Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_M.pdf: 764391 bytes, checksum: 2ea9b8ea9a806b452272ef5f3e45ba17 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividades / Abstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activities / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DizFilho_EduardoBrittodosSantos_M.pdf: 1713352 bytes, checksum: 603465fac59506eae00eb719cec694e7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Na região norte do Brasil a serpente Crotalus durissus ruruima (C.d.r) é responsável por diversos casos de acidentes ofídicos, e é principalmente encontrada próxima à fronteira com a Venezuela e Colômbia. Contudo a Crotalus durissus cumanensis (C.d.c). é outra serpente bastante comum no sul da Venezuela próximo a fronteira com o Brasil. Ambas as serpentes são encontradas na região equatorial da América do Sul e ambos os venenos mostraram diferenças significativas em suas composições, se comparadas com a Crotalus durissus terrificus (C.d.t.). A crotoxina é a principal toxina, e responsável pelos principais efeitos toxicológicos do veneno de C.d.t. O objetivo principal desta dissertação foi o de isolar e caracterizar isoformas de PLA2s isoladas de ambos os venenos e caracterizar farmacológica e bioquimicamente estas PLA2s e outras toxinas. A análise comparativa do veneno total de C.d.r. mostrou uma presença sutil de convulxina e giroxina, enquanto a análise da C.d.c. revelou ausência de convulxina no veneno. Alem disso, ambos demonstraram significativas diferenças para a atividade de PLA2. A análise de cada crotoxina isolada de C.d.r. ou de C.d.c. também revelou significante variação em comparação com a C.d.t. Neste trabalho nos isolamos duas novas isoformas de PLA2 de C.d.r. e C.d.c.. Ambas as proteínas foram caracterizadas como básicas e ambas demonstram massa molecular de aproximadamente 14 kDa. Em dicroísmo circular ambas as proteínas demonstraram a presença de alta quantidade de alfa hélice, contudo foi encontrada uma pequena diferença para a quantidade de folha Seta e cadeias randômicas. Estes resultados sugerem que a diferença estrutural entre estas proteínas, corrobora com os resultados da análise de seqüência N-terminal e a análise filogenética. Além das diferenças bioquímicas encontradas para os dois venenos, para a crotoxina, PLA2 e crotapotina, nos observamos que o veneno e a crotoxina isolada da C.d.c. exibiram alta atividade neurotóxica em preparação de músculo nervo frênico diafragma de camundongo, enquanto o veneno e a crotoxina de C.d.r. não. bogo nos concluímos que ambos .os venenos mostraram diferenças em suas propriedades bioquímicas e farmacológícas, entre os dois venenos e estes em comparação com a C. d. terrificus e C. d. collilineatus. Ambas as isoformas de PLA2 demonstraram algumas similaridades estruturais em alguns aspectos, mas nqs observamos algumas poucas diferenças que provavelmente estão associadas com as diferenças farmacológicas e enzimáticas encontradas entre as isoformas de PLA2 isoladas de C.d.r. e C.d.c / Abstract: In the north region of Brazil the Crotalus durissus ruruima (C.d.r.) is responsible for several snake bit cases and mainly found in the region near the Venezuela and Colombia. Although the Crotalus durissus cumanensis (C.d.e.) is other wide spread rattlesnake in south Venezuela frontier. Both snakes are only found in the equatorial region of South America and both venoms showed significative difference in the composition if compared to Crotalus durissus terrifieus (C.d.t). 'The crotoxin is the principal toxin and responsible for the main toxicology effect of the Crotalus durissus terrifieus venom. The main focus of the thesis was isolation and characterization of the PLA2 isoforms isolated from the both venom and characterized the pharmacological and biochemical characterization PLA2 and other toxins. The comparative analysis of whole venom of C.d.r. showed the marginal presence of convulxin and gyroxin while the analysis of the C.d.c. the convulxin was absent in the venom. Beyond this, both also showed significative differences for the PLA2 activity. The analysis of the each crotoxin isolated from the C.d.r. or C.d.c. also showed significant variation in comparison with C.d.t. In this work we isolated two new isoforms of PLA2 from the C.d.r. and C.d.c. Both proteins were characterized as basic protein and both showed a molecular mass around 14 kDa. In the circular dichroism, both proteins showed the presence of high content of alpha helix although they found slights differences for the beta sheets or random coil.These results suggest the structural difference of both proteins that were corroborated by the N-terminal sequence analysis and by phylogenetic analysis. Beside the biochemical differences found for both venom, crotoxins, PLA2 and erotapotins, we observed the venom and Crotoxins isolated from the C.d.e. exhibited higher neurotoxic activity on the phrenic nerve diaphragm preparation while the venom and crotoxin isolated from the C.d.r. was not. )"hus we conclude that both venoms showed differences at biochemical and pharmacological properties between both venom and these in comparison with C.d. terrifieus or C.d. collilineatus. Both PLA2 isoforms showed some similar structural aspects but we observed some slight different that probably were associated with the pharmacological and enzimatical differences found for both PLA2 isolated from the C.d. e. and C.d.r / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Crotalus durissus collilineatus is a snake usually found in semideciduous forest, the Cerrado region and its bites constitutes an important health problem. The most serious systemic change and primary cause of death is acute renal failure although the mecanisms of the damaging effects are not totally understood. We investigated the biological effects promoted by Crotalus durissus collilineatus crude venom and its fractions crotoxin and phopholipase A2. The toxic effects of C d collilineatus crude venom were evaluated by the histopathological analysis of organs such as heart, kidney, brain, lung and liver. Wistar rats were inoculated intraperitoneally with C d collilineatus crude venom. The liver showed steatosis and microvacuolation.The other organs showed normal morphological aspects. Renal effects were evaluated by the isolated perfused rat kidney method.The crude venom used at the lowest dose (10Âg) increased perfusion pressure (PP), urinary flow (UF), and glomerular filtration rate (GFR), with maximal effect at 120min (PP: control(120) 110.3+/-3.69; venom(120) 126.8+/-10.2; UF: control(120) 0.19+/-0.03; venom(120) 0.23+/-0.06; GFR: control(120) 0.79+/-0.07; venom(120) 1.17+/-0.4). There was no effect on the percent of sodium tubular transport (%TNa+), the percent of potassium tubular transport (%TK+) and the percent of chloride tubular transport (%TCl-) The highest dose of the crude venom (30Âg) caused a significantly decrease in PP (control(120) 110.3Â3.69; venom(120) 96.7Â8.1), RVR (control(120) 6.42Â0.78; venom(120)4.8Â0.56), UF (control(120) 0.19Â0.03; venom(120) 0.12Â0.01) and GFR (control(120) 0.79Â0.07; venom(120)0.53Â0.09). There was not effect on the percent of electrolytes tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-). Crotoxin (10mcg) produced a decrease in GFR (control(120) 0.79Â0.07; crotoxin(120) 0.31Â0.10), while PP, RVR and UF remained stable. Crotoxin also reduced %TK+ (control(120) 69.94Â6.49; crotoxin(120) 33.28Â4.78) and %TCl- (control(120) 79.53Â2.67; crotoxin (120) 64.62Â6.93) with maximal effect at 120min. Kidney perfused with phospholipase A2 (PLA2) showed a decrease in GFR (control(120) 0.79Â0.07; PLA2 (120) 0.52Â0.07) at 120min, whereas PP, RVR, UF and %TNa+ remained stable. PLA2 also reduced %TK+ (control(120) 69.94Â6.49; PLA2 (120) 56.26Â6.81) and %TCl- (control(60) 82.25Â2.72; PLA2 (60) 75.04Â4.26) at 60min. These results altogether indicate that Crotalus durissus collilineatus venom caused significative alterations in the renal parameters as well as hepatic damage. / A serpente Crotalus durissus collilineatus à encontrada na regiÃo do Cerrado e o acidente causado por esta espÃcie constitui um problema de saÃde pÃblica. A insuficiÃncia renal aguda à a alteraÃÃo sistÃmica mais sÃria, apesar dos seus mecanismos nÃo serem completamente esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos biolÃgicos produzidos pelo veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus e pelas fraÃÃes crotoxina e fosfolipase A2. Foi realizado o estudo da toxicidade aguda do veneno bruto de C d collilineatus, atravÃs da anÃlise histolÃgica de coraÃÃo, cÃrebro, rins, pulmÃes e fÃgado de ratos tratados com doses crescente do veneno. Nesse estudo foi observada a presenÃa de alteraÃÃes hepÃticas como microvacualizaÃÃo e esteatose, enquanto os demais ÃrgÃos apresentaram aspectos normais. Os efeitos renais foram avaliados atravÃs do mÃtodo de perfusÃo de rim isolado de rato. O veneno bruto, usado na dose de 10Âg, causou um aumento na pressÃo de perfusÃo (PP), no fluxo urinÃrio (FU) e no ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG), com efeito mÃximo aos 120min (PP: controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 126,8+/-10,2;FU: controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,23+/-0,06; RFG: controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 1,17+/-0,4). Essa dose nÃo produziu alteraÃÃes no transporte tubular de sÃdio (%TNa+), potÃssio (%TK+) e de cloreto (%TCl-). A dose mais elevada de veneno bruto (30Âg) causou um decrÃscimo significativo, com efeito mÃximo, aos 120min, na PP(controle(120) 110,3+/-3,69; veneno(120) 96,7+/-8,1), na RVR (controle(120) 6,42+/-0,78; veneno(120) 4,8+/-0,56), no FU (controle(120) 0,19+/-0,03; veneno(120) 0,12+/-0,01) e no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; veneno(120) 0,53+/-0,09). NÃo ocorreram alteraÃÃes no transporte tubular de eletrÃlitos. A fraÃÃo crotoxina nÃo produziu alteraÃÃes no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; crotoxina(120) 0,31+/-0,10). Esta fraÃÃo tambÃm reduziu os %TK+ (controle(120) 69,94+/-6,49; crotoxina(120) 33,28+/-4,78) e %TCl- (controle(120) 79,53+/-2,67, crotoxina(120) 64,62+/-6,93). O grupo perfundido com FLA2 apresentou um decrÃscimo no RFG (controle(120) 0,79+/-0,07; FLA2 (120) 0,52+/-0,07), enquanto a PP, a RVR, o FU e o %TNa+ permaneceram estÃveis. Foram observadas reduÃÃes no %TK+ aos 120min (controle(120) 69,94+/-6,49; FLA2(120) 56,26+/-6,81) e aos 60min, no %TCl- (controle(60) 82,25+/-2,72; FLA2(60) 75,04+/-4,26). Foi observada degeneraÃÃo hidrÃpico vacuolar e a presenÃa de material proteinÃceo nos tÃbulos renais, na anÃlise histolÃgica dos rins perfundidos tanto com veneno bruto quanto com as fraÃÃes. Estes resultados indicam que o veneno de Crotalus durissus collilineatus causou alteraÃÃes significativas nos parÃmetros renais e nos aspectos morfolÃgicos hepÃticos.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Ophidian accidents involving species of the genus Crotalus, are usually serious and frequently fatal due to the frequency of acute renal failure. Unfortunately, there have been few studies of the toxinologic effects of Crotalus durissus cumanensis venom. The renal effects of the venom used in this study were observed by perfusion of isolated kidneys. Infusion of C. d. cumanensis venom (10 Âg/mL) produced an increase in perfusion pressure (PP) and renal vascular resistance (RVR). Urinary flow (UF) and glomerular filtration rate (GFR) were reduced. The venom was able to decrease the percentage of sodium tubular transport (%TNa+) and the percentage of chloride tubular transport (%TCl-). In kidneys perfused with (10 Âg/mL) crotoxin, there were no significant changes in PP or RVR. The GFR decreased, while the UF increased. In contrast with whole venom, crotoxin reduced %TNa+, %TK and %TCl-. Analysis of the cytotoxic effects of Crotalus durissus cumanensis venom and crotoxin on renal tubular MDCK cells was performed by the MTT method. The venom promoted a concentration-dependent cytotoxic effect with an IC50 value of 5.38 Âg/mL. In aortic rings precontracted by phenylephrine (Phe; 0.1 mM) with intact endothelium, C. d. cumanensis venom (0.1â30.0 Âg/mL) resulted in an increased maximal contraction up to 130.0  6.6% at a concentration of 30.0 Âg/mL. In contrast, in endothelium denuded rings, vasocontraction was reduced in a concentration-dependent manner to 66.7  4.9% (50.0 Âg/mL). The effect was similar in the case of potassium-induced contraction (K+; 40 mM), in which there was a significant increase in the contraction of endothelium intact rings up to 115.6  4.9% (30.0 Âg/Ml) and a vasorelaxant effect (70.9  4.7%) at a dose of 50.0 Âg/mL after removal of the endothelium. In conclusion, C. d. cumanensis venom and crotoxin cause toxicity in isolated kidneys, however, only the whole venom has a cytotoxic effect on renal tubular cells. In aortic ring assays, whole venom causes endothelium dependent vasoconstriction. It is suggested that the toxic effects produced by the venom of Crotalus durissus cumanensis in kidney and isolated aorta, probably due to the participation of other fractions or a synergism of the components that make up the total venom / Os acidentes ofÃdicos envolvendo o gÃnero Crotalus, sÃo graves e frequentemente fatais devido à freqÃÃncia que evolui para a falÃncia renal aguda. Considerando a insuficiÃncia de esclarecimentos dos efeitos toxinolÃgicos do veneno da Crotalus. durissus cumanensis teve-se a necessidade de conduzir um estudo dos efeitos renais e vasculares ocasionados pelo veneno total e fraÃÃo crotoxina. Os efeitos renais foram avaliados atravÃs da perfusÃo de rim isolado. A infusÃo do veneno na concentraÃÃo de 10Âg/mL produziu um aumento na pressÃo de perfusÃo (PP), na resistÃncia vascular renal (RVR) e uma diminuiÃÃo do ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) e no fluxo urinÃrio (FU). O veneno foi causou ainda reduÃÃo nos transportes tubulares de sÃdio (%TNa+) e cloreto (%TCl-). No grupo perfundido com crotoxina (10Âg/mL), nÃo foi observada alteraÃÃes significativas na PP e RVR. PorÃm, o RFG foi diminuÃdo enquanto que o FU aumentou. A crotoxina reduziu ainda os transportes tubulares de sÃdio, potÃssio e cloreto. Na avaliaÃÃo da citotoxicidade em cÃlulas tubulares renais MDCK pelo mÃtodo MTT, o veneno total da C. d. cumanensis causou um efeito citotÃxico direto dependente da concentraÃÃo com um valor de CI50 de 5,38Âg/mL. O presente estudo avaliou os efeitos vasculares do veneno total e crotoxina em ensaios com aorta isolada. Em anÃis de aorta prÃ-contraÃdas com fenilefrina (Phe 0,1 M) com endotÃlio intacto, o veneno da C. d. cumanensis (0,1 â 30,0Âg/mL) produziu um aumento mÃximo da contraÃÃo para 130,0  6,6% na concentraÃÃo de 30,0Âg/mL. Em contraste, em anÃis ausentes de endotÃlio, a vasoconstriÃÃo foi reduzida para 66,7  6,6% (50,0 Âg/mL). Efeito similar observados nas preparaÃÃes prÃ-contraÃdas com potÃssio (K+ 40mM), em que ocorreu um aumento das contraÃÃes em anÃis com endotÃlio intacto para 115,6  4,9% (30,0Âg/mL) e um efeito vasorelaxante (70,9  4,9%) na concentraÃÃo de 50,0Âg/mL, apÃs a remoÃÃo do endotÃlio. Nos ensaios com anÃis prà contraÃdos com fenilefrina e potÃssio a adiÃÃo cumulativa de crotoxina (0,1 â 30,0Âg/mL) nÃo modificou a contratilidade aÃrtica. Em conclusÃo, o veneno total e a fraÃÃo crotoxina causam toxicidade em rins isolados, entretanto, somente o veneno total possui um efeito citotÃxico direto nas cÃlulas tubulares renais. Em anÃis de aorta o veneno total produz um efeito vasoconstritor dependente da integridade do endotÃlio. Sugere-se que os efeitos tÃxicos produzidos pelo veneno da Crotalus durissus cumanensis em rim e aorta isolada, provavelmente deve-se a participaÃÃo de outras fraÃÃes ou a um sinergismo dos componentes que compÃe o veneno total.

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 Ω) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 Ω) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:30:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_VeronicaCristinaGomes_D.pdf: 49857534 bytes, checksum: b3727eb6c966531052574dc180e90fd1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Mesmo após décadas do descobrimento dos anti-inflamatórios inibidores de fosfolipase continua a busca por novas moléculas que sejam capazes de apresentar esse efeito terapêutico sem a indução de efeitos colaterais. O objetivo deste estudo foi obter extrato polar de partes aéreas de Tithonia diversifolia, viabilizando um padrão de qualidade para esse extrato a partir da identificação de seus principais constituintes e após essa determinação, avaliar o seu efeito sobre a atividade de frações de fosfolipase A2 básicas secretórias (sPLA2) obtidas de Bothrops jararacussu (Bj) e Crotalus durissus ssp (Cd). Os extratos foram obtidos por infusão e decocção e após a identificação dos constituintes por cromatografia e LC/MS-MS, determinou-se que o extrato de melhor rendimento foi obtido por decocção e que seus principais constituintes são derivados do ácido cinâmico: cafeoil-glicosídico, tagitinina C e ácido quínico. A técnica de molecular imprint (MP) permitiu uma separação dos constituintes sendo uma metodologia prática. O extrato polar apresentou atividade anti-agregante plaquetária na concentração de 0,6 a 20µg/mL, frente ao estímulo de indução por trombina, o que representa que o chá não é tão inerte e que pode promover complicações em indivíduos com distúrbios de coagulação. A purificação de Bj e Cd foi realizada por técnicas cromatográficas, com rendimento de aproximadamente 30% (p<0,05) de sPLA2. Ensaio enzimático in vitro, que utilizou substrato cromogênico sintético de PLA2 o 4-nitro-3-octanoiloxi-benzóico (NOBA) identificou que o extrato polar foi capaz de reduzir em 60% (p<0,05) a atividade enzimática de sPLA2 de Bj, independente do tipo de tratamento aplicado. A redução da atividade de sPLA2 de Cd foi reduzida em 30% (p<0,05) quando a mesma foi incubada por 30 min em presença do extrato. As modificações dos efeitos patológicos causados por sPLA2s foram avaliadas por ensaios in vivo. A ação edematogênica de sPLA2 de Bj foi reduzida em 50% (p<0,05), quando esta estava em presença do extrato, independe de prévia incubação, já a mesma ação para sPLA2 de Cd foi reduzida drasticamente pelo extrato, no entanto, após 60 min da administração do agente indutor de inflamação, a capacidade miotóxica com consequente liberação de creatina-quinase (CK) foi modulada pelo extrato de forma distinta dependendo da fonte de sPLA2. Para sPLA2 de Bj o extrato promoveu uma atividade protetora de liberação de CK, pois reduziu a liberação da enzima quando foi aplicado intraperitoneal 30 min antes do agente agressor, no entanto, a sPLA2 de Cd apresentou capacidade reduzida de liberação de CK quando foi incubada com o extrato por 30min antes da aplicação do mesmo no músculo do cobaio. Diante da ação do extrato sobre a inflamação induzida por sPLA2 buscou-se, através de técnica da reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real), determinar a influência do extrato na expressão de genes envolvidos na inflamação. Determinou-se que o gene Nf-Kb, embora responda a presença do extrato, é o que mais tardiamente é ativado (ou expresso), possivelmente por ser nuclear. Através desses ensaios foi possível determinar a ação desses extratos sobre a resposta inflamatória aguda induzida pela ação de sPLA2s de venenos de serpentes / Abstract: Even after decades of the discovery of the anti-inflammatory inhibitors of phospholipase, there is a continuous search for new molecules which are able to provide this therapeutic effect without inducing side effects. The aim of this study was to obtain polar extract of the aerial parts of Tithonia diversifolia, enabling a quality standard for this extract from the identification of its main constituents and after this determination, to evaluate its effect on the activity of fractions A2 phospholipase basic secretory (sPLA2) obtained from Bothrops jararacussu (Bj) and Crotalus durissus ssp (Cd). The extracts were obtained by decoction and infusion and after the identification of the chromatography and LC / MS-MS. It was determined that the best yield of extract was obtained by decoction and its main constituents are cinnamic acid derivatives: caffeoyl - glycosidic, tagitinina C and quinic acid. Molecular imprint technique (MP) enabled separation of the constituents being a practical methodology. The polar extract showed anti-platelet activity at a concentration of 0.6 to 20 ?g/mL, opposite the stimulus induced by thrombin, which indicates that tea is not as inert and may promote complications in patients with coagulation disorders. Purification of Bj and Cd was performed by chromatographic techniques, with a yield of approximately 30% (p<0,05) of sPLA2. In vitro enzyme assay, which used synthetic chromogenic substrate of sPLA2 4-nitro-3-octanoyloxy benzoic acid (NOBA), it was identified that the polar extract was able to reduce by 60% (p<0,05) the enzymatic activity of sPLA2 Bj, regardless of the type of treatment applied, the reduction of the activity of sPLA2 Cd was reduced by 30% (p<0,05) when it was incubated for 30 min in presence of the extract. The modifications of the pathological effects caused by sPLA2s were evaluated by in vivo tests. The edematous action of sPLA2 Bj was reduced by 50% (p<0,05) when it was in presence of the extract, independent of incubation, since the same action for sPLA2 Cd was drastically reduced by the extract, however, after 60 min of administration of the agent inducer of inflammation, the myotoxic capacity with consequent release of creatine - kinase (CK) was modulated by the statement differently depending on the source of sPLA2, sPLA2 Bj to extract promoted a protective activity of CK release, because it reduced the release of enzyme, when applied intraperitoneally, 30 min before the offending agent, however, sPLA2 Cd showed reduced ability to release when CK was incubated with the extract for 30 min before application of the same muscle. Before the action of the extract on the sPLA2 induced inflammation was sought through the technique of polymerase chain reaction in real time (real time PCR), to determine the influence of the extract on the expression of genes involved in inflammation. We determined that Nf - Kb gene was the answer that although the presence of the extract is that the later is activated (or expressed), possibly because it was nuclear. Through these studies it was possible to determine the effect of these extracts on the acute inflammatory response induced by the action of sPLA2s from snake venoms / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

A variação de cunho geográfico nas populações naturais está intimamente ligada às características ecológicas do ambiente como também aos processos históricos que resultaram no estabelecimento de linhagens distintas. Poucas espécies de serpentes têm sido estudadas adequadamente para determinar se existe variação geográfica na morfologia associada ao seu ciclo reprodutivo e dieta. As serpentes do gênero Crotalus são consideradas um bom modelo para estudos relacionados à variação geográfica devido à sua ampla distribuição, que abrange diversos tipos de hábitats. A cascavel C. durissus está restrita a América do Sul. No Brasil ocorre em todos os estados, exceto no Acre e Espírito Santo. São reconhecidas algumas populações isoladas na Floresta Amazônica. Algumas das suas populações exibem um nível considerável de variação morfológica e ecológica, sendo que populações adjacentes podem diferir drasticamente. De um modo geral, são escassos os estudos com esta espécie no Brasil, requerendo urgentes investigações para estabelecer se a variabilidade observada está associada a algum fenômeno específico. Neste estudo, foi examinado um total de 870 exemplares de C. durissus no Brasil. Em termos gerais, de acordo com o dimorfismo sexual, os resultados indicaram que as fêmeas apresentaram um maior número de escamas no ventre, enquanto que os machos apresentaram um número maior de escamas associadas à cauda e de losângulos. Em poucos casos as fêmeas exibiram comprimentos rostro-cloacais maiores, no entanto os maiores tamanhos da cabeça foram evidenciados neste sexo. Por outro lado, na maioria dos casos, os machos foram mais compridos do que as fêmeas, apresentando caudas mais longas. Similarmente as listras paravertebrais foram significativamente maiores nos machos. As análises discriminantes indicaram que as populações apresentaram padrões de variabilidade morfológica altamente complexos, ainda que a segregação de algumas das populações possa refletir fortes tendências evolutivas próprias dentro de algumas linhagens. A análise de variação geográfica indicou que variáveis ambientais influenciaram parcialmente a variabilidade morfológica nas populações de acordo com a sua distribuição. De acordo com os parâmetros relacionados a historia natural, o ciclo reprodutivo das fêmeas foi bem conservador, refletindo um padrão bienal e sazonal. Nos machos o ciclo espermatogênico mostra também um padrão sazonal exibindo variações anuais entre as populações. A associação entre os processos históricos, aspectos fisiológicos e condições climáticas são provavelmente os principais fatores que influenciaram as mudanças nestes padrões reprodutivos em fêmeas e machos. A dieta foi constituída principalmente por roedores, fato possivelmente associado à maior abundância e disponibilidade deste tipo de presa ao longo do ano nas áreas de ocorrência da espécie. No entanto, lagartos do grupo dos teiídeos podem ser considerados como itens alimentares eventualmente importantes na dieta de C. durissus do Brasil. / The geographical variation is intimately associated to the ecological characteristics such as the historical process of a species. A few species of snakes have been studied adequately to determine an existence of geographical variation in morphology, reproduction and diet. Rattlesnakes (Crotalus) are considered a good model for geographical variation studies, due to their wide distribution that include several habitat types. The rattlesnake, Crotalus durissus is restricted to South America. In Brazil, this group is present throughout the country, except in states of Acre and Espírito Santo. In addition, there are isolated populations in open areas in Amazonia, in the Amazonian savannas in the states of Amazonas, Roraima, Pará and Amapá. Some populations of C. durissus show considerable variation in the morphology, reproduction and diet composition even with neighboring populations differing drastically from each other. Generally, there has been little research conducted of C. durissus in Brazil needing urgent investigation to this respect. A total of 870 specimens of C. durissus were examined. In general, according to the sexual dimorphism, the results indicated that the females have a higher number of ventral scales, while the males showed a greater number of scales associated to the tail and the lozanges. In a few cases, the females exhibited larger snout-vent length but larger head sizes were shown in this sex. Overall, males were longer than females, exhibiting tails and paravertebral stripes which were relatively longer. The discriminant analysis showed in general populations with patterns of highly complex morphological variability, even though the segregation of some populations may reflect strong evolutionary tendencies of their own within some groups. The analysis of geographic variation indicated that environmental variables partially influenced the morphological variability in populations according to their distribution. In accordance with parameters related to natural history, the reproductive cycle of females, was extremely conservative, reflecting a biennial seasonal pattern. In males, the spermatogenic cycle also shows a seasonal pattern, which demonstrated annual variations between populations. The association between the historical processes, physiological aspects and climatic conditions is probably the main factors that influenced these reproductive patterns in females and males. The diet was composed mainly of rodents, habit related to the abundance and availability of the prey, however teid lizards can also be considered as an important food item of the diet of C. durissus from Brazil.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 176084 bytes, checksum: ba3ed3d023a44786d6afb86a343a98e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Accidents ofidic cart a relevant medical problem in our country due to the high toxicity and lethality of the poisons. About 8% of the accidents they are related to the gender Crotalus being in second place in the number of accidents and in first in relation to the death index. The study had as objective evaluates and to compare the effectiveness of the therapy of the intoxication for poison crotalic in dogs, with use of antiophidic serum isolated or associated the frozen plasma. The dogs were divided in two groups being: Group VS: animals inoculated with poison crotalic and treaties with antiophidic serum bothropic-crotalic; Group VSP: animals inoculated with poison crotalic, treaties with antiophidic serum and plasma frozen fresh. The animals were submitted the clinical evaluation and laboratorial. It was observed us of the two groups edema in the place of inoculation of the poison and mitigation with more precocious recovery in the animals of the group VSP, presence of reflex pupillary the light, dilated pupils, lameness, flaccid paralysis of the musculature, mandibular ptose, increase of the breathing frequency, decrease in the erythrocyte number, hemoglobin and hematocrit, decrease in the number of lymphocytes, increase in the neutrophil number, leukocytes, sanguine incoagulability and increase in the time of protrombina and partial tromboplastina activated with more precocious recovery in the animals of the group VSP. In conclusion the dose of poison crotalic used in the experimental intoxication of dogs was capable to produce alterations in the clinical parameters, laboratorial and hematological with benefits mainly in the recovery of the mitigation and decrease of the member edema in the animals that received the antiophidic serum associated to the frozen fresh plasma when compared to the animals that received only the antiophidic serum. / Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido às altas toxicidades e letalidades dos venenos. Cerca de 8% dos acidentes estão relacionados ao gênero Crotalus estando em segundo lugar no número de acidentes e em primeiro em relação ao índice de óbito. O estudo teve como objetivo avaliar e comparar a indução da intoxicação experimental e terapia por veneno crotálico em cães, com uso de soro antiofídico isolado ou associado a plasma congelado. Os cães foram divididos em dois grupos sendo: Grupo VS: animais inoculados com veneno crotálico e tratados com soro antiofídico botrópico-crotalico; Grupo VSP: animais inoculados com veneno crotálico, tratados com soro antiofídico e plasma fresco congelado. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e hemograma. Foram observados nos dois grupos, edema no local de inoculação do veneno e sedação com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP, presença de reflexo pupilar a luz, midríase, claudicação, paralisia flácida da musculatura, ptose mandibular, aumento da frequência respiratória, diminuição no número de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, diminuição no número de linfócitos, aumento no número de neutrófilos, leucócitos, incoagulabilidade sanguínea e aumento no tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP. Conclui-se que a dose de veneno crotálico usada na intoxicação experimental de cães foi suficiente de produzir alterações nos parâmetros clínicos, laboratoriais com benefícios principalmente na recuperação da sedação e diminuição do edema de membro nos animais que receberam o soro antiofídico associado ao plasma fresco congelado quando comparado aos que receberam somente o soro antiofídico.