Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'adhérence cellulaire est un processus vital impliqué dans de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux comme la diérenciation, la réparation tissulaire ou encore le développement cellulaire. Cette thèse porte sur une étude alliant expériences et modélisation de cellules uniques en adhérence sur des supports micro-structurés Les résultats montrent que la contrainte géomé- trique imposée par les supports à contraste adhésif limite l'adhérence. Au-delà de cette limitation, une organisation reproductible du cytosquelette d'actine est observée cela suggère l'existence de lois physiques simples régissant ce processus. Nous avons développé une méthode de classication des formes géométriques élémentaires observées expérimentalement nous permettant d'obtenir des statistiques robustes. En nous basant sur le modèle de Potts Cellulaire, nous avons pu reproduire les résultats expérimentaux. Ce modèle énergétique démontre que les formes élémentaires sont des états métastables utilisés par les cellules au cours de l'adhérence. Les paramètres du modèle sont reliés aux paramètres biologiques pertinents. Nous présentons des résultats qui relient la courbure des interfaces aux paramètres biologiques. Nous montrons que la mesure expérimentale de cette courbure est une représentation de la compétition entre la contractilité des bres de stress et l'élasticité du gel d'actine. Une correspondance entre les propriétés physiques issues du modèle et les processus biochimiques régulant et organisant l'adhérence cellulaire est ainsi possible.

Le cytosquelette joue un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires (division, adhésion, migration, morphogenèse..). Un de ses principaux constituants, les filaments d'actine, des polymères semi flexibles polarisés, forme des réseaux dont les architectures spécifiques permettent au cytosquelette de réaliser ses fonctions physiologiques. Un enjeu majeur en biologie cellulaire est de comprendre comment les cellules peuvent former une telle variété d'organisations à partir de la même entité de base, les monomères d'actine. Nous avons découvert récemment que limiter la nucléation des filaments d'actine à des géométries définies suffit à contrôler la formation de différentes organisations (Reymann et al, 2010). Néanmoins, les paramètres principaux permettant d'expliquer comment ces contraintes géométriques déterminent l'organisation collective des filaments n'ont pas été identifiés. Pour comprendre les lois physiques régissant ce phénomène, j'ai développé des simulations numériques du système expérimental en utilisant le logiciel Cytosim. J'ai pu ainsi montrer que la géométrie, les interactions stériques entre filaments, leurs propriétés mécaniques, et l'efficacité de la nucléation sont les paramètres clés contrôlant la formation de structures. Cette étude propose une base solide pour comprendre l'organisation cellulaire de l'actine en identifiant un système minimal de composants suffisant pour simuler l'émergence de différentes organisations d'actine (réseau branché, faisceaux de filaments parallèles ou antiparallèles). Avec cet outil, nous pouvons à présent prédire, étant donnée une géométrie de nucléation, quelles structures en émergeront.Nous avons alors combiné nos deux méthodes in-vitro et in-silico pour étudier comment le couplage entre l'architecture des réseaux et leur composition biochimique contrôle la réponse contractile. La connectivité entre les filaments en est un facteur crucial. En effet, un réseau peu connecté se déforme seulement localement, et n'instaure pas de comportement global. Une structure fortement connectée est très rigide, les moteurs moléculaires ne peuvent donc pas la déformer efficacement. La contraction d'une structure n'est donc possible que pour des valeurs de connectivité intermédiaires. L'amplitude de cette contraction est alors déterminée par l'organisation des filaments. Ainsi nous avons pu expliquer comment l'architecture mais aussi la connectivité des réseaux gouverne leur contractilité.Finalement, les microtubules sont aussi des acteurs essentiels aux processus cellulaires. Étant longs et rigides, ils servent de senseurs de la forme cellulaire et organisent les organites. Leur distribution spatiale, facteur majeur pour l'organisation cellulaire, est contrôlée dans un grand nombre de types cellulaires par la position du centrosome, un organite qui nuclée la plupart des microtubules. La capacité du centrosome à trouver le centre de la cellule dans de nombreuses conditions physiologiques est particulièrement étonante. Il peut aussi adopter une position décentrée lors de processus cellulaires spécifiques. Des mécanismes pouvant potentiellement expliquer le positionnement du centrosome ont été proposés (Manneville et al., 2006; Zhu et al, 2010), mais ce phénomène reste dans sa plus grande partie inexpliqué. J'ai utilisé les simulations pour explorer différents mécanismes pouvant le contrôler selon différentes conditions. Ces résultats permettent de disposer d'une base théorique pour présumer des mécanismes intervenant dans un système donné. Ils peuvent aussi permettre de valider ou réfuter des hypothèses sur les phénomènes mis en jeu et aider à l'élaboration de nouveaux systèmes expérimentaux.Les simulations que j'ai développées aident ici à étudier des comportements spécifiques, en apportant de nouveaux éclairages sur les comportements collectifs du cytosquelette. Elles pourraient être utilisées comme un outil prédictif ou adaptées pour l'étude d'autres systèmes expérimentaux. / The cytoskeleton plays a crucial role in cellular processes, including cell division, adhesion, migration and morphogenesis. One of its main compenent, the actin filaments, a polarised semi-flexible polymer, contributes to these processes by forming specific collective architectures, whose structural organisations are essential to perform their functions. A major challenge in cell biology is to understand how the cell can form such a variety of organisations by using the same basic entity, the actin monomers. Recently we discovered that limiting actin nucleation to specific regions was sufficient to obtain actin networks with different organization (Reymann et al., 2010). However, our understanding of the general parameters involved in geometrically-driven actin assembly was limited. To understand mechanistically how spatially constraining actin nucleation determines the emergent actin organization, I performed detailed simulations of the actin filament system using Cytosim, a simulation tool dedicated to cytoskeleton system. I found that geometry, actin filaments local interactions, bundle rigidity, and nucleation efficiency are the key parameters controlling the emergent actin architecture. This study sets the foundation for our understanding of actin cellular organization by identifying a reduced set of components that were sufficient to realistically reproduce in silico the emergence of the different types of actin organization (branched actin network, parallel or anti parallel actin bundles). We can now predict for any given nucleation geometry which structures will form.Being able to control the formation of specific structures in-vitro and in-silico, we used the combination of both methods to study how the interplay between actin network architecture and its biochemical composition affects its contractile response. We highlighted the importance of the connectivity between filaments in the structures. Indeed, a loosely connected network cannot have a global behavior, but undergoes only local deformations. A highly connected network will be too rigid to be efficiently deformed by molecular motors. Only for an intermediate range of network connectivity the structures will contract, with an amplitude that depends notably on actin filaments organisation. This work explains how architecture and connectivity govern actin network contractility.Finally, the microtubules are also essential actors of cellular processes. Being long and rigid, they serve as sensors of the cellular shape and can organize the position of organelles in the cytoplasm. Their spatial distribution in the cell is thus a crucial cellular feature. this distribution is determined in a vast number of cell types by the position of the centrosome, an organelle that nucleates the majority of microtubules. Quite strinkingly, the centrosome is able to find the center of the cell in a lot of different physiological conditions, but can nonetheless adopt a decentered position in specific cellular processes. How this positioning is controled is not yet fully understood, but a few potential mechanims have been proposed (Manneville et al., 2006; Zhu et al., 2010). I used the simulations to explore different mechanisms taht can explain the position of the centrosome under different conditions. These results offer theorical considerations as a basis to assess which mechanism might prevail in a specific experimental system and may help to design new experimental setups.The simulations that I developed helped to study some specific behavior, by giving new insights into cytoskeleton collective organisations. These simulations can be further used as predictive tool or adapted to other experimental systems.

Au sein d'un tissu épithélial la division cellulaire doit être couplée à la formation de nouvelles jonctions intercellulaires entre les futures cellules-filles, afin de préserver l'intégrité du tissu et maintenir son adhésion et polarité. Chez les vertébrés et les invertébrés, lors de la constriction de l'anneau contractile les jonctions assemblées entre la cellule en division et ses voisines est remodelé. Concomitamment, la myosine non-musculaire II (MyoII) s'accumule dans les cellules voisines y produit la force nécessaire pour juxtaposer les membranes de la cellule en division, définissant ainsi la longueur de la future jonction formée entre les cellules-filles. Dans le cadre de mes travaux de doctorat, j'ai cherché à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au dialogue entre les cellules épithéliales pendant la division. J'ai montré que chaque division cellulaire est associée à un processus de mécano-transduction qui contrôle la dynamique de la MyoII dans les cellules voisines. Les forces produites par l'anneau contractile allongent localement la membrane des voisines diluant ainsi la concentration d'E-Cadhérine (E-Cad). En retour, cette réduction locale d'E-Cad, couplée à la contractilité intrinsèque des cellules voisines, génère des flux auto-organisés d'actine et myosine, qui conduisent à l'accumulation de MyoII dans les cellules voisines. En montrant que la cytocinèse épithéliale est une source endogène de contraintes mécaniques, mon travail définit un nouveau mécanisme de mécano-transduction qui coordonne les dynamiques d'actine et myosine dans les cellules en division et leurs voisines, et qui est permet de plus le remodelage des jonctions adhérentes. / During epithelial cytokinesis, the remodelling of adhesive cell-cell contacts between the dividing cell and its neighbours has profound roles in the integrity, the arrangement and morphogenesis of proliferative tissues. In both vertebrates and invertebrates, this remodelling requires the activity of non-muscle Myosin II (MyoII) in the interphasic cells neighbouring the dividing cells. However, the mechanisms coordinating cytokinesis and MyoII activity in the neighbours are unknown. Here, we found that, in the Drosophila notum epithelium, each cell division is associated with a mechano-sensing and transmission event controlling MyoII dynamics in the neighbours. We established that the ring pulling forces promote local junction elongation, resulting in a decrease of E-Cadherin (E-Cad) concentration at the ingressing adherens junction (AJ). In turn, the local reduction of E-Cad concentration and the contractility of the neighbouring cells promote self-organized actomyosin flows, ultimately leading to MyoII accumulation at the base of the ingressing AJ. While mechano-sensing has been extensively studied in the context of AJ reinforcement to stabilize the adhesive cell-cell contacts, we propose an alternative mechano-sensing mechanism able to coordinate actomyosin dynamics between epithelial cells and to sustain AJ remodelling in response to mechanical forces.

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un α-herpèsvirus aviaire responsable de lymphomes chez la poule. En absence de virions libres détectables en culture cellulaire, il est couramment admis que ce virus se dissémine uniquement de cellule à cellule par un mécanisme non identifié à ce jour. Mon travail de thèse comprenait 3 parties. La première avait pour objectif d’étudier la contribution des contacts cellulaires et de possibles virions extracellulaires dans la dissémination de MDV. La seconde partie visait à étudier le rôle du cytosquelette d’actine dans la dissémination intercellulaire du MDV et l’implication des voies de signalisation des RhoGTPases. J’ai montré que l’activité de la voie Rho-ROCK favorise la dissémination du MDV au contraire de la voie Rac-PAK. Un possible lien entre la dissémination du MDV et les jonctions adhérentes, maintenues par l’activité de la voie Rho-ROCK, est discuté. Enfin, la troisième partie avait pour but le développement d’un nouveau test de dissémination entre cellules sur un cycle viral unique. Pour cela, j’ai construit un virus MDV rapporteur inductible et des lignées cellulaires aviaires exprimant une flippase. / Marek’s disease virus (MDV) is an avian α-herpesvirus which is responsible for lymphomas in chicken. In absence of detectable cell-free virions in cell culture, it is well admit that this virus only spread from cell-to-cell. The involved mechanisms remain unknown. My thesis work was divided in three parts. The objectives of the first one were to study the contribution of cell contacts and of potential extracellular infectious virions on MDV spread. The second part aimed at studying the role of the actin cytoskeleton in MDV intercellular spread and the involvement of RhoGTPase signaling pathways. I showed that the Rho-ROCK signaling pathway promotes the dissemination in contrast to the Rac-PAK signaling pathway. A possible link between MDV spread and adherens junctions, maintained by Rho-ROCK signaling, is discussed. The third and last part had the purpose to develop a new assay of MDV spread between cells on a single viral cycle. For this, I built an inducible reporter MDV virus and avian cell lines expressing a flippase.

Les neurones sont des cellules polarisées qui présentent un seul axone et de nombreuses dendrites courtes. Les réarrangements du cytosquelette, l'augmentation du transport dépendant des microtubules et le couplage mécanique du cytosquelette d'actine à la membrane plasmique sont nécessaires pour établir cette polarité neuronale. Les Myosines 1 qui couplent le cytosquelette d'actine à la membrane plasmique sont des bons candidats pour réguler l'axonogenèse. La Myosine1b étant fortement exprimée dans le cerveau en développement, nous avons donc étudié son rôle dans l'axonogenèse. L'inhibition de l'expression de Myo1b dans les neurones corticaux retarde la différenciation neuronale et empêche l'axonogenèse et l'établissement de la polarité neuronale. La surexpression de Myo1b accélère le développement neuronal et induit la formation d'axones surnuméraires. L'activité motrice et l'interaction de Myo1b avec des phosphoinositides via son domaine PH est nécessaire pour ce processus. Myo1b est associée et contrôle la formation d'ondes d'actine antérogrades qui 'cross-talk" avec les microtubules pour diriger le transport de la kinésine1 sur les microtubules et conduire à la formation de l'axone. L'inhibition de Myo1b empêche la propagation des ondes d'actine et le mouvement de KIF5560 une version constitutivement active du moteur Kinésine 1 associé aux microtubules. L' activité motrice et le domaine PH de Myo1b sont nécessaire à la propagation des ondes d'actine. Nos résultats indiquent que la Myosine 1b contrôle la rupture de la symétrie axonale et la formation de l'axone en contrôllant l'orientation de la polymérisation d'actine à la membrane dans les ondes d'actine antérograde. / Neurons are highly polarized cells, with a long axon and multiple short dendrites. Rearrangements of cytoskeleton, increased microtubule-based transport and coupling mechanically actin cytoskeleton to plasma membrane are required for the establishment of neuronal polarity. Class 1 Myosin, with the unique property to couple mechanically actin cytoskeleton to plasmamembrane are good candidate for regulatin axonogenesis. Myosin1b is highly expressed in developing brain where it was first identified. Thus, we investigated its role in axonogenesis. Depletion of endogenous Myo1b in cultured cortical neurons delays the neuronal differentiation and impairs the axonogenesis and the establishment of the neuronal polarity. The overexpression of Myosin1b rushes the neuronal development and promotes the formation of supernumerary axon-like structures. Myo1b requires its motor activity and its interaction with phosphoinositides via its PH motif to promote the axonogenesis. Myo1b associates and controls the formation of anterograde actin waves that cross-talk with microtubules to direct microtubules-bases transport of kinesin-1, and drive axon formation. Myo1b depletion impairs the propagation of actin waves and the translocation of KIF5560, a constitutively active version of the microtubules motor Kinesin-1. The motor activity and interaction with phosphoinositides of Myo1b are also required for the propagation of actin waves. Together our data indicate that myosin1b controls the neuronal symmetry breaking and the axogenesis by controlling the orientation of the actin polymerization to the membrane in the waves that drive the propagation of anterograde actin waves.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.<br />Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.<br />Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.<br />Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal