Made available in DSpace on 2016-12-23T14:37:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leandro Pin Dalvi.pdf: 1271308 bytes, checksum: 029f08fb27575fe178e1d7fbfa5e6720 (MD5) Previous issue date: 2008-02-23 / A cafeicultura é a maior geradora de empregos e renda para as famílias do Espírito Santo. Dentre os problemas que esta atividade enfrenta, destaca-se a broca-do-café Hypothenemus hampei, uma praga que causa prejuízos em todos os estágios de maturação dos frutos, assim como no pós-colheita. O objetivo do presente trabalho foi coletar, caracterizar molecularmente e selecionar isolados do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana com potencial para utilização em programas de manejo fitossanitário da broca-do-café. O trabalho foi realizado no Setor de Entomologia e Fitopatologia NUDEMAFI, localizado no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES), e nos laboratórios de Entomologia e Biotecnologia da Embrapa-Soja localizados em Londrina, Paraná. As coletas resultaram em 28 isolados classificados como B. bassiana, tendo sido um dos isolados descartado dos testes por apresentar baixo crescimento. As amplificações utilizando 12 primers (iniciadores) deram origem a 82 bandas. O coeficiente de similaridade Dice variou de 93 a 51%. Foi evidente, salvo algumas exceções, que o local de coleta foi peça chave na formação de grupos muito relacionados. Ocorreu grande amplitude na virulência. Foram pré-selecionados os isolados CCA-UFES/Bb4, CCA-UFES/Bb11, CCA-UFES/Bb15, CCA-UFES/Bb18 que produziram mortalidade confirmada acima de 60%. Posteriormente, o isolado CCA-UFES/Bb15 apresentou melhor resposta, diferenciando-se do isolado utilizados como padrão - ESALQ-447 - cujos CL50 foram de 4,0 x 104 e 11,85 x 104 conídios/mL, respectivamente. Para todos os isolados selecionados, assim como para o padrão, o aumento na concentração representou aumento na mortalidade. A conidiogênese sobre os cadáveres da broca-do-café foi inversamente proporcional à virulência dos isolados, sendo ambas as características importantes para o sucesso de um programa de Manejo Integrado de Pragas (MIP). Os resultados obtidos são promissores, dando subsídio a novas pesquisas preferencialmente a campo / The coffee plantation is the largest source of jobs and familiar income of the State of Espírito Santo (Brazil). The coffee berry borer, Hypothenemus hampei, is widely considered one of the most important coffee pests because the losses in all stages of coffee grain as well as in post-harvest in this activity. The objective of this study was the collect, molecular characterization and the select of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strains, with potential use in integrated pest management in coffe plantations. The work was carried out at NUDEMAFI, located in the Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, in municipality of Alegre, Brazil and the Biotechnology and Biological laboratories in the Embrapa Soja, in municipality of Londrina, State of Paraná, Brazil. A collection of 28 B. bassiana strains,isolated from different geographic regions were established. Only one Bassiana bassiana strain was discarded for low growth in laboratory. The amplifications using 12 "primers" (initiators) led to 82 bands. Dices coefficient ranged from 51 to. 93% with few exceptions Groups of B. bassiana strains related were forming due to the place colleted and high levels of virulence was observed. The Beauveria bassiana strains CCA-UFES/Bb4, CCA-UFES/Bb11, CCA-UFES/Bb15, CCA-UFES/Bb18 were pre-selected which showed confirmed mortality higher than 60Only The LC50, of the CCA-UFES/Bb15 strains was better response with significant difference between the standard, with 4.0 x 104 in 11.85 x 104 conidia / ml, respectively,. All isolates selected, as well as for the standard, the increase in the concentration resulted an increase of mortality of H. hampei. The conidiogenesis on coffee berry borers cadavers was inversely proportional to the virulence of the B. bassiana strains, and both this characteristics are important to the success of a program of Integrated Pest Management (IPM)

Conídios são estruturas especializadas, produzidas assexuadamente pelo micélio de muitas espécies de ascomicetos. A produção dos conídios requer o controle espacial e temporal da expressão gênica e a formação de estruturas específicas durante o desenvolvimento. Os conídios estão envolvidos na reprodução, dispersão e persistência ambiental dos fungos. Em espécies patogênicas como Aspergillus fumigatus e Metarhizium anisopliae, os conídios também são responsáveis pela infecção do hospedeiro. Um dos principais fatores ambientais capazes de matar e / ou danificar os conídios é a radiação solar. Os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) são os principais fotoprodutos do DNA induzidos pela radiação UVB. Os principais objetivos deste trabalho foram: (1) estimar as frequências de CPDs em conídios expostos a doses subletais de radiação UVB, (2) correlacionar a frequência de CPDs com a cinética de germinação dos conídios, (3) comparar a frequência de CPDs em conídios selvagens com a frequência em conídios mutantes para a pigmentação, (4) identificar genes diferencialmente expressos durante as fases da conidiogênese de A. fumigatus e (5) identificar genes modulados pela radiação UVB em micélio jovem de A. fumigatus. Conídios de M. anisopliae, A. nidulans e A. fumigatus foram expostos à irradiância de 1000 mW m-2 de UVB por 15, 30, 60 e 90 min. As doses totais ao final das exposições foram 0,9, 1,8, 3,6 e 5,4 kJ m-2. O aumento na frequência de CPDs foi linear e diretamente proporcional à dose, com 0,215, 0,455, 0,803 e 1,628 CPDs 10 kb-1 induzidos pelas doses de 0,9, 1,8, 3,6 e 5,4 kJ m-2 em A. fumigatus, 0,037, 0,077, 0,142 e 0,202 CPDs 10 kb-1 em A. nidulans e 0,041, 0,085, 0,155 e 0,255 CPDs 10 kb-1 em M. anisopliae. A frequência de CPDs no mutante albino de M. anisopliae (0,552 10 kb-1) foi aproximadamente dez vezes maior do que na linhagem selvagem (0.057 10 kb-1) após exposição à dose de 1,8 kJ m-2. Esta é a primeira evidência direta de que a pigmentação dos conídios protege o DNA contra os danos induzidos pela radiação UVB. Microarranjos genômicos de DNA foram utilizados para comparar os transcriptomas de micélios com 20 h (início da conidiogênese), 24 h (fase intermediária) e 25 h (fase final) com o transcriptoma de micélio jovem. Foram identificados 34 genes diferencialmente expressos (7 com aumento e 27 com diminuição) com 20 h de desenvolvimento, 101 genes (12 com aumento e 89 com diminuição) com 24 h e 76 genes (oito com aumento e 68 com diminuição) com 25 h. Alguns genes que apresentaram aumento na expressão (stuA e o gene da scytalone dehydratase) já haviam sido associados com fases específicas da conidiogênese, entretanto a maioria dos genes que apresentou aumento na expressão não tem função conhecida. A análise de transcriptomas com microarranjos de DNA também foi utilizada para identificar genes com expressão modulada por exposições à radiação UVB (1,8 kJ m-2) em micélio jovem de A. fumigatus. Foram identificados 101 genes diferencialmente expressos ao final da exposição à radiação UVB (51 genes com aumento e 50 com redução). O gene radc apresentou o maior aumento na expressão (aproximadamente 16 ×). A maioria dos genes com aumento na expressão não possui função conhecida. Foram identificados 418 genes diferencialmente expressos 30 min após o termino da exposição (51 genes com aumento e 367 com redução na expressão). / Conidia are specialized structures produced asexually during mycelia growth of many ascomycete species. The process of conidiation involves temporal and spatial regulation of gene expression, cell specialization, intercellular communication, and formation of specific structures during fungal growth. Conidia are responsible for the reproduction, dispersal and environmental persistence of many fungal species. In pathogenic species like Aspergillus fumigatus and Metarhizium anisopliae, conidia are also responsible for host infection. One of the main environmental factors that can kill and/or damage conidia is solar UV radiation. Cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) are the major DNA photoproducts induced by UVB. The principal goals of the present study were to: (1) estimate the frequency of CPDs induced by sublethal doses of UVB radiation in conidial DNA of three selected ascomycetes, (2) examine correlation of CPD frequencies with germination speed, and (3) estimate the protective effect of the wild-type green conidial pigmentation on DNA in M. anisopliae var. anisopliae, (4) identify differentially expressed genes during the different phases of A. fumigatus conidiogenesis and (5) identify genes regulated by UVB radiation in A. fumigatus young mycelia. A. fumigatus, A. nidulans, and M. anisopliae conidia were exposed to 1000 mW m-2 UV irradiance for 15, 30, 60 and 90 min. Total Quaite-weighted doses were 0.9, 1.8, 3.6 and 5.4 kJ m-2, respectively. The frequencies of dimers were linear and directly proportional to the doses, with 0.215, 0.455, 0.803 and 1.628 CPDs 10 kb-1 detected at the doses of 0.9, 1.8, 3.6 and 5.4 kJ m-2 in A. fumigatus, 0.037, 0.077, 0.142 and 0.202 CPDs 10 kb-1 in A. nidulans, and 0.041, 0.085, 0.155 and 0.255 CPDs 10 kb-1 in M. anisopliae. The frequency of dimers in the M. anisopliae albino mutant DWR 180 (0.552 10 kb-1) was approximately ten times higher than of the wild-type ARSEF 23 strain (0.057 10 kb-1) after exposure to doses of 1.8 kJ m-2. DNA microarrays carrying sequence of 11,000 genes of A. fumigatus were used to compare transcriptomes of 20 h-old mycelia (initial phase of the conidiogenesis), 24 h (intermediate phase) e 25 h (final phase) with young mycelia transcriptome. Thirty-four genes displayed a statistically significant difference in expression (7 with increase and 27 with decrease mRNA expression) in 20 h-old mycelia, 101 genes (12 with increase and 89 with decrease) in 24 h-old mycelia and 76 genes (8 with increase and 68 with decrease) in 25 h-old mycelia. Some overexpressed genes (stuA ad the scytalone dehydratase gene) were previously related to specific phases of conidiogenesis but the function of most of them is unknown. Transcriptome analysis using microarrays was also used to identify genes modulated by exposures to UVB radiation (1,8 kJ m-2) in A. fumigatus young mycelia. One hundred and one differentially expressed genes were identified at the end of the exposure to UVB radiation (51 genes with increase and 50 with decrease). The radc gene displayed the higher increase in expression (approximately 16 ×). The function of most of the overexpressed genes is unknown. Four hundred and eighteen differentially expressed genes were identified 30 min after the end of exposure (51 genes with increase and 367 with decrease in expression).

Conídios são estruturas especializadas, produzidas assexuadamente pelo micélio de muitas espécies de ascomicetos. A produção dos conídios requer o controle espacial e temporal da expressão gênica e a formação de estruturas específicas durante o desenvolvimento. Os conídios estão envolvidos na reprodução, dispersão e persistência ambiental dos fungos. Em espécies patogênicas como Aspergillus fumigatus e Metarhizium anisopliae, os conídios também são responsáveis pela infecção do hospedeiro. Um dos principais fatores ambientais capazes de matar e / ou danificar os conídios é a radiação solar. Os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) são os principais fotoprodutos do DNA induzidos pela radiação UVB. Os principais objetivos deste trabalho foram: (1) estimar as frequências de CPDs em conídios expostos a doses subletais de radiação UVB, (2) correlacionar a frequência de CPDs com a cinética de germinação dos conídios, (3) comparar a frequência de CPDs em conídios selvagens com a frequência em conídios mutantes para a pigmentação, (4) identificar genes diferencialmente expressos durante as fases da conidiogênese de A. fumigatus e (5) identificar genes modulados pela radiação UVB em micélio jovem de A. fumigatus. Conídios de M. anisopliae, A. nidulans e A. fumigatus foram expostos à irradiância de 1000 mW m-2 de UVB por 15, 30, 60 e 90 min. As doses totais ao final das exposições foram 0,9, 1,8, 3,6 e 5,4 kJ m-2. O aumento na frequência de CPDs foi linear e diretamente proporcional à dose, com 0,215, 0,455, 0,803 e 1,628 CPDs 10 kb-1 induzidos pelas doses de 0,9, 1,8, 3,6 e 5,4 kJ m-2 em A. fumigatus, 0,037, 0,077, 0,142 e 0,202 CPDs 10 kb-1 em A. nidulans e 0,041, 0,085, 0,155 e 0,255 CPDs 10 kb-1 em M. anisopliae. A frequência de CPDs no mutante albino de M. anisopliae (0,552 10 kb-1) foi aproximadamente dez vezes maior do que na linhagem selvagem (0.057 10 kb-1) após exposição à dose de 1,8 kJ m-2. Esta é a primeira evidência direta de que a pigmentação dos conídios protege o DNA contra os danos induzidos pela radiação UVB. Microarranjos genômicos de DNA foram utilizados para comparar os transcriptomas de micélios com 20 h (início da conidiogênese), 24 h (fase intermediária) e 25 h (fase final) com o transcriptoma de micélio jovem. Foram identificados 34 genes diferencialmente expressos (7 com aumento e 27 com diminuição) com 20 h de desenvolvimento, 101 genes (12 com aumento e 89 com diminuição) com 24 h e 76 genes (oito com aumento e 68 com diminuição) com 25 h. Alguns genes que apresentaram aumento na expressão (stuA e o gene da scytalone dehydratase) já haviam sido associados com fases específicas da conidiogênese, entretanto a maioria dos genes que apresentou aumento na expressão não tem função conhecida. A análise de transcriptomas com microarranjos de DNA também foi utilizada para identificar genes com expressão modulada por exposições à radiação UVB (1,8 kJ m-2) em micélio jovem de A. fumigatus. Foram identificados 101 genes diferencialmente expressos ao final da exposição à radiação UVB (51 genes com aumento e 50 com redução). O gene radc apresentou o maior aumento na expressão (aproximadamente 16 ×). A maioria dos genes com aumento na expressão não possui função conhecida. Foram identificados 418 genes diferencialmente expressos 30 min após o termino da exposição (51 genes com aumento e 367 com redução na expressão). / Conidia are specialized structures produced asexually during mycelia growth of many ascomycete species. The process of conidiation involves temporal and spatial regulation of gene expression, cell specialization, intercellular communication, and formation of specific structures during fungal growth. Conidia are responsible for the reproduction, dispersal and environmental persistence of many fungal species. In pathogenic species like Aspergillus fumigatus and Metarhizium anisopliae, conidia are also responsible for host infection. One of the main environmental factors that can kill and/or damage conidia is solar UV radiation. Cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) are the major DNA photoproducts induced by UVB. The principal goals of the present study were to: (1) estimate the frequency of CPDs induced by sublethal doses of UVB radiation in conidial DNA of three selected ascomycetes, (2) examine correlation of CPD frequencies with germination speed, and (3) estimate the protective effect of the wild-type green conidial pigmentation on DNA in M. anisopliae var. anisopliae, (4) identify differentially expressed genes during the different phases of A. fumigatus conidiogenesis and (5) identify genes regulated by UVB radiation in A. fumigatus young mycelia. A. fumigatus, A. nidulans, and M. anisopliae conidia were exposed to 1000 mW m-2 UV irradiance for 15, 30, 60 and 90 min. Total Quaite-weighted doses were 0.9, 1.8, 3.6 and 5.4 kJ m-2, respectively. The frequencies of dimers were linear and directly proportional to the doses, with 0.215, 0.455, 0.803 and 1.628 CPDs 10 kb-1 detected at the doses of 0.9, 1.8, 3.6 and 5.4 kJ m-2 in A. fumigatus, 0.037, 0.077, 0.142 and 0.202 CPDs 10 kb-1 in A. nidulans, and 0.041, 0.085, 0.155 and 0.255 CPDs 10 kb-1 in M. anisopliae. The frequency of dimers in the M. anisopliae albino mutant DWR 180 (0.552 10 kb-1) was approximately ten times higher than of the wild-type ARSEF 23 strain (0.057 10 kb-1) after exposure to doses of 1.8 kJ m-2. DNA microarrays carrying sequence of 11,000 genes of A. fumigatus were used to compare transcriptomes of 20 h-old mycelia (initial phase of the conidiogenesis), 24 h (intermediate phase) e 25 h (final phase) with young mycelia transcriptome. Thirty-four genes displayed a statistically significant difference in expression (7 with increase and 27 with decrease mRNA expression) in 20 h-old mycelia, 101 genes (12 with increase and 89 with decrease) in 24 h-old mycelia and 76 genes (8 with increase and 68 with decrease) in 25 h-old mycelia. Some overexpressed genes (stuA ad the scytalone dehydratase gene) were previously related to specific phases of conidiogenesis but the function of most of them is unknown. Transcriptome analysis using microarrays was also used to identify genes modulated by exposures to UVB radiation (1,8 kJ m-2) in A. fumigatus young mycelia. One hundred and one differentially expressed genes were identified at the end of the exposure to UVB radiation (51 genes with increase and 50 with decrease). The radc gene displayed the higher increase in expression (approximately 16 ×). The function of most of the overexpressed genes is unknown. Four hundred and eighteen differentially expressed genes were identified 30 min after the end of exposure (51 genes with increase and 367 with decrease in expression).