A serpente Crotalus durissus , popularmente conhecida como cascavel, pertence à família Viperidae, e como a maioria dos viperídeos, é uma espécie vivípara. Este estudo teve como objetivo descrever a histologia do oviduto de fêmeas adultas e do saco vitelino e cordão umbilical de fetos em estágios gestacionais avançados de Crotalus durissus . A placenta de Crotalus durissus é constituída pela aposição do epitélio de revestimento do oviduto com a membrana corio-alantoidina que recobre o hemisfério embrionário do ovo. Estas se interdigitam sutilmente e separando a membrana corio-alantoidinana e o revestimento do oviduto está um remanescente da casca do ovo, chamada de membrana da casca. Quando avaliada a distribuição das fibras do sistema colágeno na placenta corio-alantoidina observamos que as fibras se distribuem irregularmente formando arcabouços de sustentação para os vasos e conferindo maior resistência nas regiões próximas a superfície logo abaixo do epitélio coriônico. Em estágios avançados de gestação, a parede do oviduto de Crotalus durissus apresenta-se como uma estrutura delgada, composta por um epitélio com células cuboidais, repousando em uma lâmina própria constituída por tecido conjuntivo. A mucosa do oviduto de Crotalus durissus apresenta regiões com projeções semelhantes à vilos, sustentados por eixos de fibras colágenas. Em estágios avançados de gestação, a face voltada para o feto do saco vitelino está revestida por um epitélio de células colunares grandes com núcleo posicionado basalmente, apresentando grânulos eosinófilicos. O conteúdo vitelino é, basicamente, constituído por depósitos celulares ricos em proteína e muito eosinofílicos. A distribuição do vitelo parece apresentar uma organização em forma de cachos de uvas sendo os ramos constituídos por trabéculas de células que trazem consigo vasos sanguíneos. Em Crotalus durissus , o cordão umbilical promove a conexão entre os tecidos maternos e os fetos, sendo uma estrutura ricamente vascularizada, constituído por duas artérias e uma veia e o ducto alantoide, envoltos por um tecido mucoide (mesenquimal) / The snake Crotalus durissus, popularly known as rattlesnake, belongs to the family Viperidae, and like most viperids, is a viviparous species. This study aimed to describe the oviduct histology of adult females and yolk sac and umbilical cord of fetuses in advanced stages of pregnancy in Crotalus durissus. The Crotalus durissus placenta is formed by affixing the oviduct epithelium lining with chorio-alantoidina membrane covering the embryonic hemisphere of the \"egg\". These interdigitate subtly and separating the chorioalantoidinana membrane and the oviduct of the coating is one of the eggshell remnant, called the shell membrane. When evaluated the distribution of collagen fibers in the system chorio-alantoidina placenta observed that the fibers forming irregularly distributed support frameworks for vessels and providing greater resistance in the regions near the surface just below the chorionic epithelium. In advanced stages of pregnancy, the wall of the oviduct in Crotalus durissus appears as a thin structure made up of a cuboidal epithelium with cells, resting on a lamina consists of connective tissue. The mucosa of the oviduct of Crotalus durissus presents regions with projections similar to the villi, supported by shafts of collagen fibers. In advanced stages of pregnancy, the fetus side facing the yolk sac is coated by a large columnar epithelial cells with basally placed core, with eosinophilic granules. The yolk contents basically comprised of cellular rich protein deposits, and eosinophilic. The distribution of the calf seems to present an organization in a \"bunch of grapes\" being the groups consisting of trabecular cells bring with blood vessels. In Crotalus durissus, the umbilical cord promotes the connection between fetal and maternal tissues and is a highly vascularized structure, consisting of two arteries and one vein, and the allantoic duct, surrounded by a mucoid tissue (mesenchymal)

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

Thesis (M.S.)--California Polytechnic State University, 2009. / Title from PDF title page; viewed on September 22, 2009. Major professor: Emily Taylor, Ph.D. "Presented to the faculty of California Polytechnic State University, San Luis Obispo." "In partial fulfillment of the requirements for the degree [of] Master of Science in Biological Sciences." "June, 2009." Includes bibliographical references (p. 48-57). Also available on microfiche.

SOUZA, Ticyano Pereira de. Estudo do efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus na reação de transferência de elétrons da mioglobina. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2017-05-10T23:07:04Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-19T20:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T20:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_tpsouza.pdf: 2510854 bytes, checksum: f05409758b4589cd3f1f1ed6119f6ca0 (MD5) Previous issue date: 2016 / The effect of the venom of the Crotalus basiliscus snake on the electron transfer (ET) reaction of the myoglobin (Mb) protein was studied using a gold electrode modified with cysteine (Au/Cys) followed by the immobilization of the protein (Au/Cys/Mb). For that, the following techniques were used: cyclic voltammetry, surface plasmon resonance (SPR), absorption spectroscopy in the ultraviolet and visible regions (UV-Vis), circular dicroism (CD), and gel electrophoresis. The electrode reaction assigned to the FeII/III redox pair of Mb was observed at 0.09V vs Ag/AgCl being consistent with the native form of the protein. Upon immersion of the Au/Cys/Mb electrode in solution containing the venom of the Crotalus basiliscus snake, it was observed a decrease in the faradaic current. The deleterious effect of the venom on the electrode reaction of Mb was corroborated by the observation of the loss of the catalytic activity of the Au/Cys/Mb electrode towards the oxidation reaction of the ascorbic acid (AA). The successive mass increments observed by SPR upon the injections of cysteine (0.172 µg cm-2), myoglobin (0.410 µg cm-2) and venom (0.151 µg cm-2) indicated that the adsorbed molecules of cysteine and myoglobin were not desorbed from the gold surface upon exposure to the solution of the venom of the Crotalus basiliscus snake. Rather, the mass increase indicated the molecules of the venom were immobilized on the the Au/Cys/Mb electrode. Such proposition was reinforced by the electrophoresis results which showed a decrease in the mobility of Mb after mixing to the solution containing the snake venom. The electronic UV-Vis spectra did not show meaningful changes in the Soret band of Mb; a band sensitive to the level of protein denaturation. Likewise, the CD spectra obtained in the far-UV, near-UV and Soret regions did not present spectral profile changes indicating that the physical integrity of the protein was maintained after the exposure to the snake venom, i.e. the protein was not denaturated. / O efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre a reação de transferência de elétrons (TE) da proteína mioglobina (Mb) foi estudado utilizando-se um eletrodo de ouro modificado com cisteína (Au/Cys) seguido da imobilização da proteína (Au/Cys/Mb). Para tanto, foram utilizadas as técnicas de voltametria cíclica, ressonância de plásmons de superfície (SPR-Surface Plasmon Resonance), espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível (UV-Vis), espectroscopia de dicroísmo circular (CD-Circular Dichroism) e eletroforese em gel desnaturante. A reação de eletrodo atribuída ao par redox FeII/III da Mb foi observada em 0,09V vs Ag/AgCl sendo consistente com a forma nativa da proteína. Após imersão do eletrodo Au/Cys/Mb em solução contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus, observou-se a diminuição da corrente. O efeito nocivo do veneno sobre a reação de eletrodo da Mb foi corroborado com a observação da perda de atividade catalítica do eletrodo Au/Cys/Mb frente a reação de oxidação do ácido ascórbico (AA). Os aumentos sucessivos de massa observados por SPR quando das injeções de cisteína (0,172 µg cm-2), mioglobina (0,410 µg cm-2) e veneno (0,151 µg cm-2) indicaram que as moléculas adsorvidas de cisteína e mioglobina não experimentam desorção após exposição ao veneno da cobra Crotalus basiliscus. Ao contrário, o aumento de massa indicou que moléculas do veneno foram imobilizadas sobre o eletrodo Au/Cys/Mb. Tal proposição foi reforçada pelos resultados de eletroforese que apresentaram uma diminuição na mobilidade da Mb no gel após a mistura com a solução contendo veneno da cobra Crotalus basiliscus. Os espectros eletrônicos UV-Vis não apresentaram mudança significativa na banda Soret da Mb; banda esta sensível ao grau de desnaturação da proteína. Da mesma forma, os espectros de Dicroísmo Circular obtidos nas regiões do UV-distante, UV-próximo e Soret não apresentaram mudanças no perfil espectral da proteína, indicando que a integridade física da Mb é mantida após exposição ao veneno, ou seja, a proteína não foi desnaturada.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os PeptÃdeos NatriurÃticos (NPs) tÃm significativa participaÃÃo na regulaÃÃo na homeostasia cardiovascular, renal e endÃcrina, e tÃm sido descritos nos venenos de serpentes peÃonhentas. A Crotalus durissus cascavella, uma serpente terrÃcola caracterÃstica da caatinga do Nordeste do Brasil, possui em seu veneno total um NP (NPCdc), ao qual sÃo relatados efeitos vasculares e renais. O objetivo desse trabalho foi sintetizar em fase sÃlida o NPCdc e avaliar suas aÃÃes renais atravÃs da perfusÃo de rim isolado e em cultura de cÃlulas tubulares renais da linhagem MDCK e LLC-MK2. Rins de ratos Wistar machos, pesando entre 250-300 g, foram excisados cirurgicamente e perfundidos com soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada com 6% p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do NPCdc em quatro concentraÃÃes (0,03 Âg/mL; 0,1 Âg/mL; 0,3 Âg/mL e 1 Âg/mL; n=6). As cÃlulas MDCK e LLC-MK2 foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e entÃo avaliadas na presenÃa do NPCdc em diversas concentraÃÃes em um perÃodo de incubaÃÃo de 24 horas. ApÃs esse perÃodo, foram realizados ensaios de viabilidade celular. Os dados foram comparados estatisticamente considerando P<0,05. Houve aumento na pressÃo de perfusÃo (PP) em 0,03 Âg/mL e reduÃÃo em 1 Âg/mL. A resistÃncia vascular renal (RVR) apresentou aumento em 0,03 Âg/mL. O fluxo urinÃrio (FU) aumentou em 0,03 Âg/mL e diminuiu em 0,1 Âg/mL e 1 Âg/mL. O ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) encontrou-se diminuÃdo nas quatro concentraÃÃes testadas. O clearance osmolar (COsm) apresentou-se aumentado em 0,03 &#956;g/mL e reduzido em 0,1 &#956;g/mL e 1 &#956;g/mL. O percentual de transporte tubular total e proximal de sÃdio (%TNa+ e %TpNa+, respectivamente) e cloreto (%TCl- e %TpCl-, respectivamente) apresentaram reduÃÃes nas quatro concentraÃÃes testadas. JÃ o percentual de transporte tubular total e proximal de potÃssio (%TK+ e %TpK+, respectivamente) apresentaram-se reduzidos em 0,03 &#956;g/mL e 0,3 &#956;g/mL. A anÃlise histopatolÃgica mostrou a presenÃa de alteraÃÃes morfolÃgicas significativas, como degeneraÃÃo hidrÃpica concentraÃÃo-dependente em todas as concentraÃÃes, juntamente com discreta a moderada deposiÃÃo de material proteÃceo nos tÃbulos na concentraÃÃo de 0,03 &#956;g/mL. Na cultura de cÃlulas MDCK e LLC-MK2, porÃm, o NPCdc nÃo foi capaz de diminuir a viabilidade celular. Esses resultados demonstram que o NPCdc modificou todos os parÃmetros avaliados na perfusÃo de rim isolado, alÃm de revelar alteraÃÃes de carÃter citotÃxico na anÃlise histopatolÃgica dos mesmos, todavia, nÃo as apresentando em culturas de cÃlulas tubulares renais. / Natriuretic Peptides (NPs) have significant interest in regulating the cardiovascular, renal and endocrine homeostasis, and have been described in the venom of venomous snakes. Crotalus durissus cascavella, a characteristic terrestrial snake of caatinga biome of northeastern Brazil, has in his whole venom an NP (NPCdc), of which are reported vascular and renal effects. The aim of this study was to synthesize NPCdc in solid phase and evaluate its renal actions through isolated kidney perfusion and culture of renal tubular cells of MDCK and LLC-MK2 line. Kidneys from male Wistar rats weighing 250-300 g were surgically excised and perfused with modified Krebs-Henseleit solution with 6 g% of previously dialyzed bovine serum albumin. The effects of NPCdc were investigated in four concentrations (0.03 &#956;g/mL, 0.1 &#956;g/mL, 0.3 &#956;g/mL and 1 &#956;g/mL, n=6). MDCK and LLC-MK2 cells were cultured in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% v/v Fetal Bovine Serum and then evaluated in presence of several concentrations of NPCdc at an incubation period of 24 hours. After this period, cell viability assays were performed. Data were statistically compared considering P<0.05. There was increase in perfusion pressure (PP) in 0.03 &#956;g/mL and reduction in 1 &#956;g/mL. Renal vascular resistance (RVR) was increased at 0.03 &#956;g/mL. Urinary flow (UF) increased in 0.03 &#956;g/mL and decreased in 0.1 &#956;g/mL and 1 &#956;g/mL. The glomerular filtration rate (GFR) was reduced at all the concentrations tested. Osmolar clearance (OsmC) was increased in 0.03 &#956;g/mL and reduced in 0.1 &#956;g/mL and 1 &#956;g/mL. Percentage of the total and proximal tubular transport of sodium (%TNa+ and %pTNa+, respectively) and chloride (TCl-% and pTCl-%, respectively) showed reductions at all concentrations tested. Percentage of the total proximal tubular transport and potassium (%TK+ and pTK+%, respectively) were reduced in 0.03 &#956;g/mL and 0.3 &#956;g/mL. The histopathological analysis revealed the presence of significant morphological changes, such as concentration-dependent hydropic degeneration at all concentrations, along with mild to moderate deposition of proteinaceous material in the tubules in concentration 0.03 &#956;g/mL. In the culture of MDCK and LLC-MK2 cells, however, NPCdc was not able to lower cell viability. These results demonstrate that NPCdc modified all parameters assessed in renal perfusion of isolated kidney, and showed cytotoxic alterations in histopathological analysis, however, not presenting it in cultures of renal tubular cells.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Envenenamento por serpentes é um importante problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais, pois além da mortalidade, pode resultar em sequelas permanentes como consequência de danos locais, representando assim um grande desafio à terapia utilizando antivenenos. As proteínas fosfolipases A2 (PLA2s) e fosfolipases A2 homólogas de venenos têm um papel fundamental na complexa patogênese da necrose do músculo esquelético e seus mecanismos de ação são apenas parcialmente entendidos. Por isso, a busca por inibidores e da completa descrição do mecanismo de ação das PLA2s e PLA2s homólogas representam assuntos amplamente abordados no campo acadêmico-científico. Para o melhor entendimento desses mecanismos e a busca por novas moléculas inibidoras, o entendimento dos processos de reconhecimento molecular de pequenos ligantes e macromoléculas biológicas é fundamental e requer a completa caracterização da energética de ligação desses agentes e da correlação entre os dados termodinâmicos e cinéticos com as estruturas moleculares envolvidas na ligação. Para tanto, a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é a metodologia mais utilizada com este fim. Nesse trabalho, nossos objetivos foram: i) determinar os parâmetros termodinâmicos de moléculas candidatas a inibidores da atividade miotóxica de PLA2s homólogas: bothropstoxina-I (BthTX-I) e moojenitoxina I (MjTX-I) e II (MjTX-II), purificadas do veneno de serpentes do gênero Bothrops e (ii) caracterizar a interação ent... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2015-07-17T20:09:12Z No. of bitstreams: 1 SANTOS, Suelen Silva.pdf: 1691440 bytes, checksum: 372b85d7abfab49a255d471a150110b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-17T20:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SANTOS, Suelen Silva.pdf: 1691440 bytes, checksum: 372b85d7abfab49a255d471a150110b1 (MD5) / As toxinas de animais são fontes de recursos naturais para estudos farmacológicos. O veneno da Crotalus durissus cascavella (CDC), pode ser uma fonte na bioprospecção de novos agentes anti-hipertensivos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito vascular e cardíaco do veneno da CDC em ratos normotensos (Wistar). Foram realizados estudos in vitro com artéria mesentérica isolada de ratos, células endoteliais aórticas isoladas e átrio isolado. A administração cumulativa do veneno da CDC (0,001 – 30 µg/ml) em anéis pré-contraídos com Phe (10 µM), induziu um vasorrelaxamento dependente de concentração com Emax = 47,9 ± 5,0 % n=8 na presença do endotélio vascular, sendo seu efeito praticamente abolido na ausência do endotélio Emax = 5,8 ± 2,4% n=5 (***p < 0,001). Em tônus basal, os anéis vasculares apresentaram contração significante (*p<0,05) após adição do veneno; a viabilidade tecidual foi mantida, pois não houve diferença na capacidade contrátil dos anéis após administração do veneno. O efeito vasorrelaxante do veneno sobre contrações induzidas por KCl 80 mM, foi abolido ( Emax = 6,4 ± 0,9% n= 5) (***p < 0,001). No entanto, em contrações induzidas por PGF2α, o efeito do veneno foi atenuado de forma significante (***p < 0,001) (PGF2α Emax = 18,7 ± 1,3% e CE50 = 15,22 (8,3 - 27,7). Avaliando a participação dos fatores de relaxamento derivados do endotélio, foi observado que a inibição não seletiva da COX com indometacina (10 µM) apresentou uma atenuação significante (*p<0,05) sobre efeito vasorrelaxante, a partir das duas últimas concentrações testadas. Investigando a participação do NO liberado pelo endotélio, foi demonstrada uma redução significante do efeito vasorrelaxante do veneno em anéis tratados com L-NAME (100 µM)(Emax para 17,5 ± 2,2% n= 6 (**p<0,01). Resultados semelhantes foram observados na presença de ODQ (10 µM), um inibidor da guanilil ciclase solúvel (Emax = 11,2 ± 3,5%, n= 6). Adicionalmente, o veneno induziu liberação de NO por células endoteliais aórticas isoladas através de estudos de amperimetria. Avaliando a participação dos canais de K+ na resposta vasodilatadora do veneno foi demonstrado uma redução significante (***p<0,001) deste efeito na presença de solução de tyrode com 20 mM de KCl (Emax = 21,3 ± 8, %, n=7). O bloqueio dos BKCa com TEA (1mM) não apresentou alteração significante sobre o efeito vasorrelaxante (Emax = 40,0 ± 6, %, n=5). A presença do bloqueador dos canais para K+ retificadores de entrada (BaCl2 30 µM), ou do bloqueador dos canais para K+ retificador retardado (4-aminopiridina 1 mM), induziu uma diminuição significante do efeito vasorrelaxante do veneno da CDC (Emax = 21,7 ± 8, %, n= 5.,*p<0,05 e Emax = 9,5 ± 1,3, %, n=5, ***p<0,001; respectivamente). Por fim, o veneno promoveu efeito inotrópico negativo em átrio isolado de rato demonstrando uma importante ação cardíaca direta. Portanto, esses resultados sugerem que o veneno da CDC induz vasorrelaxamento em anéis da artéria mesentérica superior de ratos normotensos de maneira dependente do endotélio, possivelmente através de fatores de relaxamento derivados do endotélio, principalmente o NO, além da participação de canais para K+ . Alem disso, apresenta atividade cardíaca direta, tornando-se uma importante fonte de moléculas com atividade cardiovascular. / Animal toxins are sources of natural resources for pharmacological studies. The poison of Crotalus durissus cascavella (CDC) may be a source in the bio-prospecting of new antihypertensive agents. The aim of this study was to investigate vascular and cardiac effects of the poison of CDC in normotensive rats (Wistar). In vitro studies were performed using isolated mesenteric artery of rats, besides aortic endothelial cells and isolated atrium. The cumulative administration of the poison of CDC (0,001 – 30 µg/ml) in Phe (10 µM) precontracted rings induced a concentration-dependent vasorelaxation with Emax = 47,9 ± 5,0 % n=8 in the presence of vascular endothelium, and its effect was nearly abolished in the absence of endothelium Emax = 5,8 ± 2,4% n=5 (***p < 0,001). In basal tonus, the vascular rings showed significant contraction (*p<0,05) after addition of poison; the tissue feasibility was kept because there was no difference in the contractile capacity of rings after administration of poison. The vasorelaxant effect of poison over contractions induced by KCl 80 mM was abolished ( Emax = 6,4 ± 0,9% n= 5) ( ***p < 0,001). However, in contractions induced by PGF2α, the effect of poison was mitigated in a significant way ( ***p < 0,001) (PGF2α Emax = 18,7 ± 1,3% and CE50 = 15,22 (8,3 - 27,7). When assessing the participation of endothelium-derived relaxing factors, it was noted that the COX non-selective inhibition with indomethacin (10 µM) showed a significant mitigation (*p<0.05) over the vasorelaxant effect, from the last two tested concentrations. When investigating the participation of NO released by endothelium, there was a significant reduction of the vasorelaxant effect of poison in rings treated with L-NAME (100 µM)(Emax for 17,5 ± 2,2% n= 6 (**p<0,01). Similar results were noted in the presence of ODQ (10 µM), which is an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (Emax = 11,2 ± 3,5%, n= 6). Moreover, the poison induced the release of NO by isolated aortic endothelial cells through amperometric studies. When assessing the participation of K+ channels in the vasodilatory response of poison, it was shown a significant reduction (***p<0,001) of this effect in the presence of tyrode solution with 20 mM of KCl ((Emax = 21,3 ± 8, %, n=7). The blocking of BKCa block with TEA (1mM) did not show significant alteration in the vasorelaxant effect (Emax = 40,0 ± 6, %, n=5). The presence of the blocker of inward rectifier K+ channels (BaCl2 30 µM), or of the blocker of delayed rectifier K + channels (4-amynopiridine 1 mM), induced a significant reduction of the vasorelaxant effect of the poison of CDC (Emax = 21,7 ± 8, %, n= 5.,*p<0,05 and Emax = 9,5 ± 1,3, %, n=5, ***p<0,001; respectively). Lastly, the poison promoted a negative inotropic effect in isolated atrium of rat, thereby showing an important direct cardiac action. Therefore, these results suggest that the poison of CDC induces vasorelaxation in superior mesenteric artery rings of normotensive rats in an endothelium-dependent way, which possibly occurs through endothelium-derived relaxing factors, especially the NO, besides the participation of K + channels. Furthermore, it shows direct cardiac activity, thereby becoming an important source of molecules with cardiovascular activity.

Submitted by Thiago Revers Dreyer null (thiagodreyer@ibb.unesp.br) on 2017-04-04T11:18:09Z No. of bitstreams: 1 TRD_BGA_2017.pdf: 7791379 bytes, checksum: 154e659667a667384ebe6ba28bf8319e (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-12T16:35:48Z (GMT) / Submitted by Thiago Revers Dreyer null (thiagodreyer@ibb.unesp.br) on 2017-04-12T17:09:46Z No. of bitstreams: 1 TRD_BGA_2017_2.pdf: 20492814 bytes, checksum: 4a99fda2f26876a945d368c7191f1ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-12T17:22:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dreyer_tr_dr_bot.pdf: 20492814 bytes, checksum: 4a99fda2f26876a945d368c7191f1ae5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T17:22:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dreyer_tr_dr_bot.pdf: 20492814 bytes, checksum: 4a99fda2f26876a945d368c7191f1ae5 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Envenenamento por serpentes é um importante problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais, pois além da mortalidade, pode resultar em sequelas permanentes como consequência de danos locais, representando assim um grande desafio à terapia utilizando antivenenos. As proteínas fosfolipases A2 (PLA2s) e fosfolipases A2 homólogas de venenos têm um papel fundamental na complexa patogênese da necrose do músculo esquelético e seus mecanismos de ação são apenas parcialmente entendidos. Por isso, a busca por inibidores e da completa descrição do mecanismo de ação das PLA2s e PLA2s homólogas representam assuntos amplamente abordados no campo acadêmico-científico. Para o melhor entendimento desses mecanismos e a busca por novas moléculas inibidoras, o entendimento dos processos de reconhecimento molecular de pequenos ligantes e macromoléculas biológicas é fundamental e requer a completa caracterização da energética de ligação desses agentes e da correlação entre os dados termodinâmicos e cinéticos com as estruturas moleculares envolvidas na ligação. Para tanto, a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é a metodologia mais utilizada com este fim. Nesse trabalho, nossos objetivos foram: i) determinar os parâmetros termodinâmicos de moléculas candidatas a inibidores da atividade miotóxica de PLA2s homólogas: bothropstoxina-I (BthTX-I) e moojenitoxina I (MjTX-I) e II (MjTX-II), purificadas do veneno de serpentes do gênero Bothrops e (ii) caracterizar a interação entre as componentes ácida (CA) e básica (CB) da crotoxina, obtida do veneno da serpente Crotallus durissus terrificus. As serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus são as principais responsáveis por acidentes ofídicos na América Latina e estas proteínas apresentam alta proporção do volume nestes venenos. Foi verificado por ITC que o ácido chicórico, composto vegetal atualmente extraído de várias plantas, que bloqueou a atividade miotóxica in vitro, se liga ao dímero de BthTX-I na proporção estequiométrica de 1:1 com média afinidade de ligação ( = 8.47±1.26 μM). Foi verificado ainda que o processo de ligação é entálpica e entropicamente favoráveis ( 3,97±0,14 kcal/mol, 2,83 kcal/mol). Entretanto para apresentar energia livre semelhante à já apresentadas para outros inibidores virais ainda seria necessário diminuir a energia de ligação na ordem de -10 kcal/mol. Em relação às interações dos íons Zn2+ com a BthTX-I, a titulação se apresentou predominantemente exotérmica e a isoterma de ligação foi melhor ajustada considerando-se 3 eventos de ligação (F-test, p<0.05), sendo que os íons Zn2+ tem baixa afinidade pela proteína ( = 83,3±25,4, 62,1±25,1 e 300,0±104,3 μM). Em função da baixa afinidade, o íon não se apresenta como um bom inibidor, mas tem sua importância na explicação dos mecanismos estruturais da BthTX-I. A suramina, quando titulada à MjTX-I e MjTX-II, apresentou afinidade de ligação moderada-alta ( =0,56±0,23 e 0,6±0,1 μM, respectivamente) e complexos termogramas, em ambos casos, com grandes variações entálpicas, com processos endo e exotérmico ocorrendo durante a titulação. Em ambos os casos foi sugerido que esse comportamento demonstra processos de oligomerização com formação de dímeros e tetrâmeros, nos casos da MjTX-I e MjTX-II respectivamente. Nos experimentos calorimétricos realizados com os componentes da crotoxina, CA e CB, foi sugerido pelo termograma e isotermas obtidos que a CA é capaz de dissociar o tetrâmero formado por CB para formar a crotoxina. Ambos os eventos apresentaram afinidades de dissociação do tetrâmero e complexação da CA/CB da ordem de submicrmolar enquanto o primeiro evento é entropicamente guiado enquanto o segundo é entalpicamente guiado. / Envenomation by snakebites is an important public health problem in many tropical and subtropical countries that, in addition to mortality, can result in permanent sequelae as a consequence of local damage, which represents a major challenge to antivenom therapy. Venom phospholipases A2 (PLA2s) and PLA2s-like proteins play an important role in the complex pathogeneis of skeletal muscle necrosis and their precise mechanism of action is only partially understood. Therefore, the search for inhibitors and the complete description of the mechanism of action of the PLA2s and PLA2s-like represent a wide covered issues in the academic and scientific fields. For a better understanding of these mechanisms and the search for new inhibitory molecules, the understanding of the molecular recognition processes of small ligands and biological macromolecules is fundamental and requires the complete characterization of the binding energy of these agents and of the correlation between thermodynamic and molecular structures involved in the binding. For this purpose, isothermal titration calorimetry (ITC) is the most used methodology. In this work, our objectives were: (i) to determine the thermodynamic parameters of molecules candidates for inhibitors of myotoxic activity of PLA2s-like proteins: bothropstoxin-I (BthTX-I) and moojenitoxin-I (MjTX-I) and II (MjTX-II), purified from snake venoms of the bothropic genus and (ii) characterize the thermodynamics of the interaction between the acidic (CA) and basic (CB) components of the crotoxin, purified from the venom of Crotallus durissus terrificus. Snakes of the genera Bothrops and Crotalus are the main responsible for ophidian accidents in Latin America and these proteins have a high proportion of the volume of these venoms. It was verified by ITC that chicoric acid, a vegetal compound extracted from several plants that blocks myotoxic acitivity of BthTX-I in vitro, binds to BthTX-I dimer at the stoichiometric ratio of 1:1 with medium binding affinity ( =8.47±1.26 μM). It was also verified that the binding process is enthalpic and entropically driven ( 3.97±0.14 kcal/mol, 2.83 kcal/mol). However, for the chicoric acid to have free energy similar to that already shown by other viral inhibitors, it would still be necessary to decrease its binding energy in the order of -10 kcal/mol. In relation to the interactions of the Zn2+ ions with BthTX-I, the titration was predominantly exothermic and the binding isotherm was better adjusted considering 3 binding events (F-test, p<0.05), with Zn2+ ions having low affinity for the protein ( = 83.3±25.4, 62.1±25.1 and 300.0±104.3 μM). Due to the low affinity, the ion does not present itself as a good inhibitor, but was important to explain the structural myotoxic mechanisms of Lys49-PLA2s. Suramine, when titrated to MjTX-I and MjTX-II, had moderate to high binding affinity ( = 0.56±0.23 and 0.6±0.1 μM, respectively) and complex thermograms in both cases, with large enthalpic variations with endo and exothermic processes occurring during the titration. In both cases, it was suggested that their behavior demonstrates oligomerization processes with formation of dimers or tetramers, in the cases of MjTX-I and MjTX-II, respectively. In the calorimetric experiments performed with the components of crotoxin, CA and CB, it was suggested by the thermogram and isotherms obtained that CA is able to dissociate the tetramer formed by CB to form the crotoxin. Both events showed dissociation affinities of the tetramer and complexation of the CA/CB in the submicromolar range, being the first event entropically driven while the second is entalpically driven. / FAPESP: 2013/24705-3 / FAPESP: 2015/17286-0

Orientador:Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T05:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_D.pdf: 15606775 bytes, checksum: 3232092d1eced36a575f660d994b44a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e função / Abstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular