O melanoma cutâneo é a neoplasia de pele de maior mortalidade. A imprevisibilidade de sua evolução é uma de suas características principais, o tratamento do tumor primário é, atualmente, de pouca morbidade e, na doença disseminada, as opções terapêuticas são pouco eficazes. É fundamental a pesquisa de marcadores tumorais que permitam a previsão da evolução, melhor compreensão da patogênese do melanoma e possibilitem a descoberta de alvos moleculares. Nesse contexto, estudos genéticos mostraram a importância da regulação do ciclo celular, especialmente a passagem da fase G1-S. Importantes fatores envolvidos compõem a cascata da proteína Rb (p16, ciclina D1, CDK4 e pRb) e da proteína p53 (p53 e p21). Objetivo: verificar a frequência da expressão de p16, ciclina D1,CDK4, pRb, p53 e p21 em melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco e sua relação com prognóstico. Métodos: Estudo retrospectivo envolvendo 46 pacientes (sendo 67,3% homens, idade média 57,7 ± 15,8 anos) com melanoma cutâneo de cabeça, pescoço e tronco que foram tratados pela mesma equipe com seguimento mínimo de dois anos. Foram estudados fatores clínicos (topografia do tumor primário, tempo de seguimento, ocorrência de metástases e óbito relacionado), histopatológicos (tipo histológico, índice de Clark, índice de Breslow) e análise imuno-histoquímica pela técnica de micro-array para as proteínas reguladoras do ciclo celular p16, ciclina D1, CDK4, pRb, p53 e p21. Resultados: Houve proporção igualitária entre as topografias (23 casos em tronco, 23 em cabeça e pescoço). Treze pacientes com Clark I (29,5%), cinco com II (11,3%), 16 com III (36,5%), 10 com IV (22,7%) e nenhum com Clark V. A média das medidas de Breslow foi 0,96 (DP=1,01). O seguimento médio foi de 77 meses (DP=47). Oito dos 46 pacientes (17,3%) tiveram evolução desfavorável, com seis óbitos relacionados. A idade foi mais elevada no grupo com evolução desfavorável (p=0,04). Houve expressão de p16 em 80%, ciclina D1 em 58,9%, CDK4 em 43,5%, pRb em 58,5%, p53 em 53,6% e p21 em 52,3% dos melanomas. Em análise univariada, a expressão do p21 foi relacionada com evolução desfavorável (p=0,04), o que não foi observado com a expressão dos outros marcadores (p>0,05). Conclusão: A expressão da proteína p21 nos melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco foi relacionada com evolução desfavorável, o que não ocorreu com outros fatores envolvidos na regulação do ciclo celular / Melanoma is the most lethal skin cancer. The outcome of melanoma is not predictable in most cases. Although the treatment for the primary tumor is well tolerated, there are no effective therapeutic options in disseminated disease. Efforts are being made in the search for tumoral markers that may predict outcome, increase the comprehension of melanoma pathogenesis, and may also help the search for molecular targets. In this issue, genetic studies concerning the regulation of cell cycle, including the G1-S checkpoint, are important. The retinoblastoma protein (pRb) pathway (p16, cyclin D1, CDK4 and pRb) and the p53 pathway (p53 and p21) are part of this regulation. Objectives: to verify the expression of p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21 in head, neck and trunk melanomas, and its correlation with prognosis. Method: Retrospective study approved by institution ethics committee. Fourtysix head, neck and trunk melanoma patients (67.3% men, mean age 57.7±15.8) treated by a single surgeon with minimum 2-years follow-up were enrolled. Clinical factors (primary tumor location, follow-up period, metastasis or related deaths), pathologic (histological subtype, Clark and Breslow index) and microarray immunohystochemical analysis of the cell cycle proteins p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21. Results: Location of the primary tumor was equal for head/neck and trunk (50% each). Thirteen patients were classified as Clark I (29.5%), five as Clark II (11.3%), 16 as Clark III (36.5%), 10 as IV (22.7%), none as Clark V. Mean Breslow measure was 0.96±1.01. Mean follow-up was 77±47 months. Eight patients (17.3%) had bad outcome, with six related deaths. Patients with worse outcome had a higher mean age at diagnosis (p=0,04). Expression of p16 was positive in 80%. Cyclin D1 was positive in 58.9%. CDK4 was positive in 43.5%. pRb was positive in 58.5%. p53 was positive in 53.6%. p21 was positive in 52.3%. Univariated analysis showed that p21 expression was related to worse outcome (p=0,04), while the other markers were not (p>0,05). Conclusion: p21 expression in head, neck and trunk melanomas was related to worse outcome. Expression of the other cell cycle regulators proteins was not

Introdução: a disfunção de proteínas que atuam no controle do ciclo celular está diretamente relacionada ao processo inicial de tumorigênese. A expressão de ciclina A em tumores de mama está relacionada à menor sobrevida livre de doença (SLD) e também à menor sobrevida global (SG). Da mesma maneira, a reduzida expressão de p27 em tumores de mama está relacionada à pior prognóstico. Ambas as alteraçõestêm sido relacionadas com tumores de alto grau histológico, maior diâmetro no momento do diagnóstico e expressão de c-erb-B2. Não há dados referentes à resposta clínica destes tumores ao tratamento neoadjuvante. Objetivos: o objetivo deste estudo foi analisar as taxas de positividade de expressão de ciclina A e proteína p27 em tumores de mama localmente avançados, antes e após quimioterapia neoadjuvante com Docetaxel (75 mg/m 2 ) e Epirrubicina (60 mg/m 2 ), a relação delas com resposta ao tratamento, SLD e SG. Metodologia: foram incluídas 92 pacientes tratadas no período entre janeiro de 1998 e dezembro de 2004, com aplicação de pelo menos dois ciclos de quimioterapia neoadjuvante a cada 21 dias e submetidas à cirurgia para tratamento loco-regional. A análise da expressão deciclina A e p27 foi feita por meio de imunohistoquímica, tendo sido considerados positivos os casos com expressão acima de 30 e 50%, respectivamente. Resultados: a mediana do número de ciclos de quimioterapia neoadjuvante foi de três (variando entre 2 e 7) e do tempo de seguimento de 40 meses (11 - 100). Observamos positividade de ciclina A antes da quimioterapia em 27 pacientes (29,3%) e de p27 em 42 pacientes (45,7%). Após a quimioterapia, a positividade para ciclina A foi de16,3% (15 pacientes) e de p27 de 29,3% (27 pacientes). A expressão de p27 nãofoi preditiva de resposta clínica ou patológica, SLD e SG. As taxas de resposta clínica foram iguais nas pacientes com e sem expressão de ciclina A antes daquimioterapia e a resposta patológica também foi semelhante. A manutenção de expressão de ciclina A após a quimioterapia esteve associada à menor resposta clínica completa (6,7 x 27,3%, p = 0,04), mas não à resposta patológica. Também esteve relacionada à menor SLD (p = 0,006) e à menor SG (p = 0,003). Não observamos relação entre expressão de ciclina A e p27 com acometimento ganglionar, grau histológico, receptores hormonais e c-erb-B2, diâmetro tumoral e estadio clínico. Na análise multivariada,a idade de menos de 41 anos no diagnóstico, acometimento de dois ou mais gânglios axilares e a expressão de ciclina A após a quimioterapia foram os fatores relacionados á óbito pela doença. Conclusões: observamos que a manutenção de expressão de ciclina A em tumores de mama localmente avançados após a quimioterapia neoadjuvante está relacionada à pior SLD e SG. Estes achados podem ser explicados pelo fato da expressão desta proteína identificar um grupo de tumores com alto índice de proliferação e maior agressividade. No nosso estudo, a expressão de p27 não foi preditiva de resposta ao tratamento neoadjuvante, SLD ou SG. / Introduction: the dysfunction in proteins that act controlling role in the cell cycle is directly related to oncogenesis initial processes. Cyclin A high expression in breast tumors is related to poor Disease Free Survival (DFS) and Global Survival (GS). Breast tumors lacking p27 expression are also related to worse prognosis. Both are associated with high grade tumors, larger diameters at diagnosis and higher c-erb-B2 expression. There are no available data comparing these proteins to clinical response in neoadjuvant therapy setting. Objectives: the purpose of our study is analyze thepositivity rates of cyclin A and p27 expression in locally advanced breast cancer (LABC), before and after neoadjuvant chemotherapy (NCT) with Docetaxel (75 mg/m 2 ) and Epirrubicin (60 mg/m 2 ), their relation to treatment response, DFS and GS. Methods: ninety two patients were included between 1998 and 2004. They received at least two chemotherapy courses with 21 days intervals and were submitted to surgery, as local therapy, followed by radiotherapy if treated with breast conservative surgery. The expression ofcyclin A and p27 were evaluated through immunohistochemistry and only cases with expression higher than 30 and 50% (respectively) were considered positives. Results: the median chemotherapy cycle number was three (2 - 7) and the median follow-up time was 40 months (11 - 100). We observed cyclin A positivity before NCT in 27 patients (29,3%) and p27 in 42 (45,7%). After NCT, the positivity rates for cyclin A and p 27 were 16,3% (15 patients) and 29,3% (27 patients), respectively. The p27 expression wasnot predictive of clinical response, pathological response, DFS or GS. Cyclin A expression before chemo was also not predictive of clinical or pathological response. Expression of cyclin A after neoadjuvant therapy was associated to poorer clinical response (6,7 x 27,3%, p = 0,04) but not to pathological response. The maintenance of cyclin A expression after chemotherapy was also related to poor DFS (p = 0,006) and GS (p = 0,003). We were not able to findany relation between cyclin A and p27 expression and node status, histological grade, hormone receptors, c-erb-B2, tumor diameter and clinical staging. In multivariate analysis, age before 41 years, two or more positive lymph nodes and cyclin A expression were related to death by cancer. Conclusion: we concluded that p27 expression was not predictive of neoadjuvant response, DFS or GS. In contrary, the maintenance of cyclin A expression in LABC after neoadjuvant chemotherapy is predictive of worse prognosis, poor DFS and GS. This is probably due tothese tumors high proliferation and aggressiveness.

Celecoxib é um antiinflamatório não esteroidal (AINE), inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2) usado em pesquisas recentes como agente anticarcinogênico. Os seus efeitos anti-neoplásicos dependem por um lado da sua capacidade de inibir a COX-2, mas por outro lado também age por mecanismos que independem da COX-2, em resumo o seu mecanismo de ação ainda não é completamente conhecido. O objetivo desta tese foi estudar os efeitos do celecoxib sobre as taxas de apoptose e os índices de proliferação celular de quatro linhagens celulares, Hn-6, Hn-19, Hn-30, Hn-31, de CECP e uma linhagem de queratinócitos mutada (HaCat), além de verificar se há correlação entre a expressão das proteínas COX-2, pAkt, ß-catenina, CD1 e NFKB e a inibição da proliferação celular. As células foram divididas em dois grupos: a, grupo controle; b, células cultivadas tratadas com celecoxib. A análise da expressão das proteínas pAkt, NFKB, ß-catenina, COX-2 e CD1 foi feita através da técnica de Western-blot. A indução de apoptose foi estudada com o Kit de Anexina. A proliferação celular foi monitorada através de curva de crescimento, com contagem celular na câmara de Neubauer e com o teste de viabilidade celular (Kit Cell Titer96) e a localização intracelular das proteínas foi avaliada por imunofluorescência. Os resultados mostraram significante aumento no índice celular de apoptose e diminuição da proliferação celular. Após o tratamento com celecoxib, a imunofluorescência mostrou que a proteína CD1 teve diminuição da expressão nuclear, a ß-catenina exibiu discreto aumento citoplasmático, o pAkt também passou a ser expresso no citoplasma da Hn6, enquanto as outras proteínas estudadas mantiveram o mesmo padrão de localização na célula. O western blot complementou os resultados da imunofluorescência indicando uma diminuição nos níveis de CD1. / Celecoxib, a cyclooxygenase-2 (COX-2) selective nonsteroidal anti-inflammatory drug, is a new anticarcinogenic agent. Its antitumor effects depend on the one hand on its COX-2-inhibiting potency, but on the other hand on COX-2-independent mechanisms, which until now have not been fully understood. The aim of this research was to study the effects of celecoxib in growth inhibition and apoptosis induction in four Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) cell lines, HN6, HN19, HN30, HN31 and HaCat an immortalized keratinocyte cell line, and verify if there is a correlation between the growth inhibition and the expression of COX-2, pAkt, ß-catenin, CD1 and NFKB. The Western Blot was used to analyze the COX-2, pAkt, ß-catenin, CD1 and NFKB protein expression level. Apoptosis induction was studied with the Annexin V kit. The cell lines proliferation will be measured through a growth curve with the Neubauer chamber and MTS method (KitCell Titer96), the proteins intracellular site was assed by immunofluorescence technic. The same cell lines without any treatment were used as controls. Results showed a significant increase in apoptotic cells index, and growth inhibition in cell lines treated with celecoxib. The proteins localization was determined through immunofluorescence. In control group the CD1 was located mostly in nucleus, after treatment CD1 nuclear localization was reduced, it could also be noticed an increase in cytoplasmic expression of ß-catenin in all cell lines while pAkt cytoplasmic increase was present exclusevely in Hn6, the other proteins maintained their cellular localization,. The Western Blot results showed considerable reduction in CD1 levels with exception of Hn19 cell line.

Hepatocellular carcmoma (HCC) is the third most common cause of cancer-related deaths worldwide, with a gender prevalence observed in men. Recent studies have suggested that elevated activity of the androgen axis is one major host factor underlying this disparity between genders. The androgen receptor (AR) mediates function of androgen in vital developmental and oncogenic pathways by binding to genomic androgen response elements, which influence the transcription of downstream target genes. AR is overexpressed in 60-80% of human HCCs. Genetic studies further established the pivotal role ofAR in hepatocarcinogenesis, where liver-specific knockout of AR significantly reduced tumorigenicity in carcinogen- and HBV-induced HCC mouse models. However, AR-inducedhepatocarcinogenesis is far from fully understood, in part because little is known about the identity and role of direct AR-dependent targeted genes in hepatocytes. / In this study, we used genome-wide location and functional analyses to identify a critical mediator of AR signaling, cell cycle-related kinase (CCRK), in driving beta-cateninl T-cell factor (TCF)-dependent hepatocarcinogenesis. Using chromatin immunoprecipitation followed by promoter array analysis of AR-overexpressing HCC cell lines, we found a number of cell cycle-related genes that are likely under the direct modulation of AR. Cell cycle-related kinase (CCRK), previously shown to promote glioblastoma tumorigenesis, was found to be the most significantly-bound AR target ( p<0.0001). CCRK was directly up-regulated by ligand-activated AR through promoter binding and required for AR-induced G1-S cell cycle progression because (1) CCRK overexpression attenuated cell cycle blockage by AR knockdown and (2) CCRK inhibition counteracted AR-mediated cell cycle progression. Ectopic CCRK expression induced immortalized liver cell proliferation, malignant transformation and tumor formation in immunodeficient mice, whereas CCRK inhibition decreased HCC cell growth in vitro and in vivo. These functional assays demonstrated that CCRK is a potential oncogene in HCC. Mechanistically, CCRK activated beta-catenin/TCF-dependent transcription through phosphorylation of glycogen synthase kinase-3beta and induced the expressions of beta-catenin target genes, cyclin D1 (CCND1) and epidermal growth factor receptor (EGFR). Inhibition of beta-catenin/TCF signaling attenuated CCRK-induced cell cycle progression, colony formation and tumorigenicity. Conversely, HCC cell growth inhibition by CCRK knockdown was rescued by constitutively active beta-catenin or TCF. In agreement with these findings, activation of the AR/CCRK/beta-catenin axis was frequently observed in primary HCCs. More importantly, CCRK over-expression was correlated with tumor staging and poor overall survival in a cohort ofhuman HCC tissues. / Together, our data reveal a new cascade for AR function in hepatocarcinogenesis via the activation of beta-catenin/TCF signaling. This study also reveals that CCRK is a novel focal link between two prominent signaling pathways vital for HCC growth and thus represents a new therapeutic target for HCC treatment. / Feng, Hai. / Adviser: Sung Jao Yiu. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-04, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 161-177). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Parkinson's Disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder, clinically characterized by severe motor impairment and pathologically characterized by progressive loss of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc) as well as the formation of cellular aggregate deposits called Lewy Bodies. While some advances have been made in understanding the molecular underpinnings of the disorder, the molecular implications of common genetic factors increasing risk for PD have not been adequately studied. First identified by GWA studies in 2009, the GAK/DGKQ/IDUA region on chromosome 4p16.3 shows significant genetic association to risk for PD, and the GAK protein has been shown to be associated with the primary component of Lewy Bodies, a-synuclein. In order to determine which gene in the 4p16.3 region may account for the genetic association to PD and to understand the molecular consequences of that association, post-mortem cortical brain tissue from 29 PD and 49 control patients was RNA-sequenced and differential exon usage in the context of disease and risk variant carrier status was analyzed. Exons in the 3' region of GAK were found to be associated to case status, and notably exon 25 expression in GAK was associated with both case status and the risk variant. This exon was further observed to be associated to several genes previously shown to interact with GAK, including SNCA, which codes for a-synuclein. As a proxy for expression of the 3' region of GAK, exon 25 was assessed for genome-wide association, and genes showing association to the exon were involved in pathways related to synaptic transmission and neuronal function. In order to validate these findings, microarray analysis of primary rat cortical neurons in which GAK expression was reduced by shRNA transduction was performed. GAK expression in rat neurons was significantly inversely correlated to endogenous SNCA expression, and also exhibited association to pathways involved in synaptic transmission and mitochondrial function. Together, these findings suggest aberrant GAK expression related to genetic risk to be an important factor in the pathogenesis of PD through GAK's influence on SNCA expression and through dysregulation of important neuronal pathways.

Orientador: Lúcia Regina Ribeiro / Banca: Daniel Araki Ribeiro / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Resumo: A Nutrigenômica é definida como o efeito da dieta na expressão gênica, e a extensão pela qual as diferenças genéticas entre os indivíduos influenciam a resposta a um padrão específico de dieta, à ingestão de alimentos funcionais e à suplementação de micronutrientes, em termos de um resultado para a saúde humana. A α-tomatina é um glicoalcalóide encontrado no tomate (Lycopersicon esculentum) que possui funções biológicas importantes como a redução dos níveis de colesterol LDL, inibição do crescimento de células cancerosas, estimulação do sistema imune e efeito antimetastático. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade da α-tomatina, os seus efeitos na proliferação celular, na indução de apoptose e expressão de RNAm dos genes APC, Ciclina A2, Catenina, CASP9, BAK, BAX e BCL-XL em células HT29. As células foram cultivadas em meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro bovino fetal, e tratadas nas concentrações de 0,1, 1 e 10 μg/mL para o ensaio do MTT e proliferação celular. Na análise de apoptose morfológica utilizou-se as concentrações de 0,1, 1 e 2 μg/mL. Já para a avaliação da expressão gênica utilizou-se a concentração de 1 μg/mL. Após 12 horas de tratamento, o RNA das células foi extraído e a expressão dos genes foi avaliada através do método de PCR em tempo real. O gene GPDH foi utilizado como normalizador. A análise estatística foi realizada por ANOVA/Tukey para o ensaio do MTT. Os resultados do ensaio de cinética de proliferação celular, viabilidade celular e avaliação da indução de apoptose foram analisados estatisticamente através de ANOVA/Dunnet, e para a análise da expressão gênica utilizou-se o método de Pfaffl et al. (2002), através do cálculo estimado pelo método ΔΔCt. Os estudos experimentais indicaram que a α-tomatina foi citotóxica apenas na concentração de 10 μg/mL... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nutrigenomics is defined as the effect of diet on gene expression, and the extent to which genetic differences between individuals influence the response to a specific pattern of diet, intake of functional foods and micronutrient supplementation, in terms of a result for human health. The α- tomatine is highlighted as a glycoalkaloid found in tomato (Lycopersicon esculentum) that has important biological functions such as reducing levels of LDL cholesterol, inhibit cancer cell growth, stimulation of the immune system and antimetastátic effect. In view of these considerations, the objective of this study was to evaluate the cytotoxicity of α-tomatine, their effects on cell proliferation, induction of apoptosis and morphological expression of mRNA of APC gene, Cyclin A2, β-Catenin, CASP9, BAK, BAX and BCL-XL in HT29 cells. The cells were grown in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum, and treated at concentrations of 0.1, 1 and 10μg/mL for the MTT assay and cell proliferation. In the morphological analysis of apoptosis, we used concentrations of 0.1, 1 and 2μg/mL. As for the evaluation of gene expression we used a concentration of 1 mg/mL. After 12 hours of treatment, the RNA from cells was extracted and gene expression was evaluated by the method of real-time PCR. The gene GPDH was used as normalizer. Statistical analysis was performed by ANOVA / Tukey test for MTT. The test results of kinetics of cell proliferation, cell viability and assessment of apoptosis were analyzed with ANOVA / Dunnet, and for analysis of gene expression we used the method of Pfaffl et al. (2002), by calculating estimated by ΔΔCt. Experimental studies suggested that α-tomatine was cytotoxic only at concentration of 10μg/mL. In the evaluation of cell proliferation were no significant differences in the treatments with α-tomatine, except that for the concentration... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Celecoxib é um antiinflamatório não esteroidal (AINE), inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2) usado em pesquisas recentes como agente anticarcinogênico. Os seus efeitos anti-neoplásicos dependem por um lado da sua capacidade de inibir a COX-2, mas por outro lado também age por mecanismos que independem da COX-2, em resumo o seu mecanismo de ação ainda não é completamente conhecido. O objetivo desta tese foi estudar os efeitos do celecoxib sobre as taxas de apoptose e os índices de proliferação celular de quatro linhagens celulares, Hn-6, Hn-19, Hn-30, Hn-31, de CECP e uma linhagem de queratinócitos mutada (HaCat), além de verificar se há correlação entre a expressão das proteínas COX-2, pAkt, ß-catenina, CD1 e NFKB e a inibição da proliferação celular. As células foram divididas em dois grupos: a, grupo controle; b, células cultivadas tratadas com celecoxib. A análise da expressão das proteínas pAkt, NFKB, ß-catenina, COX-2 e CD1 foi feita através da técnica de Western-blot. A indução de apoptose foi estudada com o Kit de Anexina. A proliferação celular foi monitorada através de curva de crescimento, com contagem celular na câmara de Neubauer e com o teste de viabilidade celular (Kit Cell Titer96) e a localização intracelular das proteínas foi avaliada por imunofluorescência. Os resultados mostraram significante aumento no índice celular de apoptose e diminuição da proliferação celular. Após o tratamento com celecoxib, a imunofluorescência mostrou que a proteína CD1 teve diminuição da expressão nuclear, a ß-catenina exibiu discreto aumento citoplasmático, o pAkt também passou a ser expresso no citoplasma da Hn6, enquanto as outras proteínas estudadas mantiveram o mesmo padrão de localização na célula. O western blot complementou os resultados da imunofluorescência indicando uma diminuição nos níveis de CD1. / Celecoxib, a cyclooxygenase-2 (COX-2) selective nonsteroidal anti-inflammatory drug, is a new anticarcinogenic agent. Its antitumor effects depend on the one hand on its COX-2-inhibiting potency, but on the other hand on COX-2-independent mechanisms, which until now have not been fully understood. The aim of this research was to study the effects of celecoxib in growth inhibition and apoptosis induction in four Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) cell lines, HN6, HN19, HN30, HN31 and HaCat an immortalized keratinocyte cell line, and verify if there is a correlation between the growth inhibition and the expression of COX-2, pAkt, ß-catenin, CD1 and NFKB. The Western Blot was used to analyze the COX-2, pAkt, ß-catenin, CD1 and NFKB protein expression level. Apoptosis induction was studied with the Annexin V kit. The cell lines proliferation will be measured through a growth curve with the Neubauer chamber and MTS method (KitCell Titer96), the proteins intracellular site was assed by immunofluorescence technic. The same cell lines without any treatment were used as controls. Results showed a significant increase in apoptotic cells index, and growth inhibition in cell lines treated with celecoxib. The proteins localization was determined through immunofluorescence. In control group the CD1 was located mostly in nucleus, after treatment CD1 nuclear localization was reduced, it could also be noticed an increase in cytoplasmic expression of ß-catenin in all cell lines while pAkt cytoplasmic increase was present exclusevely in Hn6, the other proteins maintained their cellular localization,. The Western Blot results showed considerable reduction in CD1 levels with exception of Hn19 cell line.

Introdução: a disfunção de proteínas que atuam no controle do ciclo celular está diretamente relacionada ao processo inicial de tumorigênese. A expressão de ciclina A em tumores de mama está relacionada à menor sobrevida livre de doença (SLD) e também à menor sobrevida global (SG). Da mesma maneira, a reduzida expressão de p27 em tumores de mama está relacionada à pior prognóstico. Ambas as alteraçõestêm sido relacionadas com tumores de alto grau histológico, maior diâmetro no momento do diagnóstico e expressão de c-erb-B2. Não há dados referentes à resposta clínica destes tumores ao tratamento neoadjuvante. Objetivos: o objetivo deste estudo foi analisar as taxas de positividade de expressão de ciclina A e proteína p27 em tumores de mama localmente avançados, antes e após quimioterapia neoadjuvante com Docetaxel (75 mg/m 2 ) e Epirrubicina (60 mg/m 2 ), a relação delas com resposta ao tratamento, SLD e SG. Metodologia: foram incluídas 92 pacientes tratadas no período entre janeiro de 1998 e dezembro de 2004, com aplicação de pelo menos dois ciclos de quimioterapia neoadjuvante a cada 21 dias e submetidas à cirurgia para tratamento loco-regional. A análise da expressão deciclina A e p27 foi feita por meio de imunohistoquímica, tendo sido considerados positivos os casos com expressão acima de 30 e 50%, respectivamente. Resultados: a mediana do número de ciclos de quimioterapia neoadjuvante foi de três (variando entre 2 e 7) e do tempo de seguimento de 40 meses (11 - 100). Observamos positividade de ciclina A antes da quimioterapia em 27 pacientes (29,3%) e de p27 em 42 pacientes (45,7%). Após a quimioterapia, a positividade para ciclina A foi de16,3% (15 pacientes) e de p27 de 29,3% (27 pacientes). A expressão de p27 nãofoi preditiva de resposta clínica ou patológica, SLD e SG. As taxas de resposta clínica foram iguais nas pacientes com e sem expressão de ciclina A antes daquimioterapia e a resposta patológica também foi semelhante. A manutenção de expressão de ciclina A após a quimioterapia esteve associada à menor resposta clínica completa (6,7 x 27,3%, p = 0,04), mas não à resposta patológica. Também esteve relacionada à menor SLD (p = 0,006) e à menor SG (p = 0,003). Não observamos relação entre expressão de ciclina A e p27 com acometimento ganglionar, grau histológico, receptores hormonais e c-erb-B2, diâmetro tumoral e estadio clínico. Na análise multivariada,a idade de menos de 41 anos no diagnóstico, acometimento de dois ou mais gânglios axilares e a expressão de ciclina A após a quimioterapia foram os fatores relacionados á óbito pela doença. Conclusões: observamos que a manutenção de expressão de ciclina A em tumores de mama localmente avançados após a quimioterapia neoadjuvante está relacionada à pior SLD e SG. Estes achados podem ser explicados pelo fato da expressão desta proteína identificar um grupo de tumores com alto índice de proliferação e maior agressividade. No nosso estudo, a expressão de p27 não foi preditiva de resposta ao tratamento neoadjuvante, SLD ou SG. / Introduction: the dysfunction in proteins that act controlling role in the cell cycle is directly related to oncogenesis initial processes. Cyclin A high expression in breast tumors is related to poor Disease Free Survival (DFS) and Global Survival (GS). Breast tumors lacking p27 expression are also related to worse prognosis. Both are associated with high grade tumors, larger diameters at diagnosis and higher c-erb-B2 expression. There are no available data comparing these proteins to clinical response in neoadjuvant therapy setting. Objectives: the purpose of our study is analyze thepositivity rates of cyclin A and p27 expression in locally advanced breast cancer (LABC), before and after neoadjuvant chemotherapy (NCT) with Docetaxel (75 mg/m 2 ) and Epirrubicin (60 mg/m 2 ), their relation to treatment response, DFS and GS. Methods: ninety two patients were included between 1998 and 2004. They received at least two chemotherapy courses with 21 days intervals and were submitted to surgery, as local therapy, followed by radiotherapy if treated with breast conservative surgery. The expression ofcyclin A and p27 were evaluated through immunohistochemistry and only cases with expression higher than 30 and 50% (respectively) were considered positives. Results: the median chemotherapy cycle number was three (2 - 7) and the median follow-up time was 40 months (11 - 100). We observed cyclin A positivity before NCT in 27 patients (29,3%) and p27 in 42 (45,7%). After NCT, the positivity rates for cyclin A and p 27 were 16,3% (15 patients) and 29,3% (27 patients), respectively. The p27 expression wasnot predictive of clinical response, pathological response, DFS or GS. Cyclin A expression before chemo was also not predictive of clinical or pathological response. Expression of cyclin A after neoadjuvant therapy was associated to poorer clinical response (6,7 x 27,3%, p = 0,04) but not to pathological response. The maintenance of cyclin A expression after chemotherapy was also related to poor DFS (p = 0,006) and GS (p = 0,003). We were not able to findany relation between cyclin A and p27 expression and node status, histological grade, hormone receptors, c-erb-B2, tumor diameter and clinical staging. In multivariate analysis, age before 41 years, two or more positive lymph nodes and cyclin A expression were related to death by cancer. Conclusion: we concluded that p27 expression was not predictive of neoadjuvant response, DFS or GS. In contrary, the maintenance of cyclin A expression in LABC after neoadjuvant chemotherapy is predictive of worse prognosis, poor DFS and GS. This is probably due tothese tumors high proliferation and aggressiveness.

Introdução: A ciclina D1 constitui um importante regulador do ciclo celular e pode funcionar como co-regulador de transcrição. A superexpressão da ciclina D1 tem sido associada ao desenvolvimento e progressão do câncer. A degradação irregular da ciclina D1 pode ser responsável pelos seus níveis elevados em algumas neoplasias malignas. A ciclina D1, além disso, modula indiretamente a estrutura da cromatina e transcrição de genes envolvidos na proliferação e diferenciação. Mutações, amplificação e superexpressão da ciclina D1, que alteram a progressão do ciclo celular, são observadas frequentemente em várias apresentações de neoplasias malignas, incluindo o carcinoma epidermóide de laringe, e as elucidações inferidas destas observações podem trazer melhor entendimento à oncogênese. Objetivo: O objetivo deste estudo foi comparar a expressão imunoistoquímica de ciclina D1 e a ocorrência de metástase linfática em estádios III e IV de carcinoma epidermóide de laringe. Métodos: Estudo retrospectivo, coorte longitudinal, por avaliação imunoistoquímica e quantificação digital da imunoexpressão nuclear e citoplasmática de ciclina D1 em espécimes de tumor preservados em parafina oriundos de pacientes consecutivos submetidos à cirurgia oncológica radical, entre 1999 e 2004. A sobrevida global dos pacientes foi avaliada, bem como a idade, sexo, tabagismo, estado de comprometimento linfático, grau de diferenciação e estadiamento (pTNM). A análise estatística teve como significância valores de p< 0.05. A curva de sobrevida foi elaborada utilizando o método de Kaplan-Meier. Resultados: Houve imunomarcação citoplasmática em 566 (1,2%) células, imunomarcação nuclear em 13788 (29,6%) células, a relação do IPc e IPn foi de 0,007 (0,7%), ausência de imunomarcação celular foi observada em 32210 (69,1%) células, perfazendo um total de 46554 (100%) células investigadas. Entre os 28 (59,5%) casos que não apresentaram metástase linfática, o IPn foi de 26,8 (9,7 - 46,9) e o IPc foi de 0,1 (0 0,3); naqueles 19 (40,4%) em que foi observada metástase linfática, o IPn foi de 26,7 (16,7 39,0) e o IPc foi de 0,3 (0 - 1,0). Conclusões: Não houve associação estatisticamente significante entre expressão nuclear e citoplasmática de ciclina D1, em carcinoma epidermóide primário de laringe, e ocorrência de metástase linfática cervical, graus de diferenciação histológica, bem como recidiva loco-regional e metástase hematogênica. O presente estudo não subsidia a superexpressão de ciclina D1 como fator limitante de sobrevida global / Background: Cyclin D1 is an important regulator of cell cycle progression and can function as a transcriptional co-regulator. The overexpression of cyclin D1 has been linked to the development and progression of cancer. Abnormal cyclin D1 degradation appears to be responsible for the increased levels of cyclin D1 in several cancers. Recent findings have identified novel mechanisms involved in the regulation of cyclin D1 stability. Cyclin D1 belongs to the family of cyclin proteins which function as the regulatory subunits of cyclin/cyclin dependent kinase (Cdk) holoenzymes that regulate entry into and progression through the cell cycle. Cyclin D1 expression is induced upon stimulation by growth factors (e.g. EGF, IGF-I/II), aminoacids, hormones, and oncogenes such as Ras, Src, ErbB2, and SV40 T antigen. Cdk4 and Cdk6 can partner with cyclin D1 in early to mid-G1 phase to phosphorylate and inactivate the cell cycle inhibitory function of the retinoblastoma protein (pRB) in cooperation with cyclin E/Cdk2. Cyclin D1 is also known to modulate local chromatin structure and transcription of genes involved in proliferation and differentiation through CDK-independent association with histone acetylases (e.g. CBP, P/CAF) and deacetylases. Mutations, amplification or overexpression of cyclin D1, which alters cell cycle progression, are observed frequently in a variety of tumors, including laryngeal squamous cell carcinoma, and may contribute to oncogenesis. Methods: This was a retrospective study by immunohistochemical determination of cyclin D1 in fixated and paraffin-embedded tumour especimens from 47 consecutive patients with squamous cell carcinoma in larynx treated by curative oncological surgery from 1999 to 2004. Survival of patients was related to age, gender, nodal status and stage at termination of treatment. Significant differences were considered for p<0.05. Results: Cytoplasmic immunostain was observed in 566 (1,2%) cell, nuclear immunostain in 13788 (29,6%) cell, relationship between PIc and PIn was 0,007 (0,7%), absent cell immunostain was observed in 32210 (69,1%), and total 46554 (100%). Among 28 (59,5%) cases with no lymph node metastasis, PIn was 26,8 (9,7 - 46,9) and PIc was 0,1 (0 0,3); those 19 (40,4%) with lymph node metastasis, had a PIn of 26,7 (16,7 39,0) and PIc of 0,3 (0 -1,0). Conclusions: According to these results, it has been concluded that cyclin D1 showed nuclear and cytoplasmic expression in larynx squamous cell carcinoma; however, tumor cyclin D1 expression was not significantly associated with lymph node metastasis when quantified by quantitative or semiquantitative methods. Besides, cyclin D1 expression showed no influence in overall survival

Errata inserted inside back cover. / "August 2002" / Includes bibliographical references (leaves 146-174) / 177 leaves, [91 leaves of plates] : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Molecular Biosciences, 2002