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This work is part of a project focused on the study of the variability of human cytomegalovirus (HCMV) among clinical isolates with the aim to map the geographical distribution of HCMV genotypes, reveal the relationships between genotypes and the severity of HCMV-associated diseases, and identify regions in the HCMV genome with a potential for use as diagnostic and therapeutic targets. Attention was paid to the development of the methodology for the preparation of the material for next-generation sequencing (NGS) from HCMV clinical isolates and evaluation of the obtained sequencing data. Blood and urine samples collected from hematopoietic stem cell transplantat recipients and congenitally infected children were analyzed. Samples suitable for NGS were sequenced by the Illumina platform and sequences were created by de novo assembly followed by mapping assembly. Urine samples in comparison to blood samples had higher yield of material for NGS. Of the samples positive for HCMV DNA (7 of 50) after amplification in the cell cultures, only one sample had high purity of the viral DNA (98%) while six samples had purity of less than 7%. The sample containing 98% of the viral DNA was fully sequenced and the sequence was compared to the sequences of other clinical isolates from Belgium in 11 polymorphic...

Les nouveau-nés et les jeunes enfants ont une susceptibilité plus élevée aux infections par rapport aux enfants plus âgés et aux adultes. Cette caractéristique est en partie attribuée à l’immaturité de leur système immunitaire qui est associée à une capacité limitée à développer des réponses immunitaires à médiation cellulaire. L’infection par le cytomégalovirus (HCMV) est la cause la plus fréquente d’infection congénitale chez l’Homme et une cause majeure de surdité et de retard mental. En Belgique, le dépistage anténatal de l’infection primaire par le HCMV chez les femmes enceintes offre l’opportunité d’étudier les réponses immunitaires du foetus à ce virus et de les comparer à celles de leur maman.<p>Les lymphocytes T CD4+ Th1 et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques jouent un rôle crucial dans le contrôle des pathogènes intracellulaires dont le HCMV fait partie. La littérature montre une capacité limitée des enfants congénitalement infectés par le HCMV à développer des réponses T CD4+ spécifiques du HCMV. En contraste, des réponses de lymphocytes T CD8+ spécifiques du HCMV ont été rapportées chez des enfants infectés in utero, mais ces réponses n’ont pas été comparées en détails à celles de l’adulte. De plus, notre connaissance des réponses T spécifiques du HCMV durant l’infection primaire par ce virus est limitée. Des études antérieures ont rapporté un défaut de prolifération et de production d’IL-2 des lymphocytes T spécifiques du HCMV chez des adultes avec durant la phase primaire de l’infection, mais les mécanismes restent non-élucidés.<p>Nous avons caractérisé les réponses de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques du HCMV provenant du sang de cordon de nouveau-nés congénitalement infectés par le HCMV, et nous avons comparé ces réponses à celles de leurs mamans diagnostiquées avec une infection primaire par le HCMV durant la grossesse. En plus, nous avons comparé les réponses T CD4+ et CD8+ de ces mamans à celles d’adultes infectés chroniquement par le virus. Chez les nouveau-nés, nous avons démontré que des lymphocytes T CD4+ de sang de cordon exprimant un phénotype de différentiation spécifique du HCMV (CD27-CD28-) ainsi qu’un phénotype Th1 similaire à celui des cellules maternelles étaient induits in utero lors de l’infection congénitale par le HCMV. De plus, la détection d’expansions oligoclonales suggérait fortement une expansion antigène-spécifique de ces cellules. Cependant, les T CD4+ de nouveau-nés présentaient une capacité fortement réduite à produire des cytokines anti-virales (IFN-γ, TNF-α et MIP-1β) en réponse à une stimulation ex vivo avec les antigènes du HCMV, par rapport aux cellules maternelles. Les lymphocytes T (CD27-CD28-) CD4+ de nouveau-nés produisaient également des niveaux plus bas de cytokines antivirales en réponse à des stimulations polyclonales avec l’anti-CD3 et la PMA/ionomycine, suggérant des altérations en amont et en aval de la voie de signalisation du TCR. Nos résultats suggèrent que ces altérations pourraient impliquer la diminution de l’expression de molécules impliquées dans cette voie de signalisation. De la même manière, nous<p>avons montré que chez le nouveau-né, la fonction des T CD8+ spécifiques du HCMV était altérée par rapport à celle de l’adulte. Nous avons observé des proportions similaires de T CD8+ (CD27-CD28-) chez les nouveau-nés et les adultes. De plus, l’analyse du répertoire du TCR Vβ de ces cellules par séquençage haut-débit a révélé une capacité similaire à générer un répertoire T diversifié dans les deux groupes. Comme rapporté précédemment, nous avons détecté des fréquences similaires de lymphocytes T CD8+ spécifiques pour l’antigène immunodominant pp65. Cependant, lorsque les stimulations ont été étendues à d’autres antigènes du HCMV, nous avons observé que le répertoire antigénique reconnu par ces cellules était significativement réduit chez les nouveau-nés, en association avec une diminution de la polyfonctionalité et de la production de cytokines par cellule.<p>Nous avons également montré que, dans une moindre mesure, la fonction des lymphocytes T spécifiques du HCMV était diminuée durant l’infection primaire chez l’adulte. Comme reporté précédemment, les T CD4+ spécifiques du HCMV proliféraient moins et produisaient moins d’IL-2 par rapport à des individus dans la phase chronique de l’infection. Ce défaut de production d’IL-2 affectait à la fois les populations de cellules CD28+ et CD28-, montrant que l’accumulation de lymphocytes T CD4+ ayant perdu l’expression de la molécule CD28 (un signal de co-stimulation important pour la production d’IL-2) est seulement un des facteurs contribuant à la diminution de la production d’IL-2 par les cellules spécifiques du HCMV. En accord avec cette observation, nous avons montré une diminution de la production par cellule d’IFN-γ et de TNF-α touchant également à la fois les populations de T CD4+ CD28+ et CD28- durant la phase primaire de l’infection, un défaut associé avec une avidité fonctionnelle diminuée de ces cellules. De la même manière, la polyfonctionalité et la production de cytokines par cellule des lymphocytes T CD8+ spécifiques du HCMV étaient également diminuées chez les adultes durant la phase d’infection primaire.<p>En résumé, nos résultats montrent que la fonction des lymphocytes T spécifiques du HCMV de nouveau-nés et d’adultes est altérée durant l’infection primaire par rapport à des individus infectés chroniquement par le virus. Nous montrons que cette régulation fonctionnelle ressemble à l’exhaustion fonctionnelle des lymphocytes T observée durant les infections virales chroniques associées à des charges virales élevées. L’infection primaire par le HCMV est caractérisée par une réplication virale intense qui dure pendant plusieurs mois suivant l’infection. Nous émettons l’hypothèse que les hauts taux de réplication virale observés durant l’infection congénitale et chez l’adulte durant l’infection primaire par le HCMV pourraient interférer avec certaines fonctions des lymphocytes T./Neonates and young infants have a higher susceptibility to infections compared to older infants or adults. This feature is in part attributed to the immaturity of their immune system associated with a limited capacity to mount cellular-mediated immune responses. Congenital human cytomegalovirus (HCMV) infection is the most common cause of congenital infection worldwide and a major cause of hearing loss and mental retardation. In Belgium, antenatal screening of pregnant women for primary HCMV infection offers an opportunity to study neonatal immune responses to the virus and to compare them to those of their mother.<p>T lymphocytes are major players of the immune system. In particular, Th1 CD4+ T cells and CD8+ cytotoxic T cells play a crucial role in the control of intracellular pathogens, including HCMV infection. Previous literature has reported a limited capacity of infants born with congenital HCMV infection to mount HCMV-specific CD4+ T cell responses. In contrast, fetal antigen-specific CD8+ T cell responses have been reported following in utero HCMV infection, but these responses have not been compared in detail to those of adults with primary infection. In addition, our knowledge regarding adult HCMV-specific T cell responses during primary HCMV infection is limited. Previous studies have reported defective T cell proliferation and IL-2 production in adults with primary HCMV infection, showing that some of the T cell functions are altered during primary infection.<p>In this study, we have characterized neonatal HCMV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses from the cord blood of newborns with congenital HCMV infection, and we have compared these responses to that of their mothers diagnosed with primary HCMV infection during pregnancy. Also, we compared CD4+ and CD8+ T cell responses of adults with primary HCMV infection to that of adults with chronic infection.<p>In newborns, it was not known if the defective CD4+ T cell responses could be attributed to the absence of HCMV-specific cells or to the induction of dysfunctional cells. We demonstrate that neonatal CD4+ T cells with a differentiation phenotype typical of HCMV infection (CD27-CD28-) and expressing a Th1 phenotype similar to that of maternal cells can differentiate in utero following HCMV infection. In addition, the detection of oligoclonal expansions by spectratyping and flow cytometry analyses strongly suggests antigen-specific responses. However, neonatal CD4+ T cells were markedly less able to produce antiviral cytokines (IFN-γ, TNF-α and MIP-1β) following ex vivo stimulation with HCMV antigens, compared to maternal cells. Also, neonatal CD27-CD28- CD4+ T cells produce lower levels of antiviral cytokines in response to polyclonal stimulations with anti-CD3 and PMA/ionomycin, suggesting alterations up-stream and down-stream of the TCR signaling pathway. Our results suggest that these alterations could involve the down-regulation of the expression of molecules that are part of the TCR signaling pathway. Similarly, we show that the function of<p>neonatal HCMV-specific CD8+ T cells is impaired compared to adults. Similar proportions of (CD27-CD28-) CD8+ T cells, typical of HCMV infection, were detected in newborns and adults. Analysis of the TCR Vβ repertoire of neonatal and maternal (CD27-CD28-) CD8+ T cells by high-throughput sequencing revealed a similar capacity to generate a diverse clonal repertoire. As previously reported, we detected similar frequencies of HCMV-specific CD8+ T cells specific for the immunodominant viral antigen pp65. However, when extending ex vivo stimulations to other HCMV antigens, we observed that the antigenic repertoire recognized by these cells was significantly reduced in newborns. In addition, neonatal CD8+ T cells had a reduced polyfunctionality and per cell cytokine production.<p>To a lower extent, the function of adult HCMV-specific T cells was also impaired during primary infection. As previously reported, maternal HCMV-specific CD4+ T cells were markedly less able to produce IL-2 and to proliferate compared to individuals in the chronic stage of the disease. Both CD28+ and CD28- T cell subsets produced decreased levels of IL-2. This observation shows that the accumulation of HCMV-specific CD4+ T cells having lost the expression of the CD28 molecule (an important co-stimulatory signal for IL-2 production) during primary infection is only one of the factors contributing to the decreased IL-2 production. Accordingly, both CD28+ and CD28- CD4+ T cell subsets had a decreased per cell production of IFN-γ and TNF-α during primary HCMV infection. This defect was associated with a lower functional avidity of these cells. Similarly, the polyfunctionality and per cell cytokine production of adult HCMV-specific CD8+ T cells was also impaired compared to adults with chronic infection.<p>Altogether, our results show that adult and neonatal HCMV-specific T cell responses are impaired during primary infection, compared to individuals with chronic infection. We show that this functional regulation resembles that of functional T cell exhaustion observed during chronic viral infections that are associated with high levels of viral replication. Primary HCMV infection is characterized by an intense viral replication lasting for several months post-infection. We hypothesize that the high levels of viral replication observed during congenital and adult primary HCMV infection could interfere with some of the T cell functions. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

MSc (Microbiology) / Department of Microbiology

Human cytomegalovirus (HCMV, Herpesviridae) can cause severe complications in the infected individuals undergoing hematopoietic stem cell transplantation. Nowadays, these patients are treated using antivirotics or HCMV-specific T cells derived from the seropositive graft donor. This study explored the possibility of redirecting HCMV-non-specific T cells from a seronegative donor towards HCMV-infected cells via chimeric antigen receptor (CAR), i.e. artificially designed T cell receptor. Viral glycoprotein B (gB) has been selected as a target for this receptor. Published sequence of a single chain variable fragment of a human antibody was used for the design of the CAR against gB (gBCAR). After the verification of production and surface localization in cell lines, gBCAR was being introduced into human T cells via lentiviral vectors. Human fetal lung fibroblasts (LEP) infected with HCMV were used as target cells after the expression of gB at their surface was demonstrated. gBCAR functionality was evaluated by the incubation of modified T cells with infected cells and subsequent analysis of media for IFNγ concentration, which was significantly higher in the setting of gBCAR T cells incubated with HCMV-LEP than in the control incubations. The results obtained show the specificity of gBCAR against...

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+. Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV. L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.

<p>Cytomegalovirus (CMV) is a widespread infection affecting 50-90% of the human population. A typical silent primary infection is followed by life-long persistence in the host under control by virus-specific CD8 (“killer”) and CD4 (“helper”) T cells. Although harmless in most people, CMV may cause disease and sequelae in patients with deficient cellular immunity, such as AIDS patients, recipients of organ transplants and children who have acquired the virus before birth. In this thesis we have characterized the cellular immunity to CMV in immunocompetent subjects, in patients receiving transplants and in infants.</p><p>In healthy individuals with latent CMV, the frequencies of CMV-specific CD8 T cells varied considerably between the donors. Within the same individual, the changes over time were usually small. In patients with primary, symptomatic CMV infection, the frequencies of CMV-specific CD8 T cells peaked within the first month after the appearance of symptoms. The frequencies then declined to levels similar to those in latently infected CMV carriers. The CD4 T-cell function followed the same pattern, but with lower peak values.</p><p>Immunosuppressed renal transplant patients with latent CMV had CMV-specific CD4 cell function similar to healthy controls. The frequencies of CMV-specific CD8 T cells were also comparable, but their function was impaired. When renal transplant recipients were investigated longitudinally, we found that their CMV-specific T cells decreased rapidly after transplantation. Whereas the frequencies and function of CD8 T cells rebounded within 3 months, CD4 T-cell recovery was impaired during the entire first year after transplantation.</p><p>Finally, the frequencies and function of CMV-specific T-cells were investigated in children with congenital and postnatal CMV. CMV-specific CD8 T cells could be detected in even the youngest children, suggesting that these cells can develop early in life. In contrast, CMV specific CD4 T cells were low or absent in the youngest children but increased slowly with age.</p>

Cytomegalovirus (CMV) is a significant cause of mortality and morbidity in immunocompromised patients and an important cause of birth defects if acquired in utero. The licensed CMV antivirals, ganciclovir, cidofovir and foscarnet, all target the viral DNA polymerase. For each drug prolonged use is associated with significant toxicities and development of drug resistance. None are approved for use during pregnancy. Therefore, development of new anti-CMV drugs that target different pathways would be beneficial. All herpesviruses encode an alkaline nuclease. That genetic disruption of the CMV alkaline nuclease, UL98, reduces CMV replication by 1,000-fold suggests that UL98 may be a useful target for development of novel anti-CMV drugs. Moreover, using herpes simplex virus type 1 Hsiang and Ho found that the anthraquinone emodin inhibits activity of the viral alkaline nuclease, blocks viral replication in cell culture, and reduces viral pathogeneses in a mouse model (Brit. J. of Pharm., 2008). Earlier studies also showed that anthraquinone derivatives including emodin have anti-CMV activity (Barnard et al., Antiviral Research 1992 & 1995), although the mechanism of CMV inhibition has not been further studied. We therefore sought to confirm the anti-CMV activities of emodin and related anthraquinone derivatives, to characterize their mechanisms of action, and to determine specifically if they act through inhibition of UL98. Using a luciferase-based CMV yield reduction assay emodin inhibited CMV replication (IC50 = 4.9 μM); however, that the TD50 for cytotoxicity (determined using an luciferase-based cell viability assay) was only 2-fold higher suggested that emodin may act non-specifically. Two additional anthraquinone derivatives (acid blue 40 and alizarin violet R) inhibited CMV only at high concentrations (IC50 = 238; 265 μM) that were also cytotoxic. Atanyl blue PRL, however, exhibited anti-CMV activity (IC50 = 6.3 μM) with low cytotoxicity (TD50 = 216 μM). Thus, characterization of atanyl blue PRL (impact on gene expression, GFP expression, viral spread, infectivity, time of addition studies, and inhibition of UL98 nuclease activity) should be informative. Atanyl blue PRL appears to block immediate-early gene expression and reduce early and late gene expression. Atanyl blue PRL also blocked GFP expression, reduced viral spread, and also lowered the infectivity of CMV. Finally, atanyl blue PRL inhibits UL98 alkaline nuclease activity at an IC50 of 5.7 μM. This suggests that atanyl blue PRL may inhibit CMV through inhibition of UL98. Thus, atanyl blue PRL represents a novel class of anti-herpesvirals and provides a lead structure for structure based drug discovery.

Avec une prévalence mondiale de 0,7%, l’infection in utero à cytomégalovirus (CMV) représente la première cause de handicap neurologique congénital d’origine infectieuse. Les modalités de prise en charge de cette infection restent débattues notamment en raison de l’absence de marqueurs pronostics fiables et d’inconnus sur sa physiopathologie notamment celle de l’atteinte du cerveau fœtal. Le premier objectif de notre travail était de décrire et valider des marqueurs immuno-virologiques prédictifs de la transmission verticale et de séquelles néonatales. Le deuxième objectif était d’étudier les corrélats immuno-virologiques in situ de la sévérité de l’atteinte du cerveau fœtal. Nous avons pu établir à partir du bilan virologique maternel (avidité des IgG et ADN CMV sanguin) un score de risque de transmission verticale du virus en cas de primo-infection maternelle. Nous avons montré que le niveau du réservoir viral fœtal, reflété par la charge virale dans le liquide amniotique et dans le sang fœtal, était un marqueur prédictif des séquelles néonatales. Ainsi, la combinaison de la mesure du réservoir viral fœtal avec l’imagerie fœtale a permis d’établir des scores pronostics avec des valeurs prédictives positives et négatives de 80 à 100% respectivement. Nous avons mis en évidence par immuno-histochimie couplée à une analyse quantitative d’images que la multiplication virale ainsi que la réponse immunitaire innée (cellules NK) et adaptative (CD8+ et plasmocytes) étaient significativement plus élevées dans les cerveaux fœtaux les plus sévèrement atteints. Ce résultat paradoxal nous a incité à quantifier la présence du marqueur PD-1 et celle de son récepteur PD-L1. PD-1 était significativement plus exprimé dans les cerveaux sévèrement atteints. L’analyse par cytométrie de flux montrait que PD-1 était exprimé par 96% des CD8+ mais aussi par plus de 70% des lymphocytes B et des cellules NK. Ces résultats témoignent de l’existence dans les cerveaux fœtaux infectés d’un épuisement immunitaire touchant la réponse adaptative mais aussi innée. Enfin, l’analyse par cytométrie de flux montrait la présence d’une réplication virale dans les différents types de cellules neuronales (cellules souches, neurones, astrocytes). En conclusion, les résultats de notre travail ont permis d’améliorer les algorithmes de prise en charge de l’infection à CMV in utero grâce à la validation de marqueurs prédictifs immuno-virologiques. Par ailleurs, le fait qu’un épuisement immunitaire et une forte multiplication virale soient associés à la sévérité de l’atteinte cérébrale est important pour l’élaboration de stratégies thérapeutiques in utero. / CMV congenital infection has a worldwide incidence estimated at about 0.7% of all life births and represents the major cause of neurological handicap of infectious origin. The management of this infection remains highly debated. Several factors contribute to this and among them are the absence of recognized prognostic markers and gaps in the knowledge of its pathogenicity particularly that of the fetal brain. The first objective of this work was to describe and validate immune and virological predictive markers of vertical transmission and of neonatal sequelae. The second objective was to study in situ immune and virological correlates of the severity of fetal brain infection. We first validated a model of materno-fetal transmission based on maternal virological results (IgG avidity and blood CMV DNA). We then showed that the viral reservoir level, estimated by the viral load in the amniotic fluid and the fetal blood, was a predictive marker of neonatal sequelae. Prognosis models combining quantification of the viral reservoir to fetal imaging allow to reach positive and negative predictive values up to 80% and 100% respectively. We showed using immunohistochemistry and quantitative image analysis that viral multiplication as well as both innate immune responses (NK cells) and adaptive immune responses (CD8+ and plasma cells) were significantly higher in the most severely infected fetal brains. This paradox drove us to quantify PD-1 and its receptor PD-L1, PD-1expression was significantly higher in severely affected fetal brains. Cytometry flow analysis evidenced that PD-1 was expressed in 95% of CD8+ cells but also in at least 70% of NK cells and of B cells. These results demonstrate immune exhaustion of both adaptive and innate responses in fetal infected brains. Finally, viral replication was evidenced in stem cells, neurons and mature astrocytes after separation by flow cytometry of these neuronal cell types. In conclusion, the validation of immune-virological markers obtained within this work has usefully improved the algorithms for the clinical management of in utero CMV infection. Moreover, the demonstration that immune exhaustion and high viral multiplication are responsible of severe fetal brain affection is important to elaborate in utero treatment strategies.