Le cytomégalovirus humain (CMVH) est un pathogène opportuniste majeur en cas d’immunodépression et représente la principale cause d’infection congénitale d’origine virale. Bien qu’efficaces, l’utilisation des molécules conventionnelles est limitée par l’émergence de résistance et leur toxicité. Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux traitements.L’étude des nouvelles mutations émergeant sous traitement antiviral demeure donc essentielle. L’introduction de ces nouvelles mutations, par mutagénèse « en passant », dans un chromosome bactérien artificiel contenant le génome viral nous permet, après transfection en cellules humaines, de tester la sensibilité de la souche recombinantes aux antiviraux.Différentes mutations de résistances ont ainsi été caractérisées. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles antivirales, des analyses bio-informatiques et la production de virus recombinants ont permis d’identifier de potentiels motifs fonctionnels essentiels à la réplication au sein du complexe terminase et hélicase-primase. Ainsi, nous avons montré quela sous-unité pUL56 du complexe terminase appartient à la famille des LAGLIDADG Homing Endonuclease. En effet, pUL56 contient un motif LATLNDIERFL et un motif de liaison à l’ADN. La technologie Alpha utilisant des protéines purifiées a permis de valider le caractère essentiel du fragment WMVVKYMGFF de pUL56 pour l’interaction avec pUL89. Enfin, nous avons mis en évidence les résidus impliqués dans la fixation de l’ATP au sein de l’hélicase et dans la stabilisation du zinc de la primase. Ainsi, la compréhension de la structure de ces protéines pourrait permettent de mieux appréhender leur fonctionnement au sein du processus de réplication du CMVH et le développement de nouvelles thérapies ciblant ces domaines. / Human cytomegalovirus (HCMV) is an important opportunistic pathogen for immunecompromised patients and is the leading cause of congenital viral infection. Although they are effective, using of conventional molecules is limited by the emergence of resistance and their toxicity. Then it becomes necessary to develop new treatments. Study of new mutationsemerging under antiviral treatment is therefore essential. Introduction of these new mutations, by « en passant » mutagenesis, into an artificial bacterial chromosome containing the viral genome allows us, after transfection into human cells, testing antivirals sensitivity of the recombinant. Different mutations of resistances have been characterized. In order tohighlight new antiviral targets, bioinformatics and recombinant viruses production allowed to identify potential functional patterns essential for viral replication within terminase and helicase-primase complex. Thus, we have shown that pUL56 subunit of the terminase complex belongs to the LAGLIDADG Homing Endonuclease family. Indeed, pUL56 contains aLATLNDIERFL motif and a DNA binding motif. Alpha technology using purified proteins allowed to validate the essential character of the WMVVKYMGFF fragment of pUL56 for the interaction with pUL89. Finally, we highlighted the residues involved in ATP binding within the helicase and in the stabilization of zinc within the primase. Thus, understanding of these proteins structure could allow us to better understand their role within the viral replication process and the development of new therapies targeting these domains.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a highly prevalent opportunistic infection and a major pathogen in immune-compromised patients. The virus exhibits a wide cell tropism and is able to lytically infect virtually any cell type, with detectable gene expression and release of new virions, but not the neutrophil. This cell is the first immune cell to engage most pathogens, engulfing and killing them before undergoing apoptosis and clearance by macrophages. However certain viruses and bacteria are able to evade host defences and use the neutrophil as a “Trojan horse” for replication and dissemination. In this context, enhanced neutrophil survival may promote infection. This work describes a profound neutrophil survival phenotype elicited by contact with live or UV-inactivated HCMV, in the absence of lytic viral gene expression. The effect does not involve signalling through candidate Toll-like receptors, but is dependent on activation of the ERK MAPK and NFκB signalling pathways, and is viral strain-dependent, restricted to clinical strains of the virus. Furthermore, HCMV triggers the secretion of a bioactive secretome that induces a similar paracrine anti-apoptotic effect in fresh neutrophils, and stimulates monocyte chemotaxis and differentiation to a phenotype that is permissive for HCMV infection. This “transferrable” effect is not due to residual virus or the presence of well-known neutrophil survival factors such as IL-6 or IL-8, but is mediated by a heat-stable protein or lipid, secreted late in culture. These results are supported by data in neutrophils isolated from patients with CMV viraemia and pneumonitis which show increased survival ex vivo, and will be further investigated using plasma membrane profiling by amino-oxybiotinylation and tandem mass tag mass spectrometry. This technique, used for the first time here in a primary cell type, allows quantitative proteomics to be performed for the first time in the neutrophil. This work demonstrates that the technique provides a comprehensive readout of all neutrophil plasma membrane proteins in a sample, with high plasma membrane purity and minimal neutrophil activation and necrosis, validated by flow cytometry. Furthermore, this has been applied to generate plasma membrane profiles for the resting, inflammatory and apoptotic neutrophil, revealing a number of neutrophil cell surface molecules not found by previous membrane proteomic methods. This technique has the potential to analyse the effect of HCMV and other pathogens on the expression profile of the neutrophil surface membrane and to examine how neutrophil signalling and function is modulated. These data shed light on the role of neutrophil apoptosis as a potential promoter of HCMV infection, and have the potential to increase our understanding of both the neutrophil’s response to pathogen invasion and to generate future approaches to combating HCMV dissemination and pathogenesis.

Le cytomégalovirus humain (CMVH) est un virus mondialement répandu impliqué dans des pathologies sévères chez les sujets immunodéficients et lors d’infection congénitale. L’arsenal thérapeutique est limité, non dénué de toxicité, et ne pouvant être administrés aux femmes enceintes. De plus, ces traitements favorisent l’émergence de mutations de résistance. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies, mais également de mieux comprendre les mécanismes de l’infection à CMVH lors de la grossesse. Au cours de ce travail de thèse, nous avons travaillé sur différents modèles d’infection virale, premièrement in vitro afin de tester de nouvelles molécules au potentiel antiviral, ciblant l’enzyme cyclooxygénase-2 impliquée dans les processus d’inflammation ; secondairement, ex vivo, sur des explants de placentas de premier et troisième trimestre. Dans ce dernier modèle, nous nous sommes intéressés au profil d’expression des cytokines inflammatoires induites par l’infection à CMVH. Nous avons ainsi testé des nouveaux inhibiteurs de la cyclooxygénase-2 in vitro. L’un d’entre eux, RG193, montre un effet synergique avec le maribavir et la baïcaléine, ce qui est prometteur pour d’éventuelles bithérapies. Concernant le modèle de culture ex vivo, nous avons pu démontrer la viabilité des explants et l’efficacité antivirale de diverses molécules sur l’infection à CMVH. Les résultats préliminaires sur l’expression des cytokines par les placentas infectés montrent des différences notables entre premier et troisième trimestre de grossesse. Cependant, les antiviraux testés semblent avoir peu d’impact sur la régulation des ARN messagers des cytokines pro-inflammatoires MCP-1, TNF-α, IP-10 suite à l’infection. / The human cytomegalovirus (HCMV) is a worldwide common virus involved in diseases in immunocompromised patients, and in congenital infection. Few treatments. Antiviral drugs are limited, not devoid of toxicity, and so cannot be administered to pregnant women. Moreover, they promote the emergence of resistance mutations. Development of new therapies is necessary, also a better understanding of the mechanisms of HCMV infection during pregnancy. In this work, we used different models of viral infection; first in vitro, in order to test new potential antiviral molecules targeting the cyclooxygenase 2 enzyme, which is involved in the inflammation process; secondly an ex vivo model, on first and third trimester placental explants. We also studied the expression profile of inflammatory cytokines induced by the HCMV infection in this model.We have tested new cyclooxygenase 2 inhibitors in vitro. Within them, RG193 shows a synergistic effect with the maribavir and baicalein, which is promising for potential dual therapy. Concerning the ex vivo culture model, we could demonstrate the viability of explants and antiviral efficacy of various molecules on HCMV infection. Preliminary results on the expression of cytokines in infected placentas show differences between first and third trimester of pregnancy. However, antiviral tested appear to have little impact on the regulation of proinflammatory cytokines MCP-1, TNF- α, IP-10 mRNA during infection.

Introdução. Nas últimas décadas o transplante renal se tornou a melhor opção terapêutica para a doença renal crônica terminal, oferecendo melhora na sobrevida e na qualidade de vida dos pacientes. No entanto, o uso obrigatório de medicamentos imunossupressores predispõe a uma variedade de episódios infecciosos, incluindo, entre as mais importantes, a infecção por citomegalovírus. O objetivo deste estudo é avaliar os métodos diagnósticos para infecção ativa por Citomegalovírus, a antigenemia pp65 e a PCR qualitativa, identificando assim a melhor correlação clinicolaboratorial. Métodos. Estudo de coorte prospectiva, desenvolvido no Serviço de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) utilizando-se amostras de pacientes submetidos a transplante renal no HCPA. A monitorização de infecção por Citomegalovírus foi realizada pelos testes da antigenemia PP-65, PCR qualitativo e PCR quantitativo. Resultados. Antigenemia pp-65 mostrou-se mais útil na monitorização de infecção ativa por citomegalovírus do que PCR qualitativa. Houve correlação significativa entre o desenvolvimento de infecção ativa diagnosticada por antigenemia pp-65 e transplantes realizados entre doador e receptor com sorologia IgG específica para Citomegalovírus positiva, terapia de indução com anticorpos anti-receptor de Interleucina-2 e o uso de terapia profilática e entre infecção ativa diagnosticada por PCR qualitativa e sorologias positivas do doador e do receptor e com uso de profilaxia. Conclusão. Ambos os métodos são úteis para diagnóstico da infecção ativa por CMV. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer a melhor correlação clínico-laboratorial em pacientes transplantados renais. A quantificação do DNA viral através dos métodos de PCR quantitativa pode oferecer alternativa útil neste sentido. / Background. In the last decades renal transplantation has became the most effective therapy for end-stage renal diseases offering better survival and quality of life. However, the use of immunosuppressive agents may predispose to a variety of infections including, among the most important, cytomegalovirus infection. The objective of the present study is to evaluate pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR as diagnostic methods for active CMV disease. Methods. This is a prospective cohort study enrolling patients that received a kidney transplant at Hospital de Clínicas de Porto Alegre who where monitored for CMV active infection with pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR over the post-transplant follow-up. Results. The use of pp65 antigenemia is a more useful method for the diagnosis of active CMV disease. A positive correlation was found between active infection as measured by pp65 cytomegalovirus antigenemia and pre-transplant IgG CMV serology, induction therapy, use of IL-2 receptor antibodies, gancyclovir prophylaxis. PCR diagnosis correlated with donor and recipient CMV IgG serology and gancyclovir prophylaxis. Conclusions. Both methods are useful for the diagnosis of active CMV disease. However, more studies seems to be necessary to establish the best clinical and laboratory correlation. Quantitative CMV PCR may offer a useful alternative in this clinical scenario.

Submitted by CHRISTIANE AKEMI KOJIMA (christianekojima@yahoo.com.br) on 2016-04-26T01:07:31Z No. of bitstreams: 1 Transplante Idoso Eficacia FINAL 4.doc-4-2.pdf: 1554211 bytes, checksum: a54e7e2f51f5bb432e6541f5b4c32f4d (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-26T14:15:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kojima_ca_me_bot.pdf: 1554211 bytes, checksum: a54e7e2f51f5bb432e6541f5b4c32f4d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T14:15:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kojima_ca_me_bot.pdf: 1554211 bytes, checksum: a54e7e2f51f5bb432e6541f5b4c32f4d (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Introdução: O transplante renal é considerado uma opção de terapia renal substitutiva segura para pacientes acima de 60 anos, entretanto, não há consenso sobre o melhor esquema imunossupressor para o paciente transplantado renal idoso. Objetivo: Avaliar a eficácia e segurança da combinação de tacrolimus e sirolimus em doses reduzidas comparada com a associação tacrolimus e micofenolato. Métodos: Estudo prospectivo randomizado de centro único comparando a combinação de tacrolimus e sirolimus em dose reduzida (grupo sirolimus) contra tacrolimus e micofenolato (grupo micofenolato). Foram incluídos todos os pacientes transplantados renais maiores de 60 anos. Foram avaliadas a sobrevida do paciente e enxerto, taxas de rejeição, função renal e incidência de infecção por citomegalovírus (CMV) em 12 meses de seguimento. Resultados: Foram randomizados 46 pacientes e analisados 44 casos (dois casos excluídos por não terem sido transplantados). As características basais dos grupos foram semelhantes sendo todos os casos transplantados com doador falecido e a maioria induzida com basiliximabe. O grupo micofenolato (n=23) e o grupo sirolimus (n=21) apresentaram sobrevida do paciente e enxerto censurado óbito respectivamente de 95,7% e 100% para o micofenolato e 79,6% e 90,5% para o sirolimus sem diferenças estatísticas. A incidência de rejeição e função renal ao longo de 12 meses foi semelhante entre os grupos. A infecção de ferida operatória, retardo de função do enxerto e proteinúria foram semelhantes entre os grupos. O colesterol total e HDL colesterol foram maiores no grupo sirolimus. A infecção por CMV ocorreu em 60,9% no grupo micofenolato e 16,7% no grupo sirolimus apresentando um risco relativo 3,54 [1,2 – 10,3] vezes maior no grupo micofenolato, p=0,004. Conclusão: No grupo de transplantados renais idosos a combinação de tacrolimus e sirolimus em doses reduzidas foi segura mantendo taxas semelhantes de função renal em 12 meses, rejeição e sobrevida do enxerto e paciente. As principais complicações associadas ao sirolimus foram semelhantes com exceção de maiores taxas de colesterol total. A incidência de CMV foi significativamente menor no grupo sirolimus. / Introduction: Renal transplantation is considered safe for patients over 60 years, however, there is no consensus on the best immunosuppressive regimen in elderly. Objective: To evaluate the combination of tacrolimus and sirolimus in reduced dose in renal function comparing the combination tacrolimus and mycophenolate. Methods: A single-center prospective randomized study comparing the combination of tacrolimus and sirolimus in reduced dose (sirolimus group) against tacrolimus and mycophenolate (mycophenolate group). We included all kidney transplant patients over 60 years of age. We evaluated patient survival, biopsy prove acute rejection, renal function and incidence of cytomegalovirus (CMV) at 12 months of follow-up. Results: 46 patients were randomized and we analyzed 44 cases (two cases excluded because they were not transplanted). Baseline characteristics were similar between groups, all patients were transplanted with deceased donor, and the majority were induced with basiliximab. Mycophenolate group (n = 23) and sirolimus group (n = 21) had patient survival, and death censored graft survival respectively 95.7% and 100% for mycophenolate and 79.6% and 90.5% for the sirolimus without statistical differences. The incidence of acute rejection and kidney function over 12 months was similar between the groups. Infection of the surgical wound, delayed graft function and proteinuria were similar between groups. The total cholesterol and HDL cholesterol were higher in the sirolimus group. CMV infection occurred in 60.9% and 16.7% in mycophenolate and sirolimus group respectively. The relative risk of CMV were 3.54 [1, 2 - 10.3] times greater in mycophenolate group, p=0.004. Conclusion: In the sample of elderly kidney transplant combining tacrolimus and sirolimus in low doses was safe keeping similar rates of renal function at 12 months, rejection and graft survival. The main complications associated with sirolimus were similar except for a higher total cholesterol rates. The incidence of CMV was significantly lower in the sirolimus group.

Submitted by Rita de Cassia Siqueira Bruder (bruder.28@hotmail.com) on 2018-03-22T13:20:34Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO 2018.pdf: 1906745 bytes, checksum: 78920ae0ca10dab6eec3900df2039470 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-23T19:14:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bruder_rcs_dr_bot.pdf: 1906745 bytes, checksum: 78920ae0ca10dab6eec3900df2039470 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T19:14:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bruder_rcs_dr_bot.pdf: 1906745 bytes, checksum: 78920ae0ca10dab6eec3900df2039470 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / RESUMO Bruder R. Redução da Incidência de Citomegalovírus no esquema Sirolimo associado à Tacrolimo em paciente idoso transplantado renal. Tese (Doutorado). Faculdade de Medicina de Botucatu. Universidade Estadual Paulista, 2018. Introdução: O transplante renal é considerado uma opção de terapia renal substitutiva segura para pacientes acima de 60 anos, entretanto, não há consenso sobre o melhor esquema imunossupressor para o paciente transplantado renal idoso. Objetivo: Avaliar a incidência de infecção por citomegalovírus na combinação de tacrolimo e sirolimo em doses reduzidas comparada com a associação tacrolimo e micofenolato. Métodos: Estudo prospectivo randomizado de centro único comparando a combinação de tacrolimo e sirolimo em dose reduzida (grupo sirolimo) contra tacrolimo e micofenolato (grupo micofenolato). Foram incluídos todos os pacientes transplantados renais maiores de 60 anos. Foram avaliadas a incidência de infecção por citomegalovírus (CMV), a sobrevida do paciente e enxerto, taxas de rejeição e função renal em 12 meses de seguimento. Resultados: Foram randomizados 46 pacientes e analisados 44 casos (dois casos excluídos por não terem sido transplantados). As características basais dos grupos foram semelhantes sendo todos os casos transplantados com doador falecido e a maioria induzida com basiliximab. O grupo micofenolato (n=23) e o grupo sirolimo (n=21) apresentaram sobrevida do paciente e enxerto censurado óbito respectivamente de 95,7% e 100% para o micofenolato e 87,3% e 90,5% para o sirolimo sem diferenças estatísticas. A infecção por CMV ocorreu em 60,9% no grupo micofenolato e 16,7% no grupo sirolimo apresentando um risco relativo 3,54 [1,2 – 10,3] vezes maior no grupo micofenolato, p=0,004. A incidência de rejeição e função renal ao longo de 12 meses foi semelhante entre os grupos. A infecção de ferida operatória, retardo de função do enxerto e proteinúria foram semelhantes entre os grupos. O colesterol total e HDL colesterol foram maiores no grupo sirolimo. Conclusão: No grupo de transplantados renais idosos a combinação de tacrolimo e sirolimo em doses reduzidas resultou na redução de 40% da incidência de infecção por CMV. A função renal em 12 meses, taxa de rejeição e sobrevida do enxerto e paciente foram semelhantes. / ABSTRACT Bruder R. Reduced incidence of cytomegalovirus in the Sirolimus associated with tacrolimus in elderly kidney transplant patient. Tese (Doutorado). Faculdade de Medicina de Botucatu. Universidade Estadual Paulista, 2018. Introduction: Renal transplantation is considered safe for patients over 60 years, however, there is no consensus on the best immunosuppressive regimen in elderly. Objective: To evaluate the incidence of cytomegalovirus infection in the combination of tacrolimus and sirolimus in reduced doses compared to the combination tacrolimus and mycophenolate. Methods: A single-center prospective randomized study comparing the combination of tacrolimo and sirolimo in reduced dose (sirolimo group) against tacrolimo and mycophenolate (mycophenolate group). We included all kidney transplant patients over 60 years of age. The incidence of cytomegalovirus (CMV) infection, patient survival and graft, rejection rates and renal function were evaluated at 12 months of follow-up. Results: 46 patients were randomized and we analyzed 44 cases (two cases excluded because they were not transplanted). Baseline characteristics were similar between groups, all patients were transplanted with deceased donor, and the majority were induced with basiliximab. Mycophenolate group (n = 23) and sirolimo group (n = 21) had patient survival, and death censored graft survival respectively 95.7% and 100% for mycophenolate and 87,3% e 90,5% for the sirolimo without statistical differences. The incidence of CMV infection occurred in 60.9% and 16.7% in mycophenolate and sirolimo group respectively. The relative risk of CMV were 3.54 [1, 2 - 10.3] times greater in mycophenolate group, p=0.004. The incidence of acute rejection and kidney function over 12 months was similar between the groups. Infection of the surgical wound, delayed graft function and proteinuria were similar between groups. The total cholesterol and HDL cholesterol were higher in the sirolimo group. Conclusion: In the elderly renal transplant group, the combination of tacrolimus and sirolimus at reduced doses resulted in a 40% reduction in the incidence of CMV infection. Renal function at 12 months, rejection rate and graft and patient survival were similar.

Objetivo: comparar a profilaxia universal com a terapia preemptiva com ganciclovir endovenoso no manejo da citomegalovirose em pacientes transplantados de pulmão em uma coorte retrospectiva. Metodologia: de março de 1999 a dezembro de 2009 foram estudados, no Serviço de Transplante do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, todos os pacientes submetidos a transplante pulmonar, procurando-se verificar a ocorrência de citomegalovirose relacionada ao tipo de tratamento profilático anti-viral utilizado (universal e preemptiva). Foram excluídos, em ambos os grupos, os pacientes nos quais não tivesse sido registrada a antigenemia no primeiro mês após o transplante, e os que foram a óbito dentro dos primeiros trinta dias após a cirurgia. Resultados: de 224 pacientes transplantados no período referido, 66 (29,5%) foram excluídos por óbito precoce. Os 158 pacientes que entraram no estudo tinham idade de 51±15 anos (7 anoa-71 anos), e 61,0% eram do sexo masculino; 150 (95%) receberam o órgão de doador cadavérico, e 134 (85,0%) foram submetidos a transplante unilateral. A profilaxia universal para citomegalovirus (CMV) foi realizada em 70 pacientes (44,0%) e a terapia preemptiva em 88 (56,0%). O grupo que recebeu profilaxia universal levou maior tempo para positivar o exame (p<0.001) comparado com o grupo que não a recebeu. Houve associação significativa entre profilaxia e antigenemia positiva no primeiro ano após o transplante (p=0.024). A mortalidade no primeiro e no quinto ano foi respectivamente de 20% e 50%. A sobrevida mediana do grupo com profilaxia universal foi 3.8 anos (IC95% de 2.5 a 5.0) e o grupo com terapia preemptiva de 4,3 anos (IC95% de 2.5 a 6.0), não apresentando diferença significativa. Conclusão: com base nos dados obtidos neste estudo a profilaxia universal e a terapia preemptiva demonstraram-se seguras e efetivas, entretanto os achados desta pesquisa não se demonstraram conclusivos para definir a melhor opção terapêutica. / Objective: To compare the universal prophylaxis and preemptive therapy for the treatment of cytomegalovirus in lung transplant patients in a retrospective cohort. Method: Performed at the Lung Transplant service in Santa Casa de Porto Alegre during the period from March 1999 to December 2009, upon reviewing the records and results of cytomegalovirus detection. Were excluded in both groups the patients who were not registered antigenemia in the first month after lung transplantation, due to death during this period. Results: 224 patients transplanted during the study period, 66 patients were excluded due to death within 30 days after transplantation. Mean age of patients was 51 ± 15 years old, 61.0% were men, 95.0% received organ of cadaveric donors, 85.0% were submited to unilateral transplant. The universal prophylaxis was performed in 44.0% of patients and preemptive therapy in 56.0%. The group receiving prophylaxis universal took longer to make positive antigenemia (p <0.001) when compared with the group not receiving prophylaxis. It was observed significant association between positive antigenemia and prophylaxis in the first year after transplantation (p = 0.024). The general mortality in the first and fifth year was 20.0% and 50.0% respectively. Survival of patients with prophylaxis presented a median of 3.8 (95% CI 2,5 to 5.0) years and the group that received no prophylaxis had a survival of 4,3 years (95% CI 2.5 to 6.0). Conclusion: Based on the data obtained in this study universal prophylaxis and preemptive therapy demonstrated to be safe and effective, however the findings of this research did not prove conclusive to determine the best treatment.

Introdução. Nas últimas décadas o transplante renal se tornou a melhor opção terapêutica para a doença renal crônica terminal, oferecendo melhora na sobrevida e na qualidade de vida dos pacientes. No entanto, o uso obrigatório de medicamentos imunossupressores predispõe a uma variedade de episódios infecciosos, incluindo, entre as mais importantes, a infecção por citomegalovírus. O objetivo deste estudo é avaliar os métodos diagnósticos para infecção ativa por Citomegalovírus, a antigenemia pp65 e a PCR qualitativa, identificando assim a melhor correlação clinicolaboratorial. Métodos. Estudo de coorte prospectiva, desenvolvido no Serviço de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) utilizando-se amostras de pacientes submetidos a transplante renal no HCPA. A monitorização de infecção por Citomegalovírus foi realizada pelos testes da antigenemia PP-65, PCR qualitativo e PCR quantitativo. Resultados. Antigenemia pp-65 mostrou-se mais útil na monitorização de infecção ativa por citomegalovírus do que PCR qualitativa. Houve correlação significativa entre o desenvolvimento de infecção ativa diagnosticada por antigenemia pp-65 e transplantes realizados entre doador e receptor com sorologia IgG específica para Citomegalovírus positiva, terapia de indução com anticorpos anti-receptor de Interleucina-2 e o uso de terapia profilática e entre infecção ativa diagnosticada por PCR qualitativa e sorologias positivas do doador e do receptor e com uso de profilaxia. Conclusão. Ambos os métodos são úteis para diagnóstico da infecção ativa por CMV. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer a melhor correlação clínico-laboratorial em pacientes transplantados renais. A quantificação do DNA viral através dos métodos de PCR quantitativa pode oferecer alternativa útil neste sentido. / Background. In the last decades renal transplantation has became the most effective therapy for end-stage renal diseases offering better survival and quality of life. However, the use of immunosuppressive agents may predispose to a variety of infections including, among the most important, cytomegalovirus infection. The objective of the present study is to evaluate pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR as diagnostic methods for active CMV disease. Methods. This is a prospective cohort study enrolling patients that received a kidney transplant at Hospital de Clínicas de Porto Alegre who where monitored for CMV active infection with pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR over the post-transplant follow-up. Results. The use of pp65 antigenemia is a more useful method for the diagnosis of active CMV disease. A positive correlation was found between active infection as measured by pp65 cytomegalovirus antigenemia and pre-transplant IgG CMV serology, induction therapy, use of IL-2 receptor antibodies, gancyclovir prophylaxis. PCR diagnosis correlated with donor and recipient CMV IgG serology and gancyclovir prophylaxis. Conclusions. Both methods are useful for the diagnosis of active CMV disease. However, more studies seems to be necessary to establish the best clinical and laboratory correlation. Quantitative CMV PCR may offer a useful alternative in this clinical scenario.

Introdução. Nas últimas décadas o transplante renal se tornou a melhor opção terapêutica para a doença renal crônica terminal, oferecendo melhora na sobrevida e na qualidade de vida dos pacientes. No entanto, o uso obrigatório de medicamentos imunossupressores predispõe a uma variedade de episódios infecciosos, incluindo, entre as mais importantes, a infecção por citomegalovírus. O objetivo deste estudo é avaliar os métodos diagnósticos para infecção ativa por Citomegalovírus, a antigenemia pp65 e a PCR qualitativa, identificando assim a melhor correlação clinicolaboratorial. Métodos. Estudo de coorte prospectiva, desenvolvido no Serviço de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) utilizando-se amostras de pacientes submetidos a transplante renal no HCPA. A monitorização de infecção por Citomegalovírus foi realizada pelos testes da antigenemia PP-65, PCR qualitativo e PCR quantitativo. Resultados. Antigenemia pp-65 mostrou-se mais útil na monitorização de infecção ativa por citomegalovírus do que PCR qualitativa. Houve correlação significativa entre o desenvolvimento de infecção ativa diagnosticada por antigenemia pp-65 e transplantes realizados entre doador e receptor com sorologia IgG específica para Citomegalovírus positiva, terapia de indução com anticorpos anti-receptor de Interleucina-2 e o uso de terapia profilática e entre infecção ativa diagnosticada por PCR qualitativa e sorologias positivas do doador e do receptor e com uso de profilaxia. Conclusão. Ambos os métodos são úteis para diagnóstico da infecção ativa por CMV. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer a melhor correlação clínico-laboratorial em pacientes transplantados renais. A quantificação do DNA viral através dos métodos de PCR quantitativa pode oferecer alternativa útil neste sentido. / Background. In the last decades renal transplantation has became the most effective therapy for end-stage renal diseases offering better survival and quality of life. However, the use of immunosuppressive agents may predispose to a variety of infections including, among the most important, cytomegalovirus infection. The objective of the present study is to evaluate pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR as diagnostic methods for active CMV disease. Methods. This is a prospective cohort study enrolling patients that received a kidney transplant at Hospital de Clínicas de Porto Alegre who where monitored for CMV active infection with pp65 cytomegalovirus antigenemia and qualitative PCR over the post-transplant follow-up. Results. The use of pp65 antigenemia is a more useful method for the diagnosis of active CMV disease. A positive correlation was found between active infection as measured by pp65 cytomegalovirus antigenemia and pre-transplant IgG CMV serology, induction therapy, use of IL-2 receptor antibodies, gancyclovir prophylaxis. PCR diagnosis correlated with donor and recipient CMV IgG serology and gancyclovir prophylaxis. Conclusions. Both methods are useful for the diagnosis of active CMV disease. However, more studies seems to be necessary to establish the best clinical and laboratory correlation. Quantitative CMV PCR may offer a useful alternative in this clinical scenario.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Carlan da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / A relação entre a presença do Citomegalovírus Humano (HCMV) e diversos tipos de tumores tem sido alvo de investigação por décadas, e em especial, em Glioblastoma Multiforme (GBM). O GBM é o mais maligno tumor do Sistema Nervoso Central (SNC), com baixa sobrevida mesmo após o tratamento. Nosso grupo e outros demonstraram a presença do HCMV neste tipo de tumor restrita a uma pequena quantidade de células, além disso, vários mecanismos de aumento de malignidade tumoral mediados pelo HCMV já foram demonstrados in vitro e in vivo. As principais drogas utilizadas durante o tratamento quimioterápico, Temozolamida (TMZ) e Carmustina (BCNU), levam a adição de adutos no DNA, criando erros durante a replicação celular. Estudos demonstram que o HCMV pode modular vias de reparo de DNA em fibroblastos, entretanto, o possível efeito durante a quimioterapia não é conhecido. Com isto, neste trabalho avaliou-se a infecção viral de linhagens celulares de GBM bem como a resposta das mesmas ao tratamento com TMZ e BCNU. Demonstrou-se que linhagens de GBM U87MG, A172, U251MG e TP365MG são suscetíveis a infecção por HCMV, mas não igualmente permissíveis as linhagens virais laboratoriais (AD169) e clínica (TB40), provavelmente refletindo a infectividade do vírus nos tumores. Observou-se também uma diminuição na viabilidade celular nas linhagens TP365MG e U251MG infectadas com HCMV, de maneira dependente da multiplicidade de infecção (MOI). Na presença concomitante de drogas e vírus também ocorre a diminuição de viabilidade MOI dependente, especificamente em TP365MG tratada com BCNU. Em suma, os resultados indicam que a permissibilidade do HCMV em células de GBM é determinada por fatores celulares/hospedeiro e não por fatores virais. Por fim, o vírus também não aumenta a resistência ao tratamento por TMZ e BCNU em linhagens U251MG e TP365MG, entretanto, devido a heterogeneidade tumoral mais estudos são necessários em outros tipos celulares, especialmente em células tronco tumorais, levando a um melhor entendimento do possível efeito do vírus durante o tratamento quimioterápico / The relationship between the Human Cytomegalovirus (HCMV) and different types of tumors has been investigated for many decades, especially in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most malignant tumor of the Nervous Central System (SNC), with a low overall survival even after treatment. We and others demonstrated the presence of HCMV in this type of tumor, restricted to a small number of cells, and various studies showed that the virus can increase cell malignancy both in vitro and in vivo. The chemotherapeutic agents Temozolomide (TMZ) and Carmustine (BCNU) used in GBM treatment lead to insertion of adducts in the DNA, creating errors during replication. It is well known that HCMV can modulate DNA repair pathways in fibroblasts, however, the possible effect of the virus during chemotherapy is not known. In this work we analyzed viral infection in GBM cell lines and their response to the TMZ and BCNU. We demonstrated that A172, U251MG and TP365MG GBM cell lines are susceptible to HCMV infection, but not equally permissive to both laboratory (AD169) and clinical strains (TB40), likely reflecting infection in the tumor. Additionally, we show a decrease in cell viability in TP365MG and U251MG infected with HCMV, in a MOI dependent manner. In infected and treated with chemotherapeutic drugs cells, there is also a reduction in cell viability MOI dependent in TP365MG treated with BCNU. Overall our results indicate that HCMV permissiveness in GBM cells is determined by host/cellular rather than viral factors and that the virus does not increase cell resistance to chemotherapeutic drugs in U251MG and TP365MG. Due to the tumor heterogeneity, more studies need to be performed in other tumor cells, especially in cancer stem cells, to lead to a better understanding of the possible effect of the virus during chemotherapy.