Les virus sont au centre de problème de santé publique. En raison de l'apparition de nouveaux virus et pour certains de leur résistance aux traitements existants il est toujours d’actualité de développement de nouveaux agents antiviraux. En général, la stratégie de lutte contre les infections virales est basée sur la vaccination ou sur l'activité des petites molécules, interférant avec un ou plusieurs processus biologiques participant au cycle de vie du virus. Dans ce contexte, nous avons conçu et synthétisé des petites bibliothèques de molécules visant des propriétés anti-filovirus. Dans ce projet de recherche, nous avons mis l'accent sur le développement de composés ciblant la protéine Niemann-Pick C1, les protéases cathepsine et le processus de réplication. Lors du développement des inhibiteurs de Neimann-Pick C1 plus de 70 composés ont été synthétisés, portant le squelette pipérazine. Afin d'obtenir des inhibiteurs de cystéine cathepsines pouvant être impliqués dans la réplication du virus Ebola, nous avons synthétisé une petite bibliothèque de composés porteurs de groupement 1,3,5-triazine et possédant des activité de l’ordre du nanomolaire sur les cathepsines B, K, L et S. Enfin, pour inhiber la réplication du virus en ciblant SAH hydrolase, nous avons proposé une série de C-nucléosides carbocyclic ayant motif de 4-aza-7,9-dideazaadenosine. / The viruses cause the problem of public health. Due to the appearance of new viruses and their resistance to existing treatments there is still relevant to develop new antivirals. Generally, the strategy to combat viral infections is based on vaccination or on the activity of small molecules, interfering with one or more biological processes participating in virus life cycle. In this context, we took an effort to design and synthesize the library of small molecules possessing anti-filovirus properties. In this research project, we were focused on the developing of compounds targeting Niemann-Pick C1 protein, cathepsin proteases and replication process. In our effort into the development of the inhibitors of Neimann-Pick C1 we prepared the series of about 70 compounds, having in common the piperazine moiety. Diverse 1,4-N,N - substituents of piperazine, differencing in a size and shape were studied. In order to obtain efficient cysteine cathepsins inhibitors, we synthesized the small library of compounds bearing 1,3,5-triazine moiety. Finally, to inhibit the virus replication by targeting SAH hydrolase, we proposed the series of carbocyclic C-nucleosides having motif of 4-aza-7,9-dideazaadenosine.

L'unité structurale de la chromatine, nommée nucléosome, est composée d'un double brin d'ADN enroulé autour d'un octamère d'histone, et subit une pléthore de modifications post-traductionnelles. Les conséquences biologiques de l’acétylation des lysines et de l’isomérisation des liaisons peptidyl-prolyl ont été étudiées à travers une analyse à l’échelle atomique par RMN de systèmes d'intérêt reconstitués in vitro. Les liaisons peptidyl-prolyl du domaine N-terminal de l'histone H3 sont substrats in vitro d’une isomérase chez S. cerevisiae nommée Fpr4p, laquelle exerce un contrôle catalyse-dépendant de la transcription. La résolution de la structure du domaine catalytique de Fpr4p, à partir de contraintes géométriques mesurées par RMN, révéla un domaine canonique de la famille FKBP (FK506-binding protein). Grâce à l'analyse de la séquence primaire et aux expériences RMN, nous proposons un modèle structural préliminaire de Fpr4p entière. L'analyse fonctionnelle est réalisée grâce à trois décapeptides construits à partir de la séquence primaire de H3 chez S. cerevisiae. Ils sont tous substrats de Fpr4p et la catalyse est équivalente pour Pro16 et Pro30. La proportion à l'équilibre du conformère cis fut déterminée pour les trois peptides et celle-ci n'est pas affectée par l'activité catalytique de Fpr4p. Les structures en solution des substrats en conformation trans ont été résolues par spectroscopie RMN, et seront utilisées pour des appariements moléculaires in silico sur le domaine catalytique de Fpr4p. Pour étudier le rôle biologique de l'acétylation des histones, une méthodologie de production de protéines acétylées a été développée. Le protocole repose sur la mutation d'une lysine en cystéine d'une protéine recombinante, suivie d'une alkylation contrôlée exploitant la nucléophilie du groupe thiol préalablement introduit. La production de l'agent alkylant adéquat est simple, rapide, réalisable dans un laboratoire de biologie et permet différents marquages isotopiques du groupe acétyle. L'alkylation d'une protéine repliée fut réalisée avec succès en conditions natives. Le dimère d'histone H2A-H2B, un intermédiaire de l'assemblage du nucléosome et siège d'acétylation in vivo, fut reconstruit in vitro. Les déplacements chimiques des domaines N et C-terminaux de H2A sont cohérents avec un état intrinsèquement déstructuré bien que leurs dynamiques moléculaires ne soient pas équivalentes. / The structural unit of chromatin, the nucleosome, is composed of double-stranded DNA wrapped around a histone octamer and is subject to a plethora of post-translational modifications. The biological consequences of peptidyl-prolyl isomerization and lysine acetylation were investigated at atomic scale through analysis of in vitro reconstituted systems by NMR. Peptidyl-prolyl bonds of histone H3 N-terminal domain are substrates in vitro of an isomerase from S. cerevisiae named Fpr4p, which underlies transcriptional control dependent on its catalytic activity. The solution structure of the catalytic domain of Fpr4p was calculated based on restraints from NMR spectroscopy, and reveals a canonical catalytic domain belonging to the FK506-binding protein (FKBP) family. Based on primary sequence analysis and NMR experiments, a preliminary structural model of full length Fpr4p is also presented. Functional analyses were performed with three decapeptides designed from the primary sequence from the N-terminal tail of S. cerevisiae histone H3. All three constitute substrates of Fpr4p, with equivalent catalysis observed for Pro16 and Pro30. The equilibrium proportion of the cis-proline conformer has been determined for all three decapeptides, and these populations are unaffected by Fpr4p catalytic activity. Structural ensembles of the substrates with proline in the trans conformation were determined by using NMR spectroscopy, and will be subsequently used for in silico molecular docking onto Fpr4p. To study a second form of histone regulation, a semi-synthetic method to produce acetylated protein was developed. The protocol relies on the site-specific mutation of lysine to cysteine in recombinant proteins followed by controlled alkylation thanks to nucleophilicity of the introduced thiol. The production of the required alkylation reagent is easy, quick, and suitable for biology laboratory and allows diverse isotopic labeling within the acetyl group. Alkylation of folded proteins has also been achieved in native conditions. As one target of acetylation in vivo, the histone H2A-H2B dimer is an intermediate of nucleosome assembly and was reconstituted in vitro. Chemical shift values of the N- and C-terminal domains of H2A are in agreement with an intrinsically disordered state although they display differences in dynamic mobility.

Les glutathion transférases (GSTs) constituent une superfamille ubiquitaire d’enzymes multifonctionnelles impliquées dans les processus de détoxication cellulaire en métabolisant des substrats exogènes appelés xénobiotiques et dans le métabolisme secondaire. Pour cela, ces enzymes peuvent catalyser la conjugaison d’une molécule de glutathion (GSH) sur les composés ciblés ou simplement les lier au travers d’une fonction ligandine. Alors que la fonction de conjugaison est catalysée par les GSTs possédant une sérine ou une tyrosine comme résidu catalytique, certaines d’entre elles possèdent à la place une cystéine. Cette substitution change radicalement leurs propriétés puisque les GSTs à cystéine (Cys-GSTs) catalysent plutôt des réactions de déglutathionylation. Les Cys-GSTs sont retrouvées chez la plupart des organismes et sont réparties en plusieurs classes. Chez les plantes, on trouve principalement 4 classes : déshydroascorbate réductases (DHARs), GSTs Lambda (GSTLs), glutathionyl hydroquinone réductases (GHRs) et mPGES2 (microsomal prostaglandine E-synthase type 2). Alors que le rôle des DHARs semble clairement associé à la réduction du déshydroascorbate en ascorbate, la fonction physiologique des autres Cys-GSTs reste majoritairement inconnue. En combinant des approches moléculaires, cellulaires, biochimiques et structurales, l’analyse fonctionnelle des deux GHRs, des trois GSTLs et des trois DHARs chez l’arbre modèle Populus trichocarpa a été entreprise. De façon intéressante, les gènes GSTL et GHR sont majoritairement exprimés dans les fleurs, les fruits et les pétioles par rapport aux feuilles et aux racines. A l’inverse, les gènes DHAR sont principalement exprimés dans les feuilles. De plus, l’expression transitoire de protéines fusionnées à la GFP dans le tabac a montré que les GSTLs et les DHARs sont localisées dans les plastes, le cytoplasme et le noyau alors que les GHRs sont toutes plastidiales. Les études biochimiques et structurales effectuées à l’aide des protéines recombinantes et de substrats modèles ont montré que la plupart des Cys-GSTs possèdent des activités et des structures assez semblables. Cependant, bien que les GSTLs et les DHARs adoptent un repliement GST canonique classique proche de celui des GSTs Oméga fongiques et humaines, elles sont monomériques alors que les GSTs Oméga sont dimériques. Les GHRs sont particulières tant au niveau de leur interface de dimérisation unique qu’au niveau de leurs propriétés spécifiques de réduction de quinones glutathionylées. En résumé, la nature des substrats fixés par les Cys-GSTs (composés cycliques aromatiques) ainsi que les territoires d’expression de ces gènes et protéines suggèrent que ces protéines sont globalement impliquées dans la protection des plantes face aux contraintes environnementales via la modification, le stockage et/ou le transport de métabolites secondaires et autres composés antioxydants. Toutefois, l’objectif suivant sera de déterminer la nature exacte des substrats/ligands associés à chaque enzyme / Glutathione transferases (GSTs) constitute a ubiquitous superfamily of multifunctional enzymes involved in cellular detoxification processes by metabolizing exogenous substrates called xenobiotics and in secondary metabolism. For this purpose, these enzymes catalyze the conjugation of a glutathione molecule (GSH) onto target compounds or simply bind them through a ligandin function. While conjugation reactions are catalyzed by GSTs having a serine or a tyrosine as catalytic residues, other GSTs possess a cysteine. This substitution radically changes their properties since GSTs having a cysteine (Cys-GSTs) rather catalyze deglutathionylation reactions. Cys-GSTs are found in most organisms and are divided into several classes. In plants, there are mainly four classes: dehydroascorbate reductases (DHARs), Lambda GSTs (GSTLs), glutathionyl hydroquinone reductases (GHRs), and microsomal prostaglandin E-synthase type 2 (mPGES). While the role of DHARs seems clearly associated to the reduction of dehydroascorbate into ascorbate, the physiological function of other Cys-GSTs remains largely unknown. By combining molecular, cellular, biochemical and structural approaches, the functional analysis of the two GHRs, the three GSTLs and the three DHARs in the model tree Populus trichocarpa was undertaken. Interestingly, GSTL and GHR genes are predominantly expressed in flowers, fruits and petioles compared to leaves and roots. Conversely, the DHAR genes are mainly expressed in leaves. Furthermore, transient expression of proteins fused to GFP in tobacco showed that GSTLs and DHARs are localized in plastids, cytoplasm and nucleus while GHRs are all localized in plastids. Biochemical and structural studies using recombinant proteins and model substrates showed that most Cys-GSTs have similar activities and structures. However, although GSTLs and DHARs adopt a canonical GST folding similar to that of fungal and human Omega GSTs, they are monomeric whereas Omega GSTs are dimeric. GHRs are particular owing to their unique dimerization interface and to their specific capacity to reduce glutathionylated quinones. In summary, the nature of the substrates bound by Cys-GSTs (heterocyclic aromatic compounds) as well as the expression territories of these genes and proteins, suggest that they are generally involved in the protection of plants towards environmental constraints through the modification, storage and/or transport of secondary metabolites and other antioxidants. However, the next goal will be to determine the exact nature of the substrates/ligands associated with each enzyme

The present thesis work is dedicated to the implementation of novel electrochemical methods for the assay of drug compounds such as paracetamol and ascorbic acid and biologically relevant biothiols such as cysteine and glutathione. Particular attention has been paid to the development and application of amperometric detectors allowing for a readily surface renewing and for highly selective and sensitive assays.<p>Coupling of a screen printed electrochemical detector with a monolithic chromatographic column was performed for high-throughput analysis along with selectivity, sensitivity and good precision. The modification of a glassy carbon electrode with a perm-selective membrane was investigated in order to provide an electrochemical sensor for on-site analysis. Acetaminophen was investigated as a model drug compound because of its extensive use in drug “pain killer” medication.<p>Along with the aims of this thesis, a silver polycrystalline electrode was investigated as a sensitive and class selective electrode for the assay of small thiol-based molecules. The silver electrode was implemented for the first time as an amperometric detector coupled to liquid chromatography for the assay of thiols. Application to the study of thiol species present in white wines was realized in order to illustrate the potential of the silver working electrode as amperometric detector. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Problématique : Durant la période fœtale, le métabolisme global du fœtus fonctionne en hypoxie, ce qui limite la phosphorylation oxydative dans la mitochondrie, et par conséquent la production d’adénosine triphosphate (ATP). Ces conditions sont nécessaires pour le développement intra-utérin. Lors de la naissance, l’augmentation des concentrations d’oxygène et un stress oxydatif permettent une transition métabolique. Une charge oxydative supplémentaire en période néonatale pourrait perturber cette transition métabolique et causer des complications. La nutrition parentérale (NP) administrée aux nouveau-nés prématurés apporte un triple fardeau oxydatif : une exposition à des peroxydes oxydants autogénérés par l’interaction des composants de la NP, une carence en vitamine C (instable en solution), et une déficience en glutathion, vu la charge oxydative élevée. Cette charge oxydative excessive affecte l’homéostasie redox au foie et aux poumons, ainsi que le métabolisme énergétique hépatique, et ce, par des effets immédiats et à long-terme. La méthylation de l’ADN est un possible mécanisme qui explique les effets à long terme. Le but de ce travail était de caractériser l’impact à court- et long-terme de la NP néonatale sur l’homéostasie redox, la méthylation de l’ADN, et le métabolisme des glucides et lipides, en isolant chacun des facteurs nutritionnels. Méthodes : Des cochons d’Inde ont été divisés dans les groupes suivants 1) NP : nutrition intraveineuse complète ; 2) NP+ glutathion disulfure (GSSG) (6 ou 12µM- substrat pour la synthèse intra-cellulaire de glutathion); 3) Diète complète : nutrition orale complète 4) Diète déficiente en Vitamine C; 5) Diète déficiente en Cystéine; 6) Diète double déficiente; ou. À 1 semaine de vie, la moitié des animaux était sacrifié et l’autre moitié a commencé à manger une diète complète jusqu’à l’âge adulte. Résultats et discussion : Les animaux ayant reçu une NP néonatale ont un métabolisme énergétique permettant la synthèse de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) par l’augmentation de l’activité de la glucokinase (captation de glucose), et diminution de celles de la phosphofructokinase-1 (PFK-1) (glycolyse) et acétyl-CoA-carboxylase-1 (ACC)(lipogenèse). À l’âge adulte, les animaux ont une diminution des niveaux de GSSG, indiquant un débalancement de l’homéostasie redox vers le côté réducteur programmé par la NP néonatale. L’activité augmentée de l’ACC suggère une tendance à accumuler les lipides au foie à la suite d’une diète riche en glucides. L’ajout de glutathion à la NP ne prévient pas ces perturbations, car les déficiences en glutathion et vitamine C jouent un rôle sur la modulation des niveaux protéiques de l’ACC. Les diètes néonatales déficientes en vitamine C et cystéine augmentent l’activité de la PFK-1. Cette augmentation se maintient jusqu’à l’âge adulte chez les mâles, mais pas chez les femelles. Les niveaux protéiques de la glucokinase et ACC sont diminués à 1 semaine, et ceux de l’ACC sont élevés à 3 mois dans les groupes ayant reçu une des diètes déficientes. Ces effets sont similaires à ceux trouvés dans les animaux nourris avec la NP, suggérant que la déficience de la NP en ces nutriments et non les peroxydes cause ces effets. Dans tous les groupes, un stress oxydatif a été démontré à 1 semaine de vie, soit par l’augmentation des niveaux de GSSG, ou la diminution du GSH. Cet effet est vrai pour le foie et le poumon. Une réponse de Nrf2 est observée aussi au foie, ce qui caractérise un niveau bas de stress oxydatif. La baisse de GSH pulmonaire chez les animaux déficients est secondaire à l’inhibition oxydative de la voie de transméthylation au foie. Une diminution des niveaux d’ARNm de glutathion réductase et glutarédoxine sont observées, ce qui favorise encore le stress oxydatif pulmonaire. À long terme, les effets sont les opposés, soit débalancement de l’homéostasie redox vers le côté réducteur au foie et poumon. La méthylation de l’ADN était diminuée au foie des animaux nouveau-nés recevant les diètes déficientes, mais aucun changement n’a été observé aux poumons. Cette diminution est en accord avec les hauts niveaux d’ARNm des gènes de la protéine régulatrice de la glucokinase, et AMPK. À long-terme, l’effet inverse est observé pour la méthylation de l’ADN Conclusion : La NP modifie le flot d’énergie au foie à 1 semaine visant favoriser le métabolisme redox en détriment du métabolisme énergétique. Cet effet semble créer une déficience énergétique fonctionnelle, qui se développe en une lipogenèse accrue en âge adulte. Cela peut représenter un exemple de la plasticité développementale. Bien qu’un stress oxydatif en âge néonatal ne soit pas létal, il affecte le métabolisme énergétique et redox à long-terme, probablement par la méthylation de l’ADN. Les résultats de ce travail démontrent que ces animaux adultes ont une capacité accrue d’entreposer de l’énergie, soit par une lipogenèse plus élevée, soit par une accumulation d’énergie redox (glutathion). Aucune maladie métabolique n’était observée chez les animaux, mais il est attendu à ce que ces animaux développent ces maladies plus facilement suite à l’exposition à des insultes (habitudes de vie malsaines, tabagisme, etc.). / Problematic: During the fetal period, the general metabolism works under hypoxia, limiting oxidative phosphorylation in mitochondria and adenine triphosphate (ATP) synthesis. These conditions are necessary for intrauterine development. After birth, the increasing oxygen concentrations and the associated oxidative stress induce a metabolic transition. An excessive oxidative load during the neonatal period could perturb this transition. Parenteral nutrition (PN) administered to premature newborns comes with a triple oxidative burden: contaminating peroxides generated in solution, vitamin C deficiency (unstable in solution), and glutathione deficiency (caused by the high oxidative load). This oxidative load affects redox homoeostasis in the liver and lungs, as well as energy metabolism in the liver. These effects are not only immediate, but they are also delayed. DNA methylation is a candidate mechanism explaining the long-term effects. The objective of this work was to characterize the short- and long-term impacts of neonatal PN over redox homoeostasis, DNA methylation and carbohydrate and lipid metabolism by isolating each of these factors. Methods: Six groups of three-day-old guinea pigs received for 4 days either: 1) Total PN; 2) PN+glutathione disulfide (GSSG) (6 or 12µM-anti-peroxide);3) Vitamin C deficient; 4) Cysteine deficient; 5) Double deficient; or 6) Complete diets. At 1 week of life, half of the animals were sacrificed, and the other half started eating nutritionally complete diets until adulthood. Results and discussion: NP animals had energy metabolism shifted favouring nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) synthesis, as evidenced by the increase in glucokinase activity (glucose trapping in hepatocytes) and decrease in phosphfuctokinase-1 (PFK-1) (glycolysis) and acetyl-CoA-carboxyalase-1 (ACC) (lipogenesis) activities. Adding GSSG to parenteral nutrition prevents these changes. During adulthood, ACC activity is increased, suggesting a tendency to accumulate lipids after a diet rich in carbohydrates. Adding GSSG to PN does not prevent these changes as they seem to be caused by the nutritional deficiencies in vitamin C and cysteine. Neonatal diets deficient in vitamin C and cysteine increase PFK-1 activity. This increase is maintained until adulthood in males but not in females. Protein levels of glucokinase and ACC are decreased at 1 week of life and ACC levels are increased at adulthood in deficient groups. These effects are like the ones observed in PN animals. In all groups, oxidative stress is demonstrated in 1-week-old animals, either by an increase in GSSG levels, or a decrease in GSH. This is true for the liver and lungs. An Nrf2 response is also observed in the liver, suggesting a low level of oxidative stress. The decrease in lung GSH is secondary to the oxidative inhibition of the transmethylation pathway in the liver. Decreased levels of glutathione reductase and glutaredoxin mRNA levels are observed in lungs, favouring pulmonary oxidative stress. At adulthood, an imbalance in redox homeostasis towards a reducing state is observed in lungs and liver. DNA methylation was decreased in the liver of deficient animals at 1-week, but no changes were observed in lungs. This decrease is in accordance with the decrease in mRNA levels of glucokinase regulatory protein and AMPK. At adulthood, the opposite effect was observed for DNA methylation. Conclusion: Parenteral nutrition alters the energy flow in the liver of 1-week-old animals, favouring redox metabolism over energy metabolism. This effect seems to create a phenotype of functional energy deficiency which translates into an increased lipogenesis at adult age. This may be an example of developmental plasticity. Although neonatal oxidative stress is not lethal, it affects energy and redox metabolism at adulthood, probably through DNA methylation. The presented results demonstrate these animals have an increased capacity of storing energy, either through increased lipogenesis, or by an increase in redox energy accumulation (glutathione). No metabolic disease was observed. Although it would be expected that these animals would develop these diseases more easily after exposure to insults, such as unhealthy lifestyle habits, smoking, and others.

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense. / In flowering plants, the ovary is the female reproductive organ that interacts extensively with the male gametophyte during pollen tube (PT) growth, guidance, reception, discharge and gamete fusion. The process begins when numerous ovule-expressed genes are activated when pollen lands on the stigma. To explore the ovular signals that have a great impact on successful pollen–pistil interactions, especially the secreted molecules that mediate species-specific signalling events, ovule mRNA expression and protein secretion profiles were studied in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Solanum chacoense has undergone extensive interspecific hybridization with sympatric solanaceous species that greatly facilitates the study of species-specific pollen–ovule interactions and evolution. In this project, three ovule conditions were studied: wild-type mature ovules, slightly immature ovules at two days before anthesis (2DBA), and frk1 mutant ovules that lack an embryo sac (ES). RNA-seq was performed on S. chacoense ovules to provide a scaffold assembly comprising 33852 CDS-containing sequences, then to provide read counts for differential gene expression analyses on three ovule conditions as well as on leaf. Compared to wild-type ovules, 818 genes were downregulated in frk1 ovules. A subset of 284 genes was concurrently under-expressed in 2DBA ovules, suggestive of their specific involvement in late stages of ES maturation (female gametophyte (FG), FG6 to FG7 developmental stage), as well as in PT guidance processes, as neither frk1 nor 2DBA ovules attract semi in vivo-grown PTs. Of these 284, 21% encoded cysteine-rich peptides (CRPs). Using de novo assembled ovule transcriptomes of two close relatives, S. gandarillasii and S. tarijense, an orthology survey was conducted on these CRPs, revealing their highly polymorphic nature among species and rapid evolution. Interestingly, novel cysteine motifs unique to this family were also uncovered. As compared to parallel studies in Arabidopsis, S. chacoense was found to possess a highly divergent ES transcriptome, in terms of both functional categories and individual ortholog similarities. Although glycosylation is not required for micropylar guidance cues to attract PTs in Arabidopsis, Torenia or maize, glycosylated ovule extracts from S. chacoense showed enhanced PT guidance competency by 18%. This is the first time a positive regulation between glycosylation and ovular PT guidance has been observed. As a complement to the transcriptomic approach, a proteomic approach using secreted proteins from the ovule (secretome) was employed to identify proteins involved in pollen–pistil interactions. Ovule exudates were collected from mature ovules (PT attracting) and immature ovules at 2DBA (PT nonattracting), using a novel tissue free-gravity extraction method (tf-GEM), which efficiently reduced the cytosolic contamination to less than 1%. Through mass spectrometry analyses, a total of 305 ovule-secreted proteins (OSPs) were identified, of which 58% were considered ovule-specific when compared to secretome studies conducted in other plant tissues. The secretion of 128 OSPs was upregulated in mature ovules vs. immature ovules. These OSPs were considered as candidate proteins involved in late ovule maturation and PT guidance. This study demonstrated that the ES maturation from FG6 to FG7 stages influenced the secretion status of 44% of ovule secretome. Surprisingly, the majority (83%) of these proteins were not regulated at the RNA level, vindicating this novel approach in the study of PT guidance as a robust complement to transcriptomic studies. Among all identified guidance-related ovular signals from the transcriptomic and proteomic approaches described above, we focused on the evaluation of the involvement of CRPs in ovular PT guidance of S. chacoense, due to the implication of various CRPs in pollen–pistil interactions and, especially, in PT guidance. A total of 28 CRPs were present in PT attracting ovules while being low or absent in nonattracting ovules, at the mRNA and/or protein secretion levels. Of these, 17 CRPs were expressed in bacteria and purified in sufficient amount for PT guidance assays. However, while ovule exudates were shown to induce PT chemotropism in the bead assay, refolded candidates did not show guidance competency. Since the use of eukaryotic protein expression systems might lead to better refolding and higher protein activity, the remaining candidates will be expressed in both yeast and plant-based expression systems and tested for their ability to attract PTs in a semi in-vivo assay, in order to lead us toward the isolation of PT guidance chemoattractants in solanaceous species like S. chacoense.