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Estudo do desenvolvimento in vitro de Mesocestoides corti (Platyhelminthes : Cestoda) : 1. análise do efeito de drogas anti-helmínticas; 2. estabelecimento de linhagens celulares

Markoski, Melissa Medeiros January 2006 (has links)
Mesocestoides corti é um platelminto endoparasita pertencente à classe Cestoda. Devido a sua capacidade de reprodução assexual in vivo, em hospedeiros experimentais, e in vitro, em condições apropriadas de cultura, é considerado um bom modelo para diversos estudos sobre a biologia de cestódeos. O desenvolvimento da fase larval na forma adulta de M. corti foi previamente padronizado in vitro pelo nosso grupo. Assim, este trabalho tem como objetivos principais o estudo, em nível morfológico, das modificações teciduais, que ocorrem durante o desenvolvimento de tetratirídeo a adulto in vitro, e a análise do efeito da exposição destes tecidos e fases a drogas anti-helmínticas de amplo espectro. Visando, futuramente, estudar o efeito de drogas antihelmínticas sobre morfologia e mecanismos celulares, o trabalho também aborda o estabelecimento de culturas celulares primárias a partir de diferentes fases do desenvolvimento in vitro de M. corti. Foi verificado por microscopia confocal que, durante o processo de estrobilização (desenvolvimento da larva na fase adulta) in vitro, houve grande rearranjo da arquitetura corporal principalmente no tegumento, sistema muscular e formação dos órgãos sexuais. Estes tecidos são severamente atingidos pela ação de praziquantel e albendazol. Foi observado que vermes estrobilados foram os mais afetados por ação das drogas. Culturas celulares foram estabelecidas a partir da fase adulta e larval do parasito, cujas células dispõem-se em diferentes subpopulações com tamanhos variando de 2 a 7m, proliferativas e metabolicamente ativas sintetizando matriz extracelular. Parte da matriz extracelular sintetizada foi caracterizada onde foi constatada a presença de carboidratos neutros e carregados, GAGs e proteínas. Este trabalho contribuiu para um melhor entendimento da dinâmica das alterações morfológicas de M. corti, modelo para platelmintos parasitos, e abre a possibilidade de estudos mais detalhados da arquitetura corporal frente à exposição a drogas anti-helmínticas e estudos focalizados, do efeito destas drogas em nível celular, através do estabelecimento das culturas celulares. / Mesocestoides corti is an endoparasitic flatworm belonging to the Cestoda class. Due to the in vivo asexual reproduction capability, in experimental hosts, and in vitro, in appropriated culture conditions, M. corti is considered a good model to many studies of the cestode biology. The M. corti in vitro development of larva in adult worm was standardized by our group. Thus, this work has as main objectives the morphologic study of the tissue changes that occur during the tetrathyridium to adult in vitro development and the exposition of these tissues and life phases to broad-spectrum antihelminthic drugs. With the future aim of study antihelminthic drug effect on cell morphology and physiology, the work also shows the establishment of primary cultures of cells from different in vitro developmental stages of M. corti. Using laser-scanning confocal microscopy, we demonstrated that there were body architecture rearrangements during the in vitro development occurring strongly in tegument, muscle system and sexual organs. These tissues are severely damaged by antihelminthic drugs as praziquantel and albendazole. During development, the adult stage is the most damaged by the drug action. Cell cultures were established from the parasite adult and larval phases, which were distributed in different subpopulations having diameters varying between 2 and 7m. Cultured cells are proliferative and metabolic actives, with synthesis of extracellular matrix. The extracellular matrix composition was preliminarily determined and it was shown that neutral and charged carbohydrates, GAGs and proteins were present. Thus, this work contributed to a better comprehension about the morphological rearrangement dynamics of M. corti, a flatworm model, and makes possible a more detailed study of the body architecture on antihelminthic drug exposition. As well as, this work will allow focused studies of the drug effect at cellular level favoured by cell culture establishment from a parasite.
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Estudo do desenvolvimento in vitro de Mesocestoides corti (Platyhelminthes : Cestoda) : 1. análise do efeito de drogas anti-helmínticas; 2. estabelecimento de linhagens celulares

Markoski, Melissa Medeiros January 2006 (has links)
Mesocestoides corti é um platelminto endoparasita pertencente à classe Cestoda. Devido a sua capacidade de reprodução assexual in vivo, em hospedeiros experimentais, e in vitro, em condições apropriadas de cultura, é considerado um bom modelo para diversos estudos sobre a biologia de cestódeos. O desenvolvimento da fase larval na forma adulta de M. corti foi previamente padronizado in vitro pelo nosso grupo. Assim, este trabalho tem como objetivos principais o estudo, em nível morfológico, das modificações teciduais, que ocorrem durante o desenvolvimento de tetratirídeo a adulto in vitro, e a análise do efeito da exposição destes tecidos e fases a drogas anti-helmínticas de amplo espectro. Visando, futuramente, estudar o efeito de drogas antihelmínticas sobre morfologia e mecanismos celulares, o trabalho também aborda o estabelecimento de culturas celulares primárias a partir de diferentes fases do desenvolvimento in vitro de M. corti. Foi verificado por microscopia confocal que, durante o processo de estrobilização (desenvolvimento da larva na fase adulta) in vitro, houve grande rearranjo da arquitetura corporal principalmente no tegumento, sistema muscular e formação dos órgãos sexuais. Estes tecidos são severamente atingidos pela ação de praziquantel e albendazol. Foi observado que vermes estrobilados foram os mais afetados por ação das drogas. Culturas celulares foram estabelecidas a partir da fase adulta e larval do parasito, cujas células dispõem-se em diferentes subpopulações com tamanhos variando de 2 a 7m, proliferativas e metabolicamente ativas sintetizando matriz extracelular. Parte da matriz extracelular sintetizada foi caracterizada onde foi constatada a presença de carboidratos neutros e carregados, GAGs e proteínas. Este trabalho contribuiu para um melhor entendimento da dinâmica das alterações morfológicas de M. corti, modelo para platelmintos parasitos, e abre a possibilidade de estudos mais detalhados da arquitetura corporal frente à exposição a drogas anti-helmínticas e estudos focalizados, do efeito destas drogas em nível celular, através do estabelecimento das culturas celulares. / Mesocestoides corti is an endoparasitic flatworm belonging to the Cestoda class. Due to the in vivo asexual reproduction capability, in experimental hosts, and in vitro, in appropriated culture conditions, M. corti is considered a good model to many studies of the cestode biology. The M. corti in vitro development of larva in adult worm was standardized by our group. Thus, this work has as main objectives the morphologic study of the tissue changes that occur during the tetrathyridium to adult in vitro development and the exposition of these tissues and life phases to broad-spectrum antihelminthic drugs. With the future aim of study antihelminthic drug effect on cell morphology and physiology, the work also shows the establishment of primary cultures of cells from different in vitro developmental stages of M. corti. Using laser-scanning confocal microscopy, we demonstrated that there were body architecture rearrangements during the in vitro development occurring strongly in tegument, muscle system and sexual organs. These tissues are severely damaged by antihelminthic drugs as praziquantel and albendazole. During development, the adult stage is the most damaged by the drug action. Cell cultures were established from the parasite adult and larval phases, which were distributed in different subpopulations having diameters varying between 2 and 7m. Cultured cells are proliferative and metabolic actives, with synthesis of extracellular matrix. The extracellular matrix composition was preliminarily determined and it was shown that neutral and charged carbohydrates, GAGs and proteins were present. Thus, this work contributed to a better comprehension about the morphological rearrangement dynamics of M. corti, a flatworm model, and makes possible a more detailed study of the body architecture on antihelminthic drug exposition. As well as, this work will allow focused studies of the drug effect at cellular level favoured by cell culture establishment from a parasite.
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Estudo do desenvolvimento in vitro de Mesocestoides corti (Platyhelminthes : Cestoda) : 1. análise do efeito de drogas anti-helmínticas; 2. estabelecimento de linhagens celulares

Markoski, Melissa Medeiros January 2006 (has links)
Mesocestoides corti é um platelminto endoparasita pertencente à classe Cestoda. Devido a sua capacidade de reprodução assexual in vivo, em hospedeiros experimentais, e in vitro, em condições apropriadas de cultura, é considerado um bom modelo para diversos estudos sobre a biologia de cestódeos. O desenvolvimento da fase larval na forma adulta de M. corti foi previamente padronizado in vitro pelo nosso grupo. Assim, este trabalho tem como objetivos principais o estudo, em nível morfológico, das modificações teciduais, que ocorrem durante o desenvolvimento de tetratirídeo a adulto in vitro, e a análise do efeito da exposição destes tecidos e fases a drogas anti-helmínticas de amplo espectro. Visando, futuramente, estudar o efeito de drogas antihelmínticas sobre morfologia e mecanismos celulares, o trabalho também aborda o estabelecimento de culturas celulares primárias a partir de diferentes fases do desenvolvimento in vitro de M. corti. Foi verificado por microscopia confocal que, durante o processo de estrobilização (desenvolvimento da larva na fase adulta) in vitro, houve grande rearranjo da arquitetura corporal principalmente no tegumento, sistema muscular e formação dos órgãos sexuais. Estes tecidos são severamente atingidos pela ação de praziquantel e albendazol. Foi observado que vermes estrobilados foram os mais afetados por ação das drogas. Culturas celulares foram estabelecidas a partir da fase adulta e larval do parasito, cujas células dispõem-se em diferentes subpopulações com tamanhos variando de 2 a 7m, proliferativas e metabolicamente ativas sintetizando matriz extracelular. Parte da matriz extracelular sintetizada foi caracterizada onde foi constatada a presença de carboidratos neutros e carregados, GAGs e proteínas. Este trabalho contribuiu para um melhor entendimento da dinâmica das alterações morfológicas de M. corti, modelo para platelmintos parasitos, e abre a possibilidade de estudos mais detalhados da arquitetura corporal frente à exposição a drogas anti-helmínticas e estudos focalizados, do efeito destas drogas em nível celular, através do estabelecimento das culturas celulares. / Mesocestoides corti is an endoparasitic flatworm belonging to the Cestoda class. Due to the in vivo asexual reproduction capability, in experimental hosts, and in vitro, in appropriated culture conditions, M. corti is considered a good model to many studies of the cestode biology. The M. corti in vitro development of larva in adult worm was standardized by our group. Thus, this work has as main objectives the morphologic study of the tissue changes that occur during the tetrathyridium to adult in vitro development and the exposition of these tissues and life phases to broad-spectrum antihelminthic drugs. With the future aim of study antihelminthic drug effect on cell morphology and physiology, the work also shows the establishment of primary cultures of cells from different in vitro developmental stages of M. corti. Using laser-scanning confocal microscopy, we demonstrated that there were body architecture rearrangements during the in vitro development occurring strongly in tegument, muscle system and sexual organs. These tissues are severely damaged by antihelminthic drugs as praziquantel and albendazole. During development, the adult stage is the most damaged by the drug action. Cell cultures were established from the parasite adult and larval phases, which were distributed in different subpopulations having diameters varying between 2 and 7m. Cultured cells are proliferative and metabolic actives, with synthesis of extracellular matrix. The extracellular matrix composition was preliminarily determined and it was shown that neutral and charged carbohydrates, GAGs and proteins were present. Thus, this work contributed to a better comprehension about the morphological rearrangement dynamics of M. corti, a flatworm model, and makes possible a more detailed study of the body architecture on antihelminthic drug exposition. As well as, this work will allow focused studies of the drug effect at cellular level favoured by cell culture establishment from a parasite.
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Estudo da expressão das proteínas cromodomínio-helicase e SET/TAF-Iβ durante o processo de estrobilização de Mesocestoides corti

Costa, Caroline Borges January 2013 (has links)
A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.
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Estudo da expressão das proteínas cromodomínio-helicase e SET/TAF-Iβ durante o processo de estrobilização de Mesocestoides corti

Costa, Caroline Borges January 2013 (has links)
A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.
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Estudo da expressão das proteínas cromodomínio-helicase e SET/TAF-Iβ durante o processo de estrobilização de Mesocestoides corti

Costa, Caroline Borges January 2013 (has links)
A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.
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Different effects of conditional Knock-Out of Stat3 on the sensory epithelium of the Organ of Corti / Unterschiedliche Auswirkungen des konditionellen Knock-Outs von Stat3 im sensorischen Epithel des Cortischen Organs

Bieniussa, Linda Ilse January 2024 (has links) (PDF)
Die Cochlea von Säugetieren nimmt Schall als Reaktion auf Vibrationen an frequenzabhängigen Positionen entlang des Cochlea-Kanals wahr. Die sensorischen äußeren Haarzellen, die von Stützzellen umgeben sind, wirken als Signalverstärker, indem sie ihre Zelllänge verändern können. Dies wird als Elektromotilität bezeichnet. Um eine korrekte elektrische Übertragung bei mechanischen Kräften zu gewährleisten, ist ein gewisser Widerstand des sensorischen Epithels eine Voraussetzung für die fehlerfreie Weiterleitung von Hörinformationen. Dieser Widerstand wird durch Mikrotubuli und deren posttranslationalen Modifikationen in den Stützzellen des sensorischen Epithels der Cochlea gewährleistet. Stat3 ist ein Transkriptionsfaktor, der an verschiedenen Phosphorylierungsstellen, sowie je nach Zelltyp und aktiviertem Signalweg an vielen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Entzündung, Zellüberleben und Mikrotubuli-Dynamik beteiligt ist. Während Stat3 ein breites Spektrum an intrazellulären Funktionen hat, stellte sich die Frage, wie und ob Stat3 in den Zellen des Cortischen Organ einen Einfluss auf den Hörprozess hat. Um dies zu testen, wurde das Cre/loxp-System verwendet, um Stat3 in den äußeren Haarzellen oder den Stützzellen entweder vor oder nach Hörbeginn von Mäusen konditional auszuschalten. Um das Hörvermögen zu erfassen, wurden DPOAE- und ABR-Messungen durchgeführt, während molekulare und morphologische Untersuchungen mittels Sequenzierung und Immunhistochemie durchgeführt wurden. Eine konditioneller Knock-Out von Stat3 vor und nach dem Beginn des Hörens in äußeren Haarzellen führt zu leichten Hörschäden, während Synapsen, Nervenfasern und Mitochondrien nicht betroffen waren. Die Analyse der Sequenzierung von äußeren Haarzellen aus Mäusen mit konditionellem Knock-Out vor dem Beginn des Hörens ergab eine Störung der zellulären Homöostase und der extrazellulären Signale. Ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in den äußeren Haarzellen nach Beginn des Hörens führte zu einem früh-entzündlichen Signalweg mit erhöhter Zytokinproduktion und der Hochregulierung des NF-κB-Wegs. In den Stützzellen führte ein kondioneller Knock-Out von Stat3 nur nach dem Beginn des Hörens zu einer Hörbeeinträchtigung. Synapsen, Nervensoma und -fasern waren jedoch von einem konditionellen Knock-Out von Stat3 in Stützzellen nicht betroffen. Dennoch war die detyronisierte Modifikation der Mikrotubuli verändert, was zu einer Instabilität der Stützzellen, insbesondere der Phalangealfortsätze, führte, was wiederum zu einer Instabilität des Epithels während des Hörvorgangs führte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein konditioneller Knock-Out von Stat3 in Zellen des Cortischen Organs zu einer Hörstörung führte. Während ein konditioneller Knock-Out in äußeren Haarzellen eine erhöhte Zytokinproduktion zur Folge hatte, verloren die Stützzellen ihre Zellstabilität aufgrund einer verminderten detyronisierten Modifikation der Mikrotubuli. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Stat3 ein wichtiges Protein für die Hörleistung ist. Es sind jedoch weitere Untersuchungen des molekularen Mechanismus erforderlich, um die Rolle von Stat3 in den Zellen des Corti-Organs zu verstehen. / The mammalian cochlea detects sound in response to vibration at frequency-dependent positions along the cochlea duct. The sensory outer hair cells, which are surrounded by supporting cells, act as a signal amplifier by changing their cell length. This is called electromotility. To ensure correct electrical transmission during mechanical forces, a certain resistance of the sensory epithelium is a prerequisite for correct transduction of auditory information. This resistance is managed by microtubules and its posttranslational modification in the supporting cells of the sensory epithelium of the cochlea. Stat3 is a transcription factor, with its different phosphorylation sites, is involved in many cellular processes like differentiation, inflammation, cell survival and microtubule dynamics, depending on cell type and activated pathway. While Stat3 has a wide range of intracellular roles, the question arose, how and if Stat3 is involved in cells of the organ of Corti to ensure a correct hearing. To test this, Cre/loxp system were used to perform conditional Knock-Out (cKO) of Stat3 in outer hair cells or supporting cells either before hearing onset or after hearing onset. Hearing performances included DPOAE and ABR measurements, while molecular were performed by sequencing. Additionally, morphological examination was used by immunohistochemistry and electron microscopy. A cKO of Stat3 before and after hearing onset in outer hair cells leads to hearing impairments, whereas synapses, nerve fibers and mitochondria were not affected. Bulk sequencing analyzation of outer hair cells out of cKO mice before hearing onset resulted in a disturbance of cellular homeostasis and extracellular signals. A cKO of Stat3 in the outer hair cells after hearing onset resulted in inflammatory signaling pathway with increased cytokine production and upregulation of NF-kb pathway. In supporting cells, cKO of Stat3 only after hearing onset resulted in a hearing impairment. However, synapses, nerve soma and fibers were not affected of a cKO of Stat3 in supporting cells. Nevertheless, detyronisated modification of microtubules were altered, which can lead to an instability of supporting cells during hearing. In conclusion, Stat3 likely interact in a cell-specific and function-specific manner in cells of the organ of Corti. While a cKO in outer hair cells resulted in increased cytokine production, supporting cells altered its stability due to decreased detyronisated modification of microtubules. Together the results indicated that Stat3 is an important protein for hearing performances. However, additional investigations of the molecular mechanism are needed to understand the role of Stat3 in the cells of the organ of Corti.
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Biologie des cellules souches cochléaires : perspectives dans le traitement de la surdité sensorielle / Stem cell biology of the inner ear : potential therapeutic application of sensory deafness

Savary, Etienne 14 December 2010 (has links)
La destruction des cellules ciliées de la cochlée entraine des surdités sensorielles. Chez les mammifères ces cellules ne se régénèrent pas et les déficits auditifs occasionnés sont définitifs. Aucune thérapie visant à remplacer les cellules ciliées détruites n'est actuellement proposée.L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement d'une thérapie cellulaire basée sur la greffe de cellules souches / progénitrices cochléaires et destinée à promouvoir la régénération des cellules ciliées.Au cours de nos travaux, nous avons isolé une population de cellules souches cochléaires chez des souris néonatales appartenant à la « side population » (Savary et al. 2007). Nous avons également montré, par des expériences de perte et de gain de fonction in vitro, que la voie de signalisation Notch est nécessaire pour l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules (Savary et al., 2008). Des lignées de souris transgéniques exprimant la GFP sous le promoteur de la GFAP et de la Nestine nous ont permis de suivre l'expression de ces marqueurs de cellules souches dans des cochlées de souris P3 et adultes. En étudiant l'expression combinée d'autres marqueurs comme Sox2 et Abcg2, nous avons montré que les cellules progénitrices cochléaires sont réparties différemment chez les souris néonatales et les souris adultes (Smeti, Savary et al 2010).Nos expériences préliminaires de transplantation in vitro dans un modèle murin de surdité génétique humaine de type DFNA15 démontrent que les cellules souches / progénitrices greffées sont capables d'intégrer l'épithélium sensoriel lésé et de se différencier en cellules exprimant un marqueur de cellules ciliées. / The destruction of cochlear hair cells causes sensory deafness. In Mammals these cells do not regenerate and damages are irreversible. Currently, there is no proposed therapy to replace the destroyed hair cells.The focus of this thesis is to develop a novel cell therapy based on transplantation of cochlear progenitor cells in order to promote regeneration of hair cells.We first isolated a population of cochlear stem cells from neonatal mice by using the side population analysis technique (Savary et al. 2007). Then, we showed, by in vitro loss and gain of function experiments, that the Notch signaling pathway is necessary for cellular self-renewal and differentiation (Savary et al., 2008).Transgenic mice strains expressing GFP under the control of GFAP and Nestin promotors allowed us to monitor the expression of these markers of stem cells in the P3 and adult mice cochleae. By studying the combined expression of other stem cells markers such as Sox2 and ABCG2, we showed that the niches of cochlear progenitor cells are differently distributed in neonatal and adult mice (Smati, Savary et al 2010).Our preliminary in vitro transplantation experiments in a mouse model that mimics human genetic deafness DFNA15 show that the transplanted stem / progenitor cells are able to migrate to the lesion site, to integrate the damaged sensory epithelium and to differentiate into cells expressing a marker of hair cells.
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Vliv tkáňových helmintů na rozvoj nádorových onemocnění v modelových organismech / Influence of tissue helminths on the development of cancers in model organisms

Schreiber, Manfred January 2020 (has links)
Mesocestoides corti and Taenia crassiceps are tapeworms, larvae of which are characterized by their ability to reproduce asexually. In this work, the effect of infection by M. corti and T. crassiceps in BALB/c, C57BL/6J and ICR mice on the growth and metastasis of B16F10 melanoma tumors was investigated. Although an increase in metastatic activities was observed after intravenous administration of melanoma cells to M. corti-infected mice, both tapeworms showed a strong suppressive effect on the size and number of tumors and metastases formed when the cells were administered intraperitoneally. This, in some cases, led to a complete elimination of tumor cells. In vitro cultivation of B16F10 cells in the presence of larval excretory-secretory products led to a decrease in their viability but an increase in their migration ability. Flow cytometry proved that M. corti infection has an effect on the increased number and proportion of macrophage populations in the peritoneum of ICR mice. Our work confirmed the anti-tumor effect of T. crassiceps infection in mice and introduced M. corti as a new helminth species capable of influencing cancer. Key words: helminths, cestodes, cancers, Mesocestoides corti, Taenia crassiceps
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Evidências de células-tronco na cóclea humana adulta: formação de esferas e presença do marcador de células-tronco ABCG2 / Evidences of stem cells in the human adult cochlea: sphere formation and identification of ABCG2

Milene Massucci Bissoli 05 October 2016 (has links)
A cóclea humana adulta é reconhecidamente incapaz de se regenerar de modo significativo na prática clínica após uma lesão. Tal fato se explica pela perda da capacidade de proliferação de suas células sensoriais após o período neonatal. Em diferentes espécies de mamíferos neonatos, foi demonstrada a capacidade de proliferação das células sensoriais cocleares através de ensaios de formação de esferas e da presença de marcadores para células-tronco, como o ABCG2. Neste estudo, foram utilizadas cócleas humanas adultas para ensaio de formação de esferas e para a pesquisa do marcador de células-tronco ABCG2 através de citometria de fluxo. As cócleas foram obtidas de pacientes portadores de schwannomas vestibulares submetidos a procedimento cirúrgico para ressecção do tumor via translabiríntica e doadores de órgãos em morte encefálica. Foi possível observar formação de esferas in vitro e identificar o marcador ABCG2 através de citometria de fluxo nas células dissociadas do tecido coclear / The human cochlea is, allegedly, unable to regenerate after trauma due to the loss of the proliferation capacity after the neonatal period. It has been demonstrated in different neonatal mammal species that sensorial cochlear cells retain their proliferation capacity in the neonatal period using sphere-formation assays and stem cell markers such as ABCG2. In the present work, human adult cochleas have been used for sphereformation assay and flow cytometric identification of ABCG2. Human adult cochleas have been removed either from patients undergoing vestibular schwannoma resection via translabyrinthine approach or brain-dead organ donors. There have been identified sphere formation in vitro and the stem cell marker ABCG2 in flow cytometry analysis after cochlear dissociation

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