate for the fungus production especially when mixed with rice bran (1.75 x 109 conidia / g) in solid fermentation. Conidia extracted from rice by sieving or washing in water and recovered with or without the addition of clays, diatomaceous earth and kaolin showed viability higher than 92% after storage for 60 days at 22 °C and 97% RH. At 22 °C and 0% RH, only the conidia extracted from the rice by sieving and those extracted in water and recovered with the addition of black clays and kaolin had viability higher than 92% after storage for 60 days. Strategies tested in this study for the production and extraction of conidia of M. anisopliae are viable alternatives to be incorporated in the large scale production and to reduce the time of fermentation and manpower, to increasing the efficiency of conversion of substrate in conidia.

O método empregado na produção de fungos entomopatogênicos teve poucas alterações em mais de 40 anos de utilização no Brasil. A produção adotada nas biofábricas em larga escala é basicamente através da fermentação sólida em arroz com elevado uso de mão de obra e longo tempo de produção. Assim, o presente estudo consistiu em desenvolver estratégias que possam ser implementadas nas diferentes etapas do sistema de produção de Metarhizium anisopliae ESALQ1037, como adição ao arroz de materiais inertes (bagaço de cana-de-açúcar, maravalha, esponja vegetal e palha de arroz) e outros substratos (milheto, flocos de arroz e sagu) para separação dos grãos de arroz e aumento da aeração, uso de blastosporos como inóculo em sistemas bifásicos tendo como substrato sólido o arroz ou mistura de farelos (trigo, milho, aveia, arroz, soja e algodão) ou suportes de crescimento e esporulação (bagaço de cana-de-açúcar, vermiculita, tecido de lã, palha de arroz e maravalha). Foi testado o uso da esterilização por fervura em substituição à autoclavagem e recuperação de conídios por extração em água como substituto ao peneiramento, além de armazenamento em condições de alta e baixa temperatura e umidade: 97%UR e 22ºC; 97%UR e 4ºC; 0%UR e 22ºC; 0%UR e 4ºC. O meio líquido M11 (a base de 45g L-1 glicose e 36g L-1 extrato de levedura) foi o mais adequado para produção de blastosporos (3,0 x 108 blastosporos/mL) e biomassa. A inoculação de blastosporos em arroz resultou em produção maior e mais rápida de conídios (4,51 x 108 conídios/g) em 7 dias de crescimento fúngico. O farelo de trigo inoculado com blastosporos produzidos em meio M11 resultou em maior produção de conídios (1,2 x 109 conídios/g) quando comparado aos farelos e arroz inoculados com suspensão de conídios (máximo de 7,8 x 108 conídios/g). O bagaço de cana-de-açúcar autoclavado seco foi o suporte que resultou em maior produção do fungo quando associado ao meio líquido. A adição ao arroz de bagaço de cana-de-açúcar umedecido, maravalha e esponja vegetal não umedecidas promoveu incremento na produção de conídios (> 3,3 x 109 conídios/g) quando comparado ao arroz somente (1,00 x 109 conídios/g). A exposição do arroz à fervura por 10 e 15 minutos resultou em produção de conídios semelhante à produção em arroz autoclavado, sem a presença de contaminantes. Farelo de trigo foi o substrato mais promissor para produção do fungo especialmente quando misturado ao farelo de arroz (1,75 x 109 conídios/g) na fermentação sólida. Conídios extraídos do arroz por peneiramento ou lavagem em água e recuperados com ou sem a adição de argilas, terra de diatomácea e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias a 22°C e 97% UR. A 22°C e 0% UR, somente os conídios extraídos do arroz por peneiramento e os extraídos em água e recuperados com a adição de argila preta e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias. Estratégias testadas neste estudo para produção e extração de conídios de M. anisopliae são alternativas viáveis para serem incorporadas na produção em larga escala e reduzir o tempo de fermentação e mão de obra, aumentando a eficiência de conversão de substrato em conídios. / The method used in the production of entomopathogenic fungi had few changes in more than 40 years of use in Brasil. The production of large-scale biofactories is basically through solid fermentation in rice with high labor and long production time. Thus, the present study consisted in developing strategies that could be implemented in the different stages of the production system of Metarhizium anisopliae ESALQ1037, as addition to rice of inert materials (sugarcane bagasse, shavings, vegetable sponge, rice straw) and other substrates (millet, rice flakes and sago) for separation of rice grains and increased aeration, use of blastospores as inoculum in biphasic systems having as a solid substrate the rice or mixture of bran (wheat, corn, oats, rice, soybean and cotton) or growth and sporulation supports (sugarcane bagasse, vermiculite, wool, rice straw and shavings). The use of boiling sterilization to replace autoclaving and recovery of conidia by water extraction as a substitute for sieving was tested, as well as storage under high and low temperature and humidity conditions: 97% RH and 22 ºC; 97% RH and 4°C; 0% RH and 22°C; 0% RH and 4°C. The M11 liquid medium (the base of 45g L-1 glucose and 36g L-1 yeast extract) was the most suitable for the production of blastospores (3.0 x 108 blastospores / mL) and biomass. The inoculation of blastospores in rice resulted in larger and faster production of conidia (4.51 x 108 conidia / g) in 7 days of fungal growth. The wheat bran inoculated with blastospores produced in M11 medium resulted in higher conidia production (1.2 x 109 conidia / g) when compared to the bran and rice inoculated with conidial suspension (maximum of 7.8 x 108 conidia / g). The dried autoclaved sugarcane bagasse was the carrier that resulted in higher fungus production when associated with the liquid medium. The addition of moistened sugarcane bagasse and non-moistened shavings and vegetable sponges promoted increase in the production of conidia (> 3.3 x 109 conidia / g) when compared to rice only (1.0 x 109 conidia / g). Exposure of the boil rice for 10 and 15 minutes resulted in conidial production similar to the production in autoclaved rice without the presence of contaminants. Wheat bran was the most promising substrate for the fungus production especially when mixed with rice bran (1.75 x 109 conidia / g) in solid fermentation. Conidia extracted from rice by sieving or washing in water and recovered with or without the addition of clays, diatomaceous earth and kaolin showed viability higher than 92% after storage for 60 days at 22 °C and 97% RH. At 22 °C and 0% RH, only the conidia extracted from the rice by sieving and those extracted in water and recovered with the addition of black clays and kaolin had viability higher than 92% after storage for 60 days. Strategies tested in this study for the production and extraction of conidia of M. anisopliae are viable alternatives to be incorporated in the large scale production and to reduce the time of fermentation and manpower, to increasing the efficiency of conversion of substrate in conidia.

Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B is a cosmopolitan, devastating insect pest due to their direct damages and transmission of plant viruses. Entomopathogenic fungi comprise the most diverse group of pathogens regulating arthropod pest populations in agroecosystems. Anamorphic fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea, and Lecanicillium spp., are among the main biocontrol agents of whitefly populations. Advances in research focusing on virulence, mass production, formulation, and storage stability of fungal propagules are imperative for the development of efficient mycopesticides toward whiteflies and other soft-bodied insects. Therefore, this study placed emphasis on screening for virulent fungal strains, enhancement of efficacy using nonionic surfactants in spray tank-mix, development of liquid culture conditions for rapid production and stabilization processes of single-yeast like cells known as blastospores. Firstly, we selected virulent strains of B. bassiana and I. fumosorosea displaying fastest speed of kill and inciting highest mortality levels of whitefly nymphs and adults along with their ability to produce high numbers of conidia on moistened parboiled rice. Secondly, insecticidal performance was enhanced by combining nonionic surfactants with spore suspensions rendering additive or synergistic effects. These surfactants also allowed reducing the volume application rate without altering fungal bioefficacy. Results from liquid fermentation studies using B. bassiana and I. fumosorosea revealed that appropriate amounts of inexpensive ingredients, such as cottonseed flour and glucose, are suitable for the rapid production of high yields of blastospores (3 days pre-culture and 2-3 days culture). The resultant blastospores of various strains survived well to desiccation and remained viable for more than one year under refrigeration. Moreover, these air-dried blastospores of both fungal species showed higher virulence against whitefly nymphs when compared with solid-substrate produced conidia. Optimized liquid culture production for B. bassiana blastospores was also achieved through the manipulation of oxygen rates and osmotic pressure in the liquid media. Furthermore, these blastospores produced in highly aerated and hyperosmotic liquid medium containing 140 g glucose L-1 were also more virulent to whitefly nymphs than those cells derived from low-osmotic medium amended with 40 g glucose L-1. These optimal conditions were also scaled up in 5-L bioreactor that yielded 1-2 × 1012 viable blastospores L-1 in 6 days at a cost of US$ 0.19 L-1. These blastospores were formulated with diatomaceous earth for air drying or for spray drying. Formulated blastospores of B. bassiana survived dehydration using both drying methods and showed improved shelf life when stored under vacuumpackaged at 4 °C rather than 28 °C. However, when these blastospores were actively packaged with dual action oxygen-moisture scavenging system, blastospores showed prolonged stability for up to 7 months at 28 °C and still remained virulent to whiteflies. Therefore, this low-cost production and stabilization method for the rapid production of shelf stable, virulent blastospores of B. bassiana and I. fumosorosea may expand the commercial use of mycopesticides for insect control in mainstream agriculture. / A mosca-branca, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) biótipo B, é uma praga cosmopolita e devastadora devido aos prejuízos oriundos dos seus danos diretos e transmissão de vírus. Fungos entomopatogênicos compreendem um grupo diversificado, que desempenha ação importante na regulação de populações de praga em agroecossistemas. Fungos ascomicetos anamórficos, como Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea e Lecanicillium spp., constituem relevantes agentes de biocontrole de moscas-brancas. Avanços na pesquisa focando virulência, produção massal, formulação e estabilização de propágulos fúngicos são fundamentais para o desenvolvimento de micopesticidas eficientes contra moscas-brancas e outros insetos. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar isolados fúngicos virulentos à mosca-branca; aumentar a eficácia mediante uso de surfactants não-iônicos em suspensões conidiais; desenvolver meios de cultura para produção rápida e estável por fermentação líquida submersa de células leveduriformes conhecidas por blastosporos. Na primeira etapa, isolados virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea foram selecionados pela rápida e elevada atividade inseticida a ninfas e adultos de mosca-branca, bem como alto rendimento de conídios em arroz parboilizado. A adição de surfactantes organosiliconados permitiu a redução do volume de calda aplicado com resultados aditivos ou sinérgicos de controle. Foi ainda verificado que altos rendimentos de blastosporos tanto de B. bassiana como I. fumosorosea foram obtidos em curto tempo de fermentação líquida (3 dias de précultivo e 2-3 dias de cultivo) usando nutrientes de baixo custo, como glucose e farelo de algodão. Esses blastosporos foram tolerantes à dessecação e mantiveram viabilidade por mais de um ano sob refrigeração (4 °C). Os blastosporos foram mais virulentos que conídios aéreos, o que coloca esta estrutura como a mais indicada como ingrediente ativo em bioinseticidas para moscas-brancas. Mediante manipulação nutricional e física do ambiente de fermentação, a produção de blastosporos de B. bassiana foi optimizada mediante aumento da aeração e pressão osmótica do meio líquido. Blastosporos produzidos em meio líquido altamente aerado e hiperosmótico (140 g glucose L-1) mostraram-se mais virulentos à mosca-branca em relação àqueles produzidos em meio hipo-osmótico (40 g glucose L-1). Esse processo foi reproduzido em escala piloto usando biorreator de 5 L resultando numa produção de 1-2 × 1012 blastosporos viáveis L-1 em apenas 3 dias a um custo de US$ 0,19 L-1. Blastosporos de B. bassiana formulados com terra de diatomáceas e secados em fluxo de ar contínuo, ou secados em spray dryer tiveram estabilidade extendida por até 8 meses a 4 °C e superior em relação a 28 °C. Durante empacotamento, o uso de sachês absorventes de oxigênio e umidade prolongou consideravelmente a viabilidade de blastosporos armazenados a 28 °C por até 7 meses sem afetar sua eficiência contra mosca-branca. Em suma, esses resultados demonstram a viabilidade técnica e econômica de produção de blastosporos virulentos de B. bassiana e I. fumosorosea, tolerantes à dessecação e estáveis durante armazenamento. Esta tecnologia é uma nova opção que pode contribuir para expansão comercial de bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos.

Grapevine anthracnose is an important disease, responsible for severe yield losses in humid regions around the world. This study aimed to: i: identify the causal agents of grapevine anthracnose in Brazil; ii: characterize Elsinoë ampelina isolates from Brazil and Australia by means of phylogenetic analyses, morphological features and pathogenicity tests; iii: develop an efficient method for conidial production of E. ampelina; iv: develop and validate a standard area diagram set (SADs) for assessing anthracnose severity on grapevine leaves; and v: study the temporal and spatial progression of anthracnose in a Brazilian vineyard. To identify the causal agents of the disease, leaves, stems and berries with anthracnose symptoms were collected from 38 vineyards in southern and southeastern Brazil and 39 E. ampelina and 13 Colletotrichum spp. isolates were obtained. For E. ampelina isolates, the internal transcribed spacer (ITS), histone H3 (HIS3) and elongation factor 1-α (TEF) sequences were analysed. HIS3 was the most informative region with 55 polymorphic sites. Seven Colletotrichum species were identified: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum and C. cliviae. In pathogenicity tests, only E. ampelina isolates caused anthracnose symptoms on Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' and Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. To characterize E. ampelina from Brazil and Australia, 35 isolates were analysed. ITS and TEF sequences of all isolates were monomorphic. The haplotype network generated from HIS3 dataset showed four distinct haplotypes. High genetic variability was observed in two Brazilian isolates, haplotype EA4, which may have lost the intron region during species evolution. Colonies showed variable coloration, wrinkled texture, absence of spores and slow growth. Brazilian isolates produced conidia larger than conidia from Australian isolates. To induce the conidial production, mycelial fragments were shake-incubated in rainwater and distilled water for 7 days. Isolates produced different concentrations of conidia and the conidial germination was more than 88.5%. In infectivity tests, conidia caused typical anthracnose symptoms on leaves. The SADs developed comprises six true colour diagrams with severity ranging from 1.1 to 27.4%. The use of the SADs improved the accuracy, precision, agreement and inter-rater reliability of the estimates conducted by 12 raters. The temporal and spatial dynamics of anthracnose was carried out in a \'Niagara Rosada\' vineyard in 2014 and 2015. The incidence of vines with diseased leaves, stems and berries and the severity disease on leaves were recorded. Anthracnose symptoms occurred rapidly after bud break and ontogenic resistance was observed for all organs assessed. The monomolecular model showed the best fit to the incidence progress. Temporal analyses suggest that the progress of anthracnose incidence and severity over time is governed mainly by the primary inoculum due to age-related resistance of the vine organs. Spatial analyses showed a predominantly random spatial pattern of diseased vines. In conclusion, this thesis presents a more in-depth understanding of the aetiology and epidemiology of an important grapevine disease. / Antracnose da videira é uma importante doença, responsável por severas perdas de produtividade em regiões húmidas em diversos locais do planeta. Este estudo objetivou: i: identificar o agente causal da antracnose da videira no Brasil; ii: caracterizar isolados de Elsinoë ampelina do Brasil e Austrália através de análises filogenéticas, morfologia e testes de patogenicidade; iii: desenvolver um método eficiente para produção de conídios de E. ampelina; iv: desenvolver e validar uma escala diagramática para avaliar a severidade de antracnose em folhas; e v: estudar o progresso temporal e espacial da antracnose em um vinhedo brasileiro. Para identificar os agentes causais da doença, folhas, ramos e bagas com sintomas de antracnose foram coletados em 38 vinhedos das regiões sul e sudeste do Brasil e 39 isolados de E. ampelina e 13 isolados de Colletotrichum spp. foram obtidos. Para isolados de E. ampelina, sequências de espaçador interno transcrito (ITS), histona H3 (HIS3) e fator de elongação 1-α (TEF) foram analisadas. HIS3 foi a região mais informativa com 55 sítios polimórficos. Foram identificadas sete espécies de Colletotrichum: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum e C. cliviae. Nos testes de patogenicidade, somente isolados de E. ampelina causaram sintomas de antracnose em Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' e Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. Para a caracterização de E. ampelina do Brasil e Austrália, 35 isolados foram analisados. Sequências de ITS e TEF de todos os isolados foram monomórficas. A rede de haplótipos gerada a partir de sequências de HIS3 resultou na formação de quatro haplótipos. Alta diversidade genética foi observada em dois isolados brasileiros, haplótipo EA4, sugerindo a perda do intron durante a evolução da espécie. Colônias apresentaram coloração variável, textura enrugada, ausência de esporos e lento crescimento. Isolados brasileiros apresentaram conídios maiores que conídios de isolados australianos. Para induzir a esporulação, fragmentos de micélio foram agitados e incubados em água da chuva e água destilada durante 7 dias. Isolados produziram diferentes concentrações de conídios e a germinação foi superior a 88,5%. Nos testes de infectividade, os conídios causaram sintomas de antracnose em folhas. A escala diagramática desenvolvida compreende seis diagramas em cores reais com severidade variando de 1,1 a 27,4%. O uso da escala diagramática melhorou a acurácia, precisão, concordância e reprodutibilidade das estimativas conduzidas por 12 avaliadores. A dinâmica temporal e espacial da antracnose foi conduzida em vinhedo de \'Niagara Rosada\' em 2014 e 2015. A incidência de videiras com folhas, ramos e bagas sintomáticos e a severidade em folhas foram registradas. Os sintomas de antracnose ocorreram rapidamente após a brotação sendo observada resistência ontogênica em todos os órgãos avaliados. O modelo monomolecular mostrou o melhor ajuste para o progresso da incidência. As análises temporais sugerem que o progresso da incidência e severidade durante o tempo é influenciado principalmente pelo inóculo inicial devido à resistência ontogênica dos órgãos. As análises espaciais mostraram um padrão espacial predominantemente aleatório de videiras sintomáticas. Em conclusão, esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da etiologia e epidemiologia de uma importante doença da videira.

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A mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], possui duas formas de infecção, conídios e ascósporos. Informações a respeito da importância dos conídios na epidemiologia da doença são escassas ou controversas. Visando uma maior compreensão sobre o patossistema citros-G. citricarpa (P. citricarpa), os objetivos desta dissertação foram: elaborar e validar uma escala diagramática para avaliação da severidade da mancha preta em folhas de citros; verificar o efeito da temperatura e da duração do período de molhamento na formação de apressórios formados a partir de conídios; observar por meio de microscopia eletrônica de varredura a germinação de conídios e a formação de apressórios sobre folhas destacadas de limão 'Siciliano' submetidas a diferentes temperaturas e períodos de molhamento. A escala diagramática com níveis de severidade de 1; 3; 6; 12; e 24% de área foliar lesionada foi validada por dois grupos de avaliadores, com e sem experiência na quantificação de doenças. Comparada com a avaliação sem escala, o uso da escala proporcionou melhor precisão e acurácia tanto para avaliadores experientes como inexperientes, quando considerada a estimativa média dos mesmos. Na maioria dos casos, os desvios entre estimativas e severidade atual da doença foram mais evidentes para os níveis de severidade entre 5 e 15%. A reprodutibilidade das avaliações resultou em valores de R 2 mais uniformes para a maioria dos avaliadores experientes. Diferenças consideráveis de precisão foram observadas entre avaliadores inexperientes. O efeito da temperatura (10 o C - 40 o C) e da duração do molhamento (4 - 48 h) na formação de apressórios formados a partir de conídios de G. citricarpa (P. citricarpa) foi avaliado sob condições "in vitro" e sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano'. A formação de apressórios ocorreu em todas as temperaturas a partir de 12 horas de molhamento, sendo os extremos de temperatura (10 o C e 40 o C) menos favoráveis à formação de apressórios. A temperatura mínima para formação de apressórios, estimada pela função beta generalizada foi de 3 o C e a máxima de 48,4 o C, ambas para 48 horas de molhamento. A formação de apressórios foi consideravelmente favorecida pela duração do período de molhamento, com o máximo de apressórios formados a 24 horas de molhamento, para a maioria das temperaturas. O período de molhamento constituído de 48 horas foi essencial para que os esporos submetidos a temperaturas de 10 o C e 40 o C, formassem apressórios. A superfície de resposta obtida pela multiplicação das funções beta generalizada e monomolecular apresentou um ajuste satisfatório para os dados observados na estimativa da porcentagem relativa de apressórios formados (R 2 =0,75). As amostras observadas em microscopia eletrônica de varredura possibilitaram a aquisição de imagens de conídios e apressórios sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano' em todas as combinações de temperatura e molhamento avaliadas. / Citrus black spot caused by Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) van der Aa] presents two infection forms, conidia and ascospores. Information regarding the importance of the conidia in the epidemiology of the disease is scarce and controversial. Seeking a better understanding on the pathosystem citrus-G. citricarpa (P. citricarpa), the objectives of this dissertation were: elaborate and validate a diagrammatic scale for assessments of the citrus black spot; verify the effect of the temperature and of the wetness duration in the appressorium formation; observe through scanning electron microscopy the germination and formation of appressorium on outstanding lemon 'Siciliano' leaves submitted to different temperatures and wetness duration. The diagrammatic scale with severity levels of 1; 3; 6; 12; and 24% of diseased leaf area was validated by two groups of raters, with experience and without experience in the quantification of diseases. The scale provided better precision and accuracy for both experienced and inexperienced raters, considering the estimates average of them. In the majority of cases, the bias between estimated and actual disease severity were more evident for disease severity levels between 5 and 15%. The reproducibility of assessments resulted in R 2 with more uniforms values for the majority of the experienced raters, considerable differences of precision were observed among inexperienced raters. The effect of the temperature (10 o C - 40 o C) and of the wetness duration (4 - 48 h) in the germination of conidia and appressoria formation of G. citricarpa (P. citricarpa), was assessed "in vitro" and on the surface of lemon 'Siciliano' leaves. The appressoria formation occurred in all the temperatures starting from 12 hours of wetness. The extreme temperatures (10 o C and 40 o C) were less favorable to the apressorium formation. The minimum temperature for appressorium formation, estimated by generalized beta function was of 3 o C and the maximum of 48,4 o C, both for 48 hours of wetness. The appressorium formation was favored considerably by the wetness duration period, with the maximum of apressoria formed at 24 hours of wetness, for majority of the temperatures. The wetness duration period constituted of 48 hours was essential so that the spores submitted to temperatures of 10 o C and 40 o C, formed appressorium. The response surface obtained by the multiplication of the generalized beta and monomolecular functions provided a close fit to observed data in the estimate of the relative percentage of formed appressorium (R 2 =0,75). The samples observed in scanning electron microscopy made possible the acquisition of images of conidia and appressoria on the surface of lemon 'Siciliano' leaves in all the temperature combinations and wetness evaluated.

A mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], possui duas formas de infecção, conídios e ascósporos. Informações a respeito da importância dos conídios na epidemiologia da doença são escassas ou controversas. Visando uma maior compreensão sobre o patossistema citros-G. citricarpa (P. citricarpa), os objetivos desta dissertação foram: elaborar e validar uma escala diagramática para avaliação da severidade da mancha preta em folhas de citros; verificar o efeito da temperatura e da duração do período de molhamento na formação de apressórios formados a partir de conídios; observar por meio de microscopia eletrônica de varredura a germinação de conídios e a formação de apressórios sobre folhas destacadas de limão 'Siciliano' submetidas a diferentes temperaturas e períodos de molhamento. A escala diagramática com níveis de severidade de 1; 3; 6; 12; e 24% de área foliar lesionada foi validada por dois grupos de avaliadores, com e sem experiência na quantificação de doenças. Comparada com a avaliação sem escala, o uso da escala proporcionou melhor precisão e acurácia tanto para avaliadores experientes como inexperientes, quando considerada a estimativa média dos mesmos. Na maioria dos casos, os desvios entre estimativas e severidade atual da doença foram mais evidentes para os níveis de severidade entre 5 e 15%. A reprodutibilidade das avaliações resultou em valores de R 2 mais uniformes para a maioria dos avaliadores experientes. Diferenças consideráveis de precisão foram observadas entre avaliadores inexperientes. O efeito da temperatura (10 o C – 40 o C) e da duração do molhamento (4 – 48 h) na formação de apressórios formados a partir de conídios de G. citricarpa (P. citricarpa) foi avaliado sob condições "in vitro" e sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano'. A formação de apressórios ocorreu em todas as temperaturas a partir de 12 horas de molhamento, sendo os extremos de temperatura (10 o C e 40 o C) menos favoráveis à formação de apressórios. A temperatura mínima para formação de apressórios, estimada pela função beta generalizada foi de 3 o C e a máxima de 48,4 o C, ambas para 48 horas de molhamento. A formação de apressórios foi consideravelmente favorecida pela duração do período de molhamento, com o máximo de apressórios formados a 24 horas de molhamento, para a maioria das temperaturas. O período de molhamento constituído de 48 horas foi essencial para que os esporos submetidos a temperaturas de 10 o C e 40 o C, formassem apressórios. A superfície de resposta obtida pela multiplicação das funções beta generalizada e monomolecular apresentou um ajuste satisfatório para os dados observados na estimativa da porcentagem relativa de apressórios formados (R 2 =0,75). As amostras observadas em microscopia eletrônica de varredura possibilitaram a aquisição de imagens de conídios e apressórios sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano' em todas as combinações de temperatura e molhamento avaliadas. / Citrus black spot caused by Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) van der Aa] presents two infection forms, conidia and ascospores. Information regarding the importance of the conidia in the epidemiology of the disease is scarce and controversial. Seeking a better understanding on the pathosystem citrus-G. citricarpa (P. citricarpa), the objectives of this dissertation were: elaborate and validate a diagrammatic scale for assessments of the citrus black spot; verify the effect of the temperature and of the wetness duration in the appressorium formation; observe through scanning electron microscopy the germination and formation of appressorium on outstanding lemon 'Siciliano' leaves submitted to different temperatures and wetness duration. The diagrammatic scale with severity levels of 1; 3; 6; 12; and 24% of diseased leaf area was validated by two groups of raters, with experience and without experience in the quantification of diseases. The scale provided better precision and accuracy for both experienced and inexperienced raters, considering the estimates average of them. In the majority of cases, the bias between estimated and actual disease severity were more evident for disease severity levels between 5 and 15%. The reproducibility of assessments resulted in R 2 with more uniforms values for the majority of the experienced raters, considerable differences of precision were observed among inexperienced raters. The effect of the temperature (10 o C - 40 o C) and of the wetness duration (4 – 48 h) in the germination of conidia and appressoria formation of G. citricarpa (P. citricarpa), was assessed "in vitro" and on the surface of lemon 'Siciliano' leaves. The appressoria formation occurred in all the temperatures starting from 12 hours of wetness. The extreme temperatures (10 o C and 40 o C) were less favorable to the apressorium formation. The minimum temperature for appressorium formation, estimated by generalized beta function was of 3 o C and the maximum of 48,4 o C, both for 48 hours of wetness. The appressorium formation was favored considerably by the wetness duration period, with the maximum of apressoria formed at 24 hours of wetness, for majority of the temperatures. The wetness duration period constituted of 48 hours was essential so that the spores submitted to temperatures of 10 o C and 40 o C, formed appressorium. The response surface obtained by the multiplication of the generalized beta and monomolecular functions provided a close fit to observed data in the estimate of the relative percentage of formed appressorium (R 2 =0,75). The samples observed in scanning electron microscopy made possible the acquisition of images of conidia and appressoria on the surface of lemon 'Siciliano' leaves in all the temperature combinations and wetness evaluated.

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L’ascomicete Guignardia bidwellii, agente causale del marciume nero della vite, è un patogeno economicamente importante in alcuni areali viticoli. La conoscenza, disponibile sul marciume nero dell’uva, è stata recuperata dalla letteratura, analizzata e sintetizzata per sviluppare un modello meccanicistico del ciclo di vita del patogeno, guidata dalle variabili meteorologiche e dalla fenologia della vite, e basata sull'analisi dei sistemi. Il modello è stato poi valutato per la sua capacità di rappresentare il sistema reale e la sua utilità per la comprensione di epidemie di marciume nero su foglie e grappoli in un vigneto del Nord Italia, nel 2013 al 2015. Successivamente, le mancanze di conoscenza sono state analizzate, studiate e quindi colmate attraverso specifici esperimenti. In un primo passo, le dinamiche dell’inoculo primario e dei modelli di dispersione (di entrambi ascospore e conidi) da mummie svernate sono state studiate in un vigneto sperimentale per tre anni. In un secondo passo, l'effetto della temperatura e dell'umidità sulla formazione di picnidi di G. bidwellii e la successiva estrusione di cirri, nelle lesioni su foglia, la produzione e la germinazione dei conidi (inoculo secondario), e la lunghezza del periodo di latenza sono stati studiati sia in condizioni di campo che in ambiente controllato. In un terzo passo, sono stati condotti studi in ambiente controllato per studiare la produzione di conidi di G. bidwellii sulle lesioni di foglie, influenzata da lavaggi ripetuti e alternando periodi di secco ed umido. Il modello epidemiologico sviluppato in questa tesi può essere utilizzata da viticoltori come strumento predittivo per la pianificazione di trattamenti fungicidi nei vigneti. / The ascomycete Guignardia bidwellii, causal agent of black-rot on grapevines, is an economically important pathogen in some viticultural areas. The available knowledge on black-rot of grape was retrieved from literature, analyzed, and synthesized to develop a mechanistic model of the life cycle of the pathogen, driven by weather and vine phenology, and based on the systems analysis. The model was then evaluated for its ability to represent the real system and its usefulness for understanding black-rot epidemics on leaves and bunches in a vineyard of north Italy, in 2013 to 2015. Thereafter, weaknesses in our knowledge were analysed and studied through specific experiments. In a first step, dynamics of primary inoculum and dispersal patterns (both ascospores and conidia) from overwintered grape mummies were investigated in an experimental vineyard during three years. In a second step, the effect of temperature and humidity on the formation of G. bidwellii pycnidia and the extrusion of cirri in grape leaf lesions, production and germination of conidia (secondary inoculum), and the length of the latency period were studied under both environmental and controlled conditions. In a third step, environmental-controlled studies were conducted to investigate the production course of G. bidwellii conidia on grape leaf lesions as influenced by repeated washing events and alternate dry and wet periods. The model developed in this thesis can be used by vinegrowers as a predictive tool for scheduling fungicide sprays in the vineyards.