Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l’organogénèse racinaire d’un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s’établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n’est pas pérenne, du fait de la mise en place d’un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l’heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l’implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l’activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L’analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L’analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l’induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu’induit par un traitement abiotique ou lors d’une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l’expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l’étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d’une dégradation des bactéroïdes. / Medicago truncatula is a leguminous plant establishing a symbiotic interaction with the bacteria Sinorhizobium meliloti. This symbiosis leads to the de novo development of root nodules involved in biological nitrogen fixation. However, this symbiotic interaction is time limited and an early senescence appears in mature nodule entailing the formation of a senescence zone (zone IV). This degradation process occurs earlier in comparison to senescence of the whole plant. During nodule developmental senescence of plant host cells, a gradual degradation process induces a loss of vacuole and peribacteroid membrane (PBM). But this nodule degradation process still remains to be unravelled. To increase our understanding of the nodule senescence process, we developed new cytologic tools allowing an in vivo assessment of the viability and functioning of bacteroids within plant host cells. Therefore, these new tools provide a new insight of the nodule senescence process which may help for a finer characterization of the nodule senescence. In the M. truncatula model, a previous cDNA-AFLP analysis enlightens an upregulation of several cysteine proteinases during the transition from nitrogen fixing nodule to a senescent one; including an early expression of an SPG31-like peptidase known to be involved in leaf senescence (MtCP6) and a Vacuolar Processing Enzyme described as a plant caspase-like protein (MtVPE) involved in mechanisms similar to hypersensitive response in A. thaliana. In planta spatiotemporal analysis of the expression of these two cysteine proteinases using promoter:reporter gene GUS confirmed their expression during natural senescence at the junction between the nitrogen fixing zone (zone III) and the senescence zone (zone IV). Therefore, to acquire a better insight into the role of these cysteine proteases during the senescence program, we knocked down by RNAi the expression of each gene specifically at the interzone III-IV. Depletion of these transcripts induced a drastic increased of N2 fixation and nodule size. Conversely, overexpression of both genes in the zone III of nodule leads to an extension of the senescence zone. Confocal microscopy images of protein:GFP fusions showed that both proteinases are addressed to bacteroids within plant host cells. Our data revealed that MtCP6 and MtVPE are key players of the nodule senescence process and may be directly involved in symbiosome degradation.

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Au cours de ces travaux de thèse, la synthèse de BODIPYs émettant dans le rouge et le proche infrarouge a été réalisée. Un premier travail d’extension de la conjugaison électronique (soit par introduction de groupements aromatiques sur le corps du BODIPY, soit par dimérisation) a permis d’atteindre les basses énergies du spectre électromagnétique. La validation d’une méthode de synthèse de BODIPYs à l’aide d’orthoesters a permis une mise en oeuvre aisée et une nette amélioration de leurs rendements. Parmi les fluorophores obtenus, les dithiényl-BODIPYs émettant dans la fenêtre thérapeutique (650-900 nm) présentent des propriétés optiques et électrochimiques intéressantes. Ils ont été utilisés pour des applications dans le domaine biologique. Après leur solubilisation dans les milieux aqueux par introduction de groupements ammoniums, la détection d’un acide aminé, la cystéine, a pu être réalisée par spectroscopies d’absorption et de fluorescence mettant en évidence un système ratiométrique. De plus, le marquage d’une protéine modèle, le sérum d’albumine bovine, permet d’envisager l’utilisation de ce type de BODIPYs pour l’imagerie biologique grâce à un rendement quantique de fluorescence élevé en milieu physiologique. / During this thesis the synthesis of red and near-infrared emitting BODIPYs was realized. First, the electronic conjugaison was extended by introducing aromatic groups on the BODIPY core or by dimerization in order to archieve these low energies of the electromagnetic spectrum. The validation of a synthetic method of BODIPYs with orthoester allowed to have an efficient synthesis with a clear enhancement of the reaction yield. Among the obtained dyes dithienyl-BODIPYs which display an emission in the therapeutic window (650-900 nm) present interesting optical and electrochemical properties. They have been used for applications in the biological field. After their water-solubilization with ammonium groups the detection of an amino-acid (the cysteine) was archieved with a ratiometric system observed in absorption and fluorescence spectrocopies.Moreover the labelling of a model protein, the bovin serum albumine, allows to consider the use of this type of BODIPYs in biological imaging because of a red emission and a high quantum yied in physiologic medium.

Les protéines à centre Fe-S sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires. In vivo, la formation des centres Fe-S est réalisée par des machineries multi-protéiques dont ISC et SUF, conservées chez les eucaryotes et les procaryotes. D’autres composants participent à la formation des centres Fe-S chez les eucaryotes, comme la frataxine (FXN). La FXN est une protéine présente chez l’homme, les plantes, la levure ou encore les bactéries à Gram négatif. Chez les eucaryotes, l’absence de FXN conduit à des phénotypes drastiques comme une accumulation de fer dans la mitochondrie, une diminution drastique de l’activité d’enzymes à centre Fe-S ou encore des dommages oxydatifs. Chez l’homme, un déficit en FXN est responsable d’une maladie neurodégénérative, l’ataxie de Friedreich. A la différence des eucaryotes, chez les procaryotes comme Escherichia coli, l’absence de CyaY, homologue bactérien de la FXN, ne conduit à aucun des phénotypes évoqués ci-dessus.Durant ma thèse, je me suis intéressée au rôle de CyaY chez E. coli. J’ai montré que, in vivo, CyaY favorise la formation des centres Fe-S via la machinerie ISC. Un lien génétique entre CyaY et IscX a également pu être établi, montrant que ces deux protéines participent à la formation des centres Fe-S in vivo. Je me suis ensuite intéressée aux bases moléculaires pouvant expliquer la différence entre les phénotypes liés à l’absence de FXN chez les eucaryotes et les procaryotes. J’ai montré que le résidu 108 de IscU joue un rôle clé pour la dépendance de CyaY. Enfin, pour mieux comprendre le rôle de CyaY chez E. coli, j’ai réalisé une approche globale en caractérisant le transcriptome du mutant ∆cyaY. / Fe-S cluster containing proteins are involved in many cellular processes such as respiration, DNA repair or gene regulation. In vivo, Fe-S cluster biogenesis is catalysed by specific protein machineries, ISC and SUF, conserved in both eukaryotes and prokaryotes. Frataxin (FXN) is a small protein found in humans, plants, yeast and Gram negative bacteria. In eukaryotes, a defect in FXN leads to drastic phenotypes such as mitochondrial iron accumulation, drastic decrease of Fe-S cluster protein activity, sensitivity to oxidants. In humans, FXN deficiency is responsible for the neurodegenerative disease, Friedreich’s ataxia. In prokaryotes like E. coli, a defect in CyaY, the bacterial FXN homolog, does not lead to significant phenotypes compared to the wild-type strain. During my thesis, I investigated the role of the bacterial FXN CyaY in E. coli. I showed that, in vivo, CyaY assisted the ISC-catalyzed Fe-S cluster biogenesis. A genetic link was also observed between cyaY and iscX, demonstrating that these proteins participate in Fe-S cluster biogenesis. In a second part, I investigated the differences between the impact of the eukaryotic versus prokaryotic FXN. I showed that the IscU 108th residue is crucial for the CyaY-dependency. Finally, I used a transcriptomic approach to test whether CyaY has a global role in E. coli.

Les peptides vecteurs ou CPP sont de petits peptides, en général de taille inférieure à 30 acides aminés. Parmi les nombreux CPP décrits dans la littérature, les peptides riches en arginine ont fait l'objet d'une attention particulière. Plusieurs modifications chimiques du squelette peptidique conduisant à une distribution spatiale différente des groupes fonctionnels, ou encore l'introduction de chaînes aliphatiques ont été effectuées pour accroitre la capacité du peptide à traverser la membrane de la cellule. L'objectif de ce travail a été le développement de nouveaux peptides vecteurs cycliques contenant un domaine cationique minimal et pouvant être acylés par une chaîne aliphatique. Quinze nouveaux transporteurs cycliques, dont les peptides vecteurs classiques Pénétratine et R6W3ont été synthétisés. La cyclisation tête-queue par ligation chimique native a été rendue possible par l'introduction d'un résidu cystéine et d'une fonction thioester (ou précurseur) respectivement aux extrémités N et C-terminales des différentes séquences de CPP. Leur aptitude à transporter le peptide bioactif PKCi dans des cellules CHO a été évaluée par quantification de la cargaison internalisée en utilisant la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les résultats indiquent une meilleure internalisation essentiellement par voie d'endocytose dépendante des glycosaminoglycanes, suite à la cyclisation des CPP comparés à leur version linéaire. De toute la série des lipopeptides testés dans ce projet, deux séquences se distinguent par leur capacité remarquable à franchir les membranes cellulaire : les CPP [C12-R4] et [C12-R7]. / Cell-penetrating peptides (CPPs) are short, cationic or amphipatic peptides, usually containing less than 30 amino acids, which are able to deliver various bioactive cargoes inside cells. Among the many CPPs described in the literature, the arginine-rich peptides have attracted particular attention. Several chemical modifications of the peptide backbone leading to different spatial distributions of the CPP functional groups, or the introduction of aliphatic chains have been made to enhance their internalization efficiency. The aim of this work was the synthesis of new cyclic CPPs containing a minimal cationic domain and their functionalisation with an aliphatic chain. We have synthesised a small library of fifteen new cyclic carriers including the classical CPPs Penetratin and R6W3 using native chemical ligation (NCL) in solution. The introduction of an N-terminal Cys residue and of a C-terminal thioester (or precursor) in the initial linear peptide sequence allowed the head-to-tail cyclisation. The efficiency of cargo delivery in CHO cells was measured by MALDI-TOF mass spectrometry. We found that cyclisation of CPPs improved their internalisation efficiency mostly by glycosaminoglycan-dependent endocytosis. Among the whole series of lipopeptides tested in this project, two sequences are distinguished by their remarkable ability to cross cellular membranes: the peptides [C12-R4] and [C12-R7].

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La résistance au PVY chez des lignées transgéniques exprimant un inhibiteur de protéase est due en partie à des changements physiologiques occasionnés par l'inhibiteur recombinant exprimé dans la plante. Après clonage et expression hétérologue des protéases de maturation du PVY, nous avons étudié les interactions entre ces protéases et différentes cystatines végétales, démontrant par des tests in vitro que les protéases du PVY ne sont pas sensibles à l'action des inhibiteurs testés. Nous avons ensuite inoculé le virus sur des lignées transgéniques de pomme de terre exprimant la cystatine II du maïs (CCII) et des lignées transgéniques exprimant un inhibiteur de type aspartate, l'inhibiteur de cathepsine D (CDI) de tomate. Ces deux lignées présentent des altérations aux niveaux de leur métabolisme et étaient résistantes au virus PVY. Ces résultats, suggèrent que les inhibiteurs de protéases CCII et CDI exprimés chez les Solanacées entraînent des changements physiologiques significatifs chez la plante hôte induisant indirectement une résistance partielle ou totale au PVY.

Chez la drosophile, l’activation du récepteur Toll menant à une réponse antimicrobienne peut se faire par deux voies différentes. Ces deux voies sont activées soit par des récepteurs dédiés, les Pattern Recognition Receptors (PRRs) reconnaissant des motifs moléculaires microbiens, soit par la coupure d’une molécule circulante appelée Perséphone par des protéases microbiennes extrêmement diverses sécrétées pendant une infection. Cependant, le mécanisme par lequel Perséphone est activée demeurait ambigu. Nous avons identifié une région unique dans Perséphone fonctionnant comme un appât pour les protéases exogènes indépendamment de leur origine, type ou spécificité. Une coupure dans cette région constitue la première étape d’une activation séquentielle de Perséphone ; elle permet de recruter la cathepsine circulante 26-29-p, qui va générer la forme active de Perséphone.Ces travaux montrent comment un récepteur de l’immunité innée, Perséphone, peut être activé par un signal de danger, en l’occurrence des enzymes microbiennes, et non par la détection de motifs moléculaires qui peuvent être présents dans la flore microbienne hébergée par les animaux. / In Drosophila, the antimicrobial response against infections can be triggered by two different extracellular mechanisms that both lead to the activation of the Toll receptor. These two mechanisms are activated either by the recognition of specific microbial determinants by Pattern Recognition Receptors (PRRs), or by the cleavage of the circulating serine protease Persephone by a wide range of microbial proteases secreted during infections. However, the molecular mechanism underlying Persephone activation remained ambiguous. We identified a unique region in Persephone pro-domain that functions as a bait for exogenous proteases independently of their origin, type or specificity. Cleavage of Persephone in this bait region constitutes the first step of a sequential activation and licenses the subsequent maturation of Persephone to the endogenous circulating cysteine cathepsin 26-29-p. Our data establish Persephone itself as an immune receptor able to sense a broad spectrum of microbes through the recognition of danger signals rather than molecular patterns.

Clostridium difficile est une bactérie pathogène responsable de diarrhées nosocomiales et de la plupart des colites pseudomembraneuses. Le principal facteur de risque est la prise d'antibiotiques qui altère la composition du microbiote intestinal, et favorise ainsi l'implantation de la bactérie au niveau colique. Après une étape de colonisation, la bactérie produit ses principaux facteurs de virulence, les toxines A et B. La colonisation est un processus multifactoriel, qui met en jeu différentes protéines de surface dont des adhésines et une cystéine protéase Cwp84.Dans une première partie, nous avons analysé le processus de maturation de la protéase Cwp84, ainsi que sa localisation dans la bactérie, afin de mieux comprendre son rôle dans la virulence de C. difficile. La protéase recombinante, purifiée sous forme de zymogène, présente un processus de maturation particulier comprenant des clivages successifs, qui aboutissent à la forme mature de 47 KDa. La protéase ainsi activée présente une activité protéolytique sur la fibronectine. Dans la bactérie, Cwp84 existe sous deux formes majoritaires, associées à la surface de la bactérie : une première forme, d'environ 80 KDa, associée aux protéines de la couche S, dont le rôle serait de cliver le précurseur des protéines de la couche S en deux protéines matures ; une deuxième forme, d'environ 50 KDa correspondant vraisemblablement à la forme mature de la protéase recombinante de 47 KDa, est retrouvée à la fois dans la fraction extracellulaire et associée à la surface de la bactérie. Nous avons montré que la protéase rélarguée est capable de se ré-associer sous sa forme mature de manière spécifique à la surface de C. difficile. Dans une deuxième partie, nous avons analysé l'impact de conditions environnementales mimant celles rencontrées par la bactérie au cours de son transit dans le tractus digestif de l'hôte, sur la modulation de facteurs de colonisation, dont la protéase. Nous avons montré qu'un pH acide favorise à la fois l'expression et le processus de maturation de la protéase vers sa forme mature de 47 KDa. Des analyses protéomiques et transcriptomiques ont montré que d'autres protéines impliquées dans colonisation sont surexprimées dans un milieu avec glucose, cette régulation étant vraisemblablement liée à la diminution du pH résultant de la fermentation du glucose plutôt qu'à un effet direct de ce sucre. Cette régulation des facteurs de virulence par le pH acide est probablement un élément favorable au processus de colonisation de l'hôte. Ces différentes analyses ont également permis l'identification de facteurs de virulence potentiels, qui devront être caractérisés par la suite.

Blastocystis spp. est un Straménopile parasite anaérobie fréquemment rencontré dans le tractus gastro-intestinal de l'homme et de divers animaux. Ce parasite est associé à des troubles gastro‐intestinaux aspécifiques, et semble impliqué dans des désordres fonctionnels tels que le syndrome de l'intestin irritable (IBS). Ce travail de thèse s'appuie sur le séquençage du génome de Blastocystis sp. ST7 réalisé en collaboration avec le Génoscope d'Evry, l'Université Nationale de Singapour, l'Institut Pasteur de Lille et l'Université de Provence. Ce génome est constitué d'un génome nucléaire de 18,8 Mpb pour 6020 gènes, et d'un génome mitochondrial de 29 kpb localisé dans des organites apparentés aux mitochondries. L'analyse de ce génome apporte des informations au niveau de l'évolution de ce microorganisme, de son adaptation à l'environnement intestinal et de ces facteurs de virulence potentiels. En effet, les analyses in silico de ce génome ont montré que Blastocystis sp. ST7 possède plusieurs gènes codant des protéines pouvant agir à l'interface entre l'hôte et le parasite et connues chez d'autres protozoaires pour être impliquées dans des phénomènes de pathogénie. Ce sont en particulier des PKS, des NRPS, et des hydrolases dont des protéases. D'autre part, des activités protéolytiques ont été mises en évidence expérimentalement dans les surnageants de culture du parasite. Deux protéases à cystéines (une cathepsine B et une légumaïne) pouvant être impliquées dans la physiopathologie du parasite, ont été identifiées et caractérisées dans les surnageants, confirmant ainsi nos analyses in silico. Ce travail ouvre de nombreuses pistes intéressantes à explorer pour évaluer l'impact de ce parasite en santé humaine.