Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-10-22T18:58:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Carine Souza Aguiar.pdf: 1618744 bytes, checksum: a297cae4dbf16da3ebefd6282adb27c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-22T18:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Carine Souza Aguiar.pdf: 1618744 bytes, checksum: a297cae4dbf16da3ebefd6282adb27c1 (MD5) / Os venenos de serpentes são constituídos por uma mistura complexa de substâncias e como consequência podem apresentar distintas funções biológicas, bioquímicas e farmacológicas. Devido ao seu elevado grau de especificidade do alvo, toxinas têm sido cada vez mais utilizadas como instrumentos farmacológicos e como protótipos para o desenvolvimento de drogas. As infecções estão entre as dez principais causas de morte no mundo, por isso é necessária a descoberta de novas alternativas para o tratamento das infecções que envolvem os diversos microrganismos patogênicos. Apesar dos efeitos tóxicos, os venenos possuem grande potencial para produção de novos medicamentos. Através de metodologias como disco difusão e microdiluição é possível identificar se um composto possui ou não atividade antimicrobiana e avaliar a intensidade dessa atividade. Existem vários relatos de atividade antimicrobiana em venenos de diferentes serpentes. A descoberta de novas moléculas que possuam alguma atividade biológica decorre de testes com substâncias que ainda não foram utilizadas para este fim e/ou que não tenham sido estudadas em sua totalidade, por isso, dentre as várias espécies de serpentes peçonhentas, foram escolhidos como alvo deste trabalho as serpentes Bothrops leucurus e Crotalus durissus cascavella, pois o uso dos venenos produzidos por elas constituem-se como fontes potenciais para o estudo de atividades bactericida e antifúngico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana dos venenos totais dessas serpentes contra 20 cepas bacterianas e 8 espécies fúngicas através do teste de disco difusão, determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e comparar a atividade antimicrobiana desses venenos. Os testes mostraram que o veneno VBL apresentou atividade através da formação de halos de inibição frente a 19 cepas de bactérias e o VCC em 18 cepas. A ação dos dois venenos foi dose-dependente no teste de disco difusão para a maioria dos microrganismos. O veneno VBL em solução aquosa manteve sua atividade após o congelamento nos teste de microdiluição em caldo frente a 10 cepas de bactérias e o VCC em apenas 6 cepas. Em relação aos fungos filamentosos o VBL apresentou atividade em 4 e o VCC em 2 das espécies testadas. Os valores das CIM's determinadas para os dois venenos demonstram que o VBL possui maior atividade na inibição de todos os microrganismos do que o VCC. Diante dos resultados encontrados, acredita-se que é possível termos mais de uma substância agindo na inibição do crescimento dos microrganismos. É importante ressaltar que como se trata de venenos totais, muitas substâncias podem estar atuando sobre esses microrganismos. Bactérias e fungos variam amplamente na composição das suas membranas e paredes, portanto, era esperado que exibissem diferentes sensibilidades aos venenos, não sendo ainda possível avaliar se uma ou mais substâncias são responsáveis pelos resultados encontrados.

Estudos anteriores demonstraram que o veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) apresenta ação antiinflamatória prolongada, bem como inibe o espraiamento e a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais, sendo a crotoxina (CTX), o principal componente do VCdt, a responsável por esses efeitos. Em relação aos neutrófilos, demonstrou-se que o VCdt inibe, in vitro e in vivo, a fagocitose por essas células, porém o componente do VCdt responsável por esse efeito não foi identificado. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar o componente responsável pelo efeito inibitório do VCdt sobre a fagocitose por neutrófilos, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos nessa ação. Além disso, foi também objetivo desse estudo investigar o efeito do VCdt e da CTX sobre a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. Inicialmente, foi avaliado o efeito in vitro dos três picos do VCdt, obtidos durante a purificação da CTX (pico I; pico II, que corresponde a CTX, e pico III), sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. A incubação dos neutrófilos com a CTX ou com os picos I ou III, em diferentes concentrações (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), mostrou que somente o pico II inibiu essa atividade, demonstrando que a CTX é o componente do VCdt responsável pelo seu efeito inibitório sobre a fagocitose por neutrófilos. Uma vez realizada essa identificação, foi investigado o efeito in vivo da CTX sobre essa função. O tratamento dos animais com a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes ou 1 hora após a administração de carragenina inibiu a fagocitose por neutrófilos, o que demonstra que esta toxina, além do efeito direto, apresenta efeito sistêmico sobre a atividade fagocítica dessas células. Esses resultados mostraram também que a CTX apresenta efeito inibitório prolongado sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. Ainda, com o objetivo de elucidar os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito inibitório foram realizados ensaios imunocitoquímicos para avaliar a reorganização do citoesqueleto. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,5 ug/mL) ou com a CTX (0,08 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, inibiram a fosforilação de resíduos de tirosina e a polimerização da actina. Em relação ao efeito do VCdt e da CTX sobre outra função dos neutrófilos, foi investigado, em ensaios in vitro e in vivo, a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 ou 2,0 ug/mL) ou a CTX (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, não alteraram a atividade microbicida e a produção de ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Em conclusão, a CTX é o componente do VCdt responsável por inibir a fagocitose por neutrófilos e um dos mecanismos envolvidos neste efeito é a inibição da fosforilação de proteínas sinalizadoras e a conseqüente polimerização de actina, importante evento para o início da formação do fagossoma e a completa internalização da partícula. Por outro lado, o VCdt e a CTX não alteram a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos. Dessa forma, considerando-se o papel fundamental dessas células na inflamação, este estudo amplia os conhecimentos das ações moduladoras da CTX sobre a resposta inflamatória e, ainda, contribui para a elucidação dos mecanismos envolvidos nestas ações, particularmente, a inibição do processo de fagocitose por neutrófilos. / Previous studies showed that Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) has long-lasting anti-inflammatory properties and inhibits the spreading and the phagocytic activity of peritoneal macrophages. Crotoxin (CTX), the main component of CdtV, is responsible for these effects. In addition, CdtV inhibits, in vitro and in vivo, the phagocytic activity of neutrophils, but the component of the venom responsible for this effect was not identified. In this way, the aim of this study was to investigate the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils, as well as to investigate possible mechanisms involved on this effect. Besides, the aim of this study was also to investigate the effect of CdtV and CTX on the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. Initialy, it was avaliated the in vitro effect of the three peaks of CdtV, obtained during CTX purification (peak I, peak II that corresponds to CTX and peak III), on phagocytosis by neutrophils. The incubation of the cells with CTX, peak I or peak III, at different concentrations (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), showed that just peak II inhibited this activity, so CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils. Once realized this identification, it was investigated the in vivo effect of CTX on the same neutrophil function. Treating animals with CTX (0.1 mg/kg), 2 hours, 1, 4 or 14 days before or 1 hour after the administration of carrageenan inhibited the phagocytic activity of neutrophils, which demonstrates that this toxin, in addition to the direct effect, has systemic effect on phagocytosis by neutrophils. These results also show that CTX has a long-lasting inhibitory effect on the phagocytic activity of these cells. Further, to elucidate possible mechanisms involved on this inhibitoty effect, immunocytochemical assays was realized to evaluate the reorganization of the cytoskeleton. The incubation of the neutrophils with CdtV (0.5 ug/mL) or CTX (0.08 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carrageenan injection, inhibited the phosphorilation of tyrosine residues and actin polymerization. Regarding the effect of CdtV and CTX in other neutrophil function, it was investigated, in vitro and in vivo, the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. The incubation of the cells with CdtV (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 ug/mL) or CTX (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carragennan injection, did not alter the microbicidal activity or the production of superoxide, hydrogen peroxide and hypochlorous acid. In conclusion, CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils and a mechanism involved on this effect is the inhibition of phosphorilation of signaling proteins and the consequent actin polymerization, an important event for the phagosome formation and the complete internalization of the particle. On the other hand, CdtV and CTX did not alter the microbicidal activity or the production of reactive oxygen species. Thus, considering the essential role of these cells in inflammation, this study extends the knowledge of the actions of CTX on modulating the inflammatory response and also contributes to the elucidation of the mechanisms involved in these actions, particularly the inhibition of phagocytosis by neutrophils.

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c. / Snake venoms are considered rich sources of a variety of components that displays important pharmacological activities. The study of these diverse components allows the elucidation of envenoming pathology and the identification of molecules with potential biotechnological applications. The snakes of Crotalus durissus species inhabit various regions of Brazil and their venoms are a complex mixture of proteins (around 95%), carbohydrates, metal cations, biogenic amines, nucleosides, non-enzymatic components, free amino acids and a small lipid fraction. Many components have not yet been isolated, although some of them have already been identified in omics analysis (transcriptome and proteome), like the VEGF (Vascular Endothleial Growth Factor) identified by these techniques in the Crotalus durissus collilineatus (C.d.c) venom. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular weights varying from 20 to 30 kDa for the dimer and 13 to 16 kDa for the monomer. They have a central role in angiogenesis (growth of new vessels) but their role in the envenoming pathophisiology is not elucidated. This study aimed to isolate and perform the elucidation of the structural and functional aspects of a VEGF from C.d.c snake venom. Initially, the venom was submitted to a LC-MS analysis for the global knowledge of its components. Then, it was fractionated by reversed phase chromatography on FPLC system (Fast Protein Liquid Chromatography) and later all the fractions collected were submitted to an ELISA for identification of VEGF. The fractions 23, 24 and 25 proved being positive for VEGF and therefore, were chosen to be studied. These fractions were rechromatographed by three different protocols (cation exchange, reversed phase and anionic exchange). All the subfractions obtained by these chromatographies were analyzed by ELISA for the confirmation and identification of VEGF and by an SDS-PAGE for the analysis of their composition. These subfractions were then reduced, alquilated and digested with tripsin and submitted to spectrometry analysis (ESI-QTOF and PMF) in order to identify tryptic peptides of VEGF and the ones that presented a higher level of purity in the electrophoresis, were analyzed by amino-terminal sequencing to elucidate its primary structure. In these studies were identified an FGF and two isoforms of VEGFs. The chromatography on ion-exchange column (HiTrap QXL column) was the most effective in purifying the compounds of fractions 23, 24 and 25. The six subfractions obtained, after confirmation of the presence of VEGF by the ELISA, electrophoresis and mass spectrometry, were analyzed by another ELISA with anticrotalic serum and the VEGF was recognized with high affinity by the serum, indicating that the molecule is immunogenic. Subsequently, another ELISA was performed with a FGF-antibody to confirm the presence of FGF in the samples. However, the antibody was not able to recognize it in the concentrations used of the fractions. The VEGF found in all six subfractions was denominated as CdcVEGF and submitted to functional analysis. In the in vitro angiogenesis assay, which analyzes the induction of tube formation in Matrigel® by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells, all 6 subfractions induced angiogenesis, confirming that they maintained their activities after the fractionations. Among those, the subfraction 24-QXL3 showed a more potent response, demonstrating a tube formation even more significant than the positive control (bFGF). In the in vitro assay for the migration of human peripheral blood mononuclear cells (chemotaxis technique in boyden chamber), the CdcVEGFs did not significantly alter cell migration at the concentrations tested. The data obtained in this study amplify the knowledge about the composition of C.d.c venom and the development of a new isolation protocol for VEGF, possibiliting its characterization. Additionally, it was possible to identify a new FGF, which had not yet been identified in C.d.c venom.

Células dendríticas (DCs) participam tanto da geração da resposta imune adaptativa como na manutenção da tolerância. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, sua principal toxina, crotoxina (CTX) e sua subunidade CB (fosfolipase A2), apresentam efeito supressor sobre o sistema imunológico. Neste trabalho foi avaliado o efeito da CTX e CB sobre a ativação/função das DCs e consequente indução de resposta adaptativa específica anti-Ovalbumina (OVA). Primeiramente, foi verificada a eficiência do processo de maturação das DCs incubadas com OVA associada ao LPS. Os resultados obtidos nesse modelo in vitro mostraram que a CTX e CB inibiram a maturação das DCs estimuladas com OVA + LPS, caracterizada por menor expressão de moléculas coestimuladoras, MHC-II e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Em contraste, a CTX e CB induziram maior expressão de ICOS-L, PDL1/2 nas DCs incubadas com OVA + LPS assim como a expressão de RNAm para IL-10 e TGF-β. Além disso, ambas as toxinas foram capazes de aumentar a expressão de PDL1, mas não de ICOS-L ou PDL-2 em DCs. Com relação ao mecanismo envolvido no efeito da CTX e CB sobre as DCs, os resultados mostraram o envolvimento dos receptores peptídeo-formil (FPRs) e a via da 5-Lipoxigenase nesse processo. Sobre a imunidade adaptativa, os resultados mostraram menor proliferação de células TCD3+ ou TCD4+ obtidas de animais imunizados com OVA quando co-cultivadas com DCs incubadas com ConA ou OVA + LPS na presença de CTX ou CB. A diferenciação de células Th1 e Th2 foi inibida pela adição de CTX ou CB nas co-culturas com DCs estimuladas com LPS. No entanto, verificou-se aumento da população Treg nas co-culturas de células CD4+ e DCs incubadas com LPS + CTX ou CB em comparação com DCs estimuladas somente com LPS. A CTX e CB inibiram a diferenciação de células CD4+ Tbet+ e CD4+Gata3+ nas co-culturas de TCD4+ purificados de animais DO 11.10 com DCs estimuladas com OVA + LPS. No entanto, apenas a CTX foi capaz de induzir aumento da porcentagem de células CD4+CD25+FoxP3+. Em experimentos in vivo, foi observada menor proliferação e secreção de IL-2 e IFN nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA que receberam CTX ou CB quando estimuladas com OVA em comparação com o observado nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA. CTX e CB administradas in vivo em camundongos imunizados com OVA também inibiram a porcentagem de células CD4+IFN+, CD4+IL-4+ e promoveram aumento da população CD4+IL-10+ em comparação com o obtido em camundongos imunizados somente com a OVA. Em relação à imunidade humoral, a produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-OVA também foi inibida em camundongos imunizados com OVA que receberam a CTX ou CB. Além disso, a reação de hipersensibilidade do tipo tardio foi suprimida somente em camundongos imunizados com OVA e que receberam a CTX. Estes dados demonstram que a CTX e CB exercem efeito regulador sobre o sistema imune inato e adaptativo e os FPRs bem como a via da 5-lipoxigenase estão envolvidos nessa ação imunomoduladora. / Dendritic cells (DCs) are involved in both the generation of the adaptive immune response and maintenance of the tolerance. The Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, its main toxin, crotoxin (CTX) and CB (phospholipase A2) subunit have suppressive effect on the immune system. In this work it was analyzed the effect of CTX and its CB subunit on the activation/function of DCs and consequent induction of anti-ovalbumin immune response. Firstly, the efficiency of the DCs maturation incubated with OVA associated with LPS was verified. Following, the results obtained in this in vitro model showed that CTX and CB inhibited the maturation of DCs stimulated with OVA + LPS, characterized by lower expression of costimulatory, MHC-II molecules on DCs as well as secretion of proinflammatory cytokines. In contrast, CTX and CB induced an enhancement of ICOS-L, PDL1/2 expression on DCs incubated with OVA, +LPS as well as the expression of IL-10 and TGF-ß RNAm. In addition, both toxins were able to increase the expression of PDL1, but not ICOS-L or PDL-2, on DCs. Regarding the mechanism involved in the effect of CTX and CB on DCs, the results showed the involvement of the formyl-peptide receptors (FPRs) and the 5-Lipoxygenase pathway in this process. On adaptive immunity, the results showed lower proliferation of TCD3+ or TCD4+ cells obtained from mice immunized with OVA when co-cultured with DCs incubated with ConA or OVA + LPS in the presence of CTX or CB. The differentiation of Th1 and Th2 cells were inhibited by the addition of CTX or CB in co-cultures with DCs stimulated with LPS. However, it was verified increased Treg population in co-culture of CD4+cells and DCs incubated with LPS plus CTX or CB compared with DCs LPS-stimulated. CTX and CB inhibited the differentiation of of CD4+Tbet+ and CD4+Gata 3+ cells in co-cultures of TCD4+ purified from DO11.10 mice with DCs stimulated with OVA + LPS. However, only CTX was able to increase the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ cells. In in vivo experiments, it was observed lower proliferation and IL-2 and IFN secretions in cell cultures of mice immunized with OVA that received CTX or CB incubated with OVA compared with those observed in cell culture of OVA-immunized mice. The administration of CTX and CB in vivo in mice immunized with OVA also inhibited the percentage of CD4+IFN+, CD4+IL-4+ cells and increased the CD4+IL-10+ population compared with those observed in mice immunized with OVA. In relation to the humoral immunity, the production of anti-OVA IgG1 and IgG2a antibodies was also inhibited in mice immunized with OVA that received CTX or CB. In addition, the delayed hypersensitivity reaction (DTH) was also diminished in mice immunized with OVA that received the CTX. These data demonstrate that CTX and CB exert regulatory effect on innate and adaptive immune system and that FPRs as well as the 5-lipoxygenase pathway are involved in this immunomodulatory activity.

Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T09:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cotrim_CamilaAparecida_M.pdf: 24882799 bytes, checksum: f5ac35590f5619d941a17e8aa3f11bb4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nas últimas décadas, o uso de compostos naturais como flavonóides e sapogeninas tem sido largamente difundidos na indústria farmacêutica devido suas atividades antiinflamatórias, prevenção de câncer e de doenças cardiovasculares. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da quercetina (flavonóide) e hecogenina (sapogenina), sobre as atividades catalítica e farmacológicas de uma isoforma de fosfolipase A2 secretória (sPLA2) de Crotalus durissus terrificus em duas situações: pré-incubado e co-incubado. Na préincubação, a sPLA2 pura foi incubada com os compostos e os resultados indicam modificações estruturais na estrutura secundária como evidenciada pelas análise de dicroísmo circular. Os dois compostos foram capazes de diminuir a atividade enzimática, porém, somente a quercetina foi capaz de diminuir a mionecrose. Nenhum dos compostos apresentou efeito sobre a formação de edema. Na co-incubação, três concentrações diferentes dos compostos foram misturados com sPLA2 e imediatamente testados. A coincubação mostrou uma menor ação sobre atividade catalítica quando comparado com a préincubação, sugerindo a importância da incubação dos compostos com a proteína. Entretanto, a co-incubação mostrou melhor efeito sobre as atividades farmacológicas (edema e miotoxidade). Os resultados obtidos sugerem a existência de dois sítios farmacológicos distintos, um relacionado com sítio enzimático e outro distinto dessa atividade. Além disso, estudos de docking realizados entre a sPLA2 e a quercetina mostraram a existência de ligações de hidrogênio, interações polares e hidrofóbicas, sugerindo que outros flavonóides com estruturas similares podem se ligar à sPLA2. Além de avaliar o efeito da quercetina sobre a sPLA2 de Crotalus durissus terrificus foi avaliado o efeito sobre uma sPLA2 cataliticamente inativa (Lys49-sPLA2) de Bothrops pirajai. O resultado de dicroísmo circular não apresentou modificações em nível de estrutura secundária, entretanto, estudo de estabilidade mostrou que a quercetina leva a uma maior estabilidade térmica da estrutura proteica frente a altas temperaturas, tornando o processo de desnaturação reversível. Apesar da ausência de atividade catalítica, Lys49-sPLA2 apresentou formação de edema, miotoxidade e uma baixa agregação plaquetária. Entretanto, nenhuma das atividades farmacológicas foi inibida significativamente pela quercetina. Os resultados apresentados mostram que o uso de compostos fenólicos são uma boa iniciativa para estudar e melhor entender as ações de sPLA2 purificadas do veneno de serpente. / Abstract: In the last decades, the use of natural compounds, such as flavonoids and sapogenins has been applied to various pharmaceutical industries due their anti-inflammatory, câncer preventive and cardiovascular protective activities. In this study was evaluated the effect of quercetin (flavonoid) and hecogenin (sapogenin) on the catalytic and pharmacological activity of a secretoy phospholipase A2 from Crotalus durissus terrificus in two different situations: pre-incubated and co-incubated. In the pre-incubation situation, native sPLA2 was incubated with the compounds and the results have shown structural modifications in secondary structure as evidenced through circular dicroism. Both compounds were able to decrease catalytic activity, however, just quercetin was able to decrease myonecrosis. None of the compounds have shown effects on the oedema formation. In the co-incubation, three different concentrations of both compounds were mixed with sPLA2 and immediately tested. Co-incubation has shown lesser effect on catalytic activity than pre-incubation, suggesting an important role of incubation process. Nevertheless, co-incubation presented better effects in pharmacological activities (oedema and myotoxic). These results suggest the existence of two pharmacological sites in the protein, one that is correlated with the enzymatic site and another that is distinct from it. In addition, molecular docking studies between sPLA2 and quercetin showed the existence of hydrogen-bonded, polar interactions and hydrophobic interactions, suggesting that other flavonoids with similar structures could bind to sPLA2. Besides to evaluate the effect of quercetin on a Crotalus durissus terrificus sPLA2, was also evaluated the effect of this compound on a sPLA2 inactive catalytically (Lys49-sPLA2) from Bothrops pirajai. Dicroism circular results did not show modifications in secondary structure, however, thermal stability study have shown that quercetin is able to increase the stability of sPLA2 in high temperatures, in addition to become the denaturation a reversive process. Despite of the lack of catalytic activity, Lys49-sPLA2 has shown oedema formation, myotoxic and a low platelet aggregation. Although none of pharmacological activities was significantly abolish by quercetin. The results have shown that the use of phenolics compounds are a good point to study and better understand the actions of sPLA2 purified from venom snake. / Mestrado / Bioquimica / Mestre Biologia Funcional e Molecular

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As serpentes do gÃnero Crotalus estÃo representadas no Brasil por apenas uma espÃcie, a Crotalus durissus, o envenenamento pela sub-espÃcie Crotalus durissus cascavella conduz à alteraÃÃo sistÃmica, sendo responsÃvel pela causa preliminar de morte apÃs o acidente ofÃdico. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos farmacolÃgicos do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella â Ce (Cdcasca). Neste trabalho estudou-se as aÃÃes do Cdcasca no sistema vascular, avaliando os parÃmetros fisiolÃgicos da pressÃo arterial e analisando as alteraÃÃes histolÃgicas no coraÃÃo, pulmÃo, rim, cÃrebro e fÃgado retirados apÃs os experimentos de pressÃo arterial. A atividade citotÃxica do Cdcasca foi avaliada em quatro linhas humanas de cÃlulas tumorais: leucemia, tumor de mama, tumor de cÃlon e tumor do sistema nervoso. Realizou-se uma investigaÃÃo do provÃvel mecanismo de aÃÃo do Cdcasca utilizando-se as metodologias de viabilidade celular por exclusÃo de Azul de Tripan, inibiÃÃo na sÃntese de DNA, atividade antiproliferativa de cÃlulas mononucleares (Alamar Blue). A integridade da membrana celular, fragmentaÃÃo do DNA e a alteraÃÃo do potencial transmembrÃnico mitocondrial foram analisados por citometria de fluxo. Investigou-se a aÃÃo do PeptÃdeo NatriurÃtico (NPcasca) isolado do veneno da Cdcasca nos sistemas de pressÃo arterial, anel de aorta e perfusÃo renal. ApÃs a perfusÃo renal, os rins foram submetidos à anÃlise histolÃgica e ao estudo da biologia molecular. Todos os parÃmetros estudados foram analisados pelo ANOVA e Student t-test, com p<0,05. Observou-se que o Cdcasca no sistema vascular causou uma diminuiÃÃo significativa nas freqÃÃncias cardÃaca e respiratÃria, bem como na pressÃo arterial mÃdia, havendo um aumento na produÃÃo de Ãxido nÃtrico no sangue dos animais tratados. Realizou-se o bloqueio farmacolÃgico com L-Name e os efeitos nas freqÃÃncias cardÃaca e respiratÃria e na pressÃo arterial mÃdia foram abolidos. O veneno bruto Cdcasca nÃo apresentou efeitos no leito vascular arteriolar mesentÃrico. O veneno bruto da Cdcasca foi fortemente citotÃxico na linhagem tumoral de leucemia, onde ocorreu uma diminuiÃÃo na viabilidade celular, bem como um aumento na fragmentaÃÃo do DNA. O NPcasca diminuiu as freqÃÃncias cardÃaca e respiratÃria e pressÃo arterial mÃdia. Ocorreu um aumento na produÃÃo de nitrito no sangue dos animais tratados. Nos experimentos de anel de aorta onde utilizou-se o NPcasca, observou-se um relaxamento dependente de endotÃlio. O NPcasca promoveu aumento significativo na pressÃo de e na resistÃncia vascular renal. O fluxo urinÃrio e o ritmo de filtraÃÃo glomerular tambÃm aumentaram significativamente. As alteraÃÃes histolÃgicas dos rins perfundidos foram discretas, comparando-as com as alteraÃÃes observadas com o veneno total. Nos experimentos com rim isolado nÃo houve alteraÃÃo de expressÃo gÃnica de mediadores inflamatÃrios. AtravÃs destes resultados concluÃmos que algum componente do veneno Cdcasca seja responsÃvel pelo efeito hipotensor e citotoxicidade em cÃlulas tumorais. O NPcasca apresentou um efeito hipotensor e aumentou a diurese e natriurese. NÃo houve alteraÃÃo de expressÃo gÃnica de mediadores inflamatÃrios no tecido renal / The snakes from the genus Crotalus in Brazil are represented by only one specie, Crotalus durissus. The poisoning by a sub-specie Crotalus durissus cascavella leads to systemic alterations, and is responsible for preliminary cause of death after the ophidic accident. This study aimed to evaluate the pharmacological effects of the snake venom Crotalus durissus cascavella - Ce (Cdcasca). This work looked at the actions of Cdcasca on the vascular system, assessing the physiological parameters of blood pressure and analyzing the histological changes in the heart, kidney, lung, brain and liver removed after the trials of blood pressure. The cytotoxic activity of Cdcasca was examined in four lines of human tumor cells: leukemia, breast tumor, colon tumor and nervous system tumor. There was an investigation of the likely mechanism of action of Cdcasca using the methods of viability cell by the exclusion of Trypan Blue, inhibition in the synthesis of ADN, antiproliferative activity of mononuclear cells (Alamar Blue). The integrity of the cell membrane, the ADN fragmentation and alteration of the mitochondrial transmembranic potential were analyzed by flow cytometry. It was Investigated the action of a Natriuretic Peptide (NPcasca) isolated from the venom of Cdcasca on a blood pressure system, on aortic rings assay and renal perfusion. After renal perfusion, the kidneys were subjected to histological analysis and study of its molecular biology. All parameters studied were analyzed by ANOVA and Student t-test, p <0.05. It was observed that the Cdcasca on the vascular system caused a significant decrease in heart and respiratory rates, and in the mean arterial pressure, with an increase in the production of nitric oxide in the blood of treated animals. There was made a pharmacological blockade with L-Name and the effects on heart and respiratory rates and mean arterial pressure were abolished. The total venom Cdcasca did not produced effects on the arteriolar mesenteric vascular bed. The whole venom Cdcasca was strongly cytotoxic on tumor line for leukemia, where there was a decrease in cell viability, as well as an increase in fragmentation of ADN. The NPcasca produced a decreased in heart and respiratory rates, and in the mean arterial pressure, with an increase in the production of nitric oxide in the blood of treated animals. In the experiments using NPcasca on aortic rings, there was a vasorelaxation dependent on endothelium. The NPcasca promoted a significant increase in perfusion pressure, and in renal vascular resistance. The urinary flow and the glomerular filtration rate also increased significantly. The perfused kidneys histological alterations were discrete, compared to the changes observed by the total venom Cdcasca. In experiments with isolated kidneys there was no change in gene expression of inflammatory mediators. Through these results we conclude that any component of poison Cdcasca is responsible for lowering effect and cytotoxicity in tumor cells. The NPcasca presented a hypotensive effects and increased the diuresis and natriurese. There was no change in gene expression of inflammatory mediators in kidney tissue