Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) est une intégrine centrale dans la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+ car elle permet la formation de la synapse immunologique avec les cellules cibles. La régulation de cette interaction cellulaire est contrôlée par la qualité de l'engagement de LFA-1 avec son ligand ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1). Un support clef au contrôle spatio-temporel de l'activation de LFA-1 est le cytosquelette d'actine corticale dans lequel est ancré LFA-1 par son domaine intracellulaire. Comment LFA-1 est organisée à la synapse immunologique et comment la coordination entre LFA-1 et cytosquelette d'actine s'opère de manière précise au sein des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont des questions non résolues. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier l'organisation précise de la distribution de LFA-1 à la synapse immunologique en relation avec l'actine corticale sous-jacente au contact entre lymphocytes T cytotoxiques et les cellules présentatrices d'antigènes. Pour ce faire, des approches de microscopies de super-résolution SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et TIRF (Total Internal Reflexion Fluorescence microscopy) ont été développées. Elles ont été appliquées à des lymphocytes T humains non transformés dérivés de contrôles sains et de patients atteints d'une immunodéficience congénitale, le Syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), caractérisé par un défaut de remodelage du cytosquelette d'actine à la synapse immunologique. L'emploi de l'approche de dSTORM en mode TIRF nous a permis de révéler que dans sa conformation activée, LFA-1 forme à la synapse une ceinture radiale composée de centaines de nano-clusters. L'intégrité du cytosquelette d'actine et notamment la protéine WASP s'avèrent importantes pour la formation de la ceinture de nano-clusters de LFA-1, comme le montre le défaut de formation de cette ceinture dans les lymphocytes de patients WAS. L'approche de SIM multi-couleur nous a permis de révéler le rôle de la ceinture de LFA-1 dans le confinement des granules lytiques. Par comparaison de marquages avec des anticorps spécifiques de différentes conformations de LFA-1, notre travail montre également que l'activation de LFA-1 s'opère de manière digitale, dans le sens où les nano-clusters fonctionnent comme des unités au sein desquelles l'activation de LFA-1 suit une loi du tout ou rien. En conclusion, ce travail de thèse démontre l'intérêt des approches de microscopie de super-résolution pour révéler des mécanismes clefs de l'activation des lymphocytes T et pour appréhender la nature des défauts à l'origine de dérèglements pathologiques de la fonction de ces cellules. / LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) is a central integrin in the function of cytotoxic CD8+ T lymphocytes since it allows the formation of the immunological synapse with target cells. The regulation of this cellular interaction is controlled by the quality of the engagement of LFA-1 with its ligand, ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule- 1). A key support for the spatio-temporal control of LFA-1 activation is the cortical actin cytoskeleton in which LFA-1 is anchored by its intracellular domain. How LFA-1 is organized at the immunological synapse and how the coordination between LFA-1 and actin cytoskeleton operates accurately within cytotoxic CD8+ T lymphocytes are unresolved issues. The aim of this thesis project was to study the precise organization of the LFA-1 distribution at the immunological synapse in relation to the cortical actin underlying the contact between cytotoxic T lymphocytes and target cells. For this purpose, super-resolution microscopy approaches, including SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) and TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) were developed. They were applied to untransformed human T lymphocytes derived from healthy donors and patients with a congenital immunodeficiency, the Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), characterized by actin cytoskeleton remodeling defects at the synapse. The use of the dSTORM approach revealed that activated LFA-1 forms a radial belt composed of hundreds of nanoclusters. The assembly of this belt depends on the integrity of the actin cytoskeleton, as shown by the impairment of this structure in the T lymphocytes derived from the WAS patients. The multi-color SIM approach allowed us to investigate the role of the LFA-1 belt in the confinement of lytic granules. Furthermore, the combination of staining with antibodies specific of LFA-1 conformation states shows that LFA-1 activation is a digital process, whereby nanoclusters operate as units in which LFA-1 activation follows an on / off rule. In conclusion, this PhD work exemplifies the great asset of super-resolution microscopy approaches to reveal key activation mechanisms in T lymphocytes and explore the nature of the defects causing pathological dysregulation of the function of these cells.

Le complexe Arp2/3 génère des réseaux d’actine branchés, qui produisent une forcée de poussée permettant à la cellule de remodeler ses membranes. Le complexe WASH active le complexe Arp2/3 à la surface des endosomes et facilite ainsi la scission membranaire des intermédiaires de transports contenants des récepteurs internalisés tels que les intégrines α5β1. De ce fait, le complexe WASH en favorisant le recyclage des intégrines, joue un rôle crucial dans l’invasion des cellules tumorales durant la progression tumorale. Cependant, le mécanisme d’assemblage du complexe WASH est inconnu. Dans cette étude, nous rapportons l’identification du premier facteur d’assemblage du complexe WASH. Nous avons identifié la protéine HSBP1 grâce à un crible des protéines qui se lient aux formes précurseurs des sous-unités mais plus au complexe une fois assemblé. La reconstitution biochimique et la modélisation moléculaire nous a permis de montrer que HSBP1 est associé avec le précurseur trimérique CCDC53, le dissocie et forme un hétérotrimère qui va éventuellement libérer une forme monomérique de CCDC53 pour l’assemblage du complexe WASH. Le rôle de HSBP1 dans l’assemblage du complexe WASH est conservé. En effet, WASH est déstabilisé dans des cellules mammaires par le knock-down de HSBP1 et dans l’amibe Dictyostelium par le knock-out de HSBP1. La déstabilisation du complexe WASH par le knock-out de HSBP1 phénocopie la déplétion de WASH dans l’amibe Dictyostelium. Dans des cellules humaines de carcinomes mammaires l’inhibition de l’expression de HSBP1 altère le recyclage des intégrines à la membrane plasmidique. Il en résulte des adhésions focales défectueuses et des capacités invasives réduites. De plus, HSBP1 est localisé aux centrosomes et est requis pour la polarité des cellules lors de la migration. Enfin, nous avons trouvé que la surexpression de HSBP1 dans des tumeurs mammaires est associée à une augmentation des niveaux du complexe WASH et à un mauvais pronostic pour les patientes atteintes de cancer du sein. En conclusion, HSBP1 est un facteur d’assemblage conservé qui contrôle les niveaux du complexe WASH. / The Arp2/3 complex generates branched actin networks, which produces a pushing force that helps the cell to remodel its membranes. The WASH complex activates the Arp2/3 complex at the surface of endosomes and thereby, facilitates the membrane scission of the transport intermediates containing internalized receptors such as α5β1 integrins. Hence, by promoting integrin recycling, the WASH complex plays a crucial role in tumor cell invasion during cancer progression. However, how cells assemble the WASH complex at first is unknown. Here we report the identification of the first assembly factor of the WASH complex. We identified HSBP1 in a proteomics screen for proteins binding to precursor forms of subunits, but not to the fully assembled WASH complex. Through biochemical reconstitution and molecular modeling, we found that HSBP1 associates with the precursor CCDC53 trimer, dissociates it and forms a heterotrimer that will eventually contribute a single CCDC53 molecule to the assembling WASH complex. The role of HSBP1 in WASH complex assembly is well conserved since WASH is similarly destabilized upon HSBP1 knock-down in mammalian cells or upon HSBP1 knock-out in Dictyostelium amoeba. In line with the defective assembly of the WASH complex, the HSBP1 knock-out closely phenocopies WASH knock-out in amoeba. In human mammary carcinoma cells, HSBP1 depletion results in impaired integrin recycling to the plasma membrane leading to the defective development of focal adhesions and reduced invasion abilities. Moreover, HSBP1 was found to localize at the centrosome and was required for the polarization associated with the migration. On the other end, in mammary breast tumors, we found that HSBP1 was often overexpressed and that its overexpression was associated with increased levels of the WASH complex and with poor prognosis for breast cancer patients. Hence, HSBP1 is a conserved assembly factor that controls the levels of the WASH complex.

Le cerveau contient environ cent milliards de cellules nerveuses, ou neurones. Ces neurones communiquent entre eux par des structures fonctionnellement distinctes – l’axone et la dendrite – capables d’émettre et recevoir des signaux électriques ou chimiques à partir d’un compartiment présynaptique vers un compartiment, dit post-synaptique. Nous avons focalisé notre étude sur les synapses des neurones hippocampiques, qu’on estime responsables de fonctions cérébrales dites supérieures, comme la mémoire et l’apprentissage. Plus particulièrement, on s’est intéressé au développement et au maintien des épines dendritiques, dont les changements morphologiques sont intimement liés à la plasticité synaptique, autrement dit, capacité de réponse à l’activité synaptique. Les épines dendritiques ont pour origine les filopodes qui évoluent en épines lors du contact axonal. La transition entre filopode et épine implique une myriade de molécules, dont des récepteurs glutamatergiques, des protéines d’échafaudage et du cytosquelette d’actine capables de recevoir, transmettre et intégrer le signal présynaptique. Cependant, la coordination spatiale et temporelle de tous ces composants moléculaires au long de la formation et maturation d’une synapse reste largement méconnue.Scribble1 (Scrib1) est une protéine de polarité cellulaire (PCP) classiquement impliquée dans l’homéostasie de tissues épithéliaux ainsi que dans la croissance et progression des tumeurs. Scrib1 est aussi une protéine d’échafaudage critique pour le développement et le bon fonctionnement du cerveau. L’objectif de cette étude a donc été d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à un rôle potentiel de Scrib1 dans la formation et le maintien des synapses. Dans un premier temps, on a décrit l’importance d’interactions dépendantes des domaines PDZ sur le trafic des récepteurs glutamatergiques ainsi que sur la voie de signalisation de plasticité synaptique sous-jacente à la mémoire spatiale. Dans un second temps, nous avons évalué les conséquences fonctionnelles d’une mutation de Scrib1 récemment identifiée chez un patient humain atteint des troubles du spectre autistique (TSA) dans la morphologie et fonction des neurones. On a démontré que Scrib1 régule l’arborisation dendritique ainsi que la formation et le maintien fonctionnel des épines dendritiques via un mécanisme dépendent du cytosquelette d’actine. Le dérèglement de ces mécanismes pourrait être à l’origine du phénotype TSA. L’ensemble de ce travail met en évidence que Scrib1, protéine d’échafaudage clé dans le développement et la fonction du cerveau, joue une multitude de rôle du niveau subcellulaire au niveau cognitif. / The brain is made up of billions of nerve cells, or neurons. Neurons communicate with each other through functionally distinct structures - the axon and the dendrite - which are able to release and receive an electrical or chemical signal from a pre- to a post-synaptic compartment, respectively. We focused our study on hippocampal neurons synapses, which ultimately underlie high-order brain functions, such as learning and memory. In particular, we studied the development and maintenance of dendritic spines, whose changes in morphology are intimately correlated with synaptic plasticity, or the ability to respond to synaptic activity. Dendritic spines originate from motile dendritic filopodia, which mature into spines following axonal contact. The filopodia-to-spine transition involves a plethora of molecular actors, including glutamate receptors, scaffold proteins and the actin cytoskeleton, able to receive, transmit and integrate the pre-synaptic signal. The spatial and temporal coordination of all these molecular components throughout the formation and maturation of a synapse remains, however, unclear. Scribble1 (Scrib1) is planar cell polarity protein (PCP) classically implicated in the homeostasis of epithelial tissues and tumour growth. In the mammalian brain, Scrib1 is a critical scaffold protein in brain development and function. The main goal of this work was, therefore, to investigate the molecular mechanisms underlying Scrib1 role in synapse formation and maintenance. In a first part, we depict the importance of Scrib1 PDZ-dependent interactions on glutamate receptors trafficking as well as bidirectional plasticity signalling pathway underying spatial memory. In a second part, we focus on the functional consequences of a recently identified autism spectrum disorder (ASD) mutation of Scrib1 on neuronal morpholgy and function. We demonstrated that Scrib1 regulates dendritic arborization as well as spine formation and functional maintenance via an actin-dependent mechanism, whose disruption might underlie the ASD phenotype. Taken altogether, this thesis highlights the PCP protein Scrib1 as key scaffold protein in brain development and function, playing a plethora of roles from the subcelular to the cognitive level.