Einleitung: Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) stellt weltweit eine bedeutende Augenerkrankung dar, die aufgrund des rezidivierenden Verlaufs und der progredienten Zerstörung intraokularer Strukturen bis zur Erblindung führen kann. Aufgrund eigener klinischer Erfahrungen ist die Hypothese der vorliegenden Untersuchungen, dass erstens eine wiederkehrende Entzündung der mittleren Augenhaut nicht zwangsläufig mit einem positiven Leptospirennachweis verbunden und zweitens der Erfolg der Pars-plana-Vitrektomie (PPV) nicht vom Leptospirenbefund abhängig ist. Ziele der Untersuchungen: Die Untersuchungen haben die Intentionen an einer größeren Patientenanzahl, den Zusammenhang zwischen Leptospireninfektion und ERU sowie zwischen dem Leptospiren-Antikörper-Nachweis in der Glaskörperflüssigkeit und dem Erfolg der PPV zu erfassen. Tiere, Material und Methoden: In zwei retrospektiven Studien wurden von 225 bzw. 118 Pferden mit ERU unverdünntes Glaskörpermaterial kulturell auf Leptospiren, sowie Glaskörperproben und Serum mittels Mikroagglutinationstest (MAT) auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper gegen verschiedene Serovare von L. interrogans untersucht. In der zweiten Studie wurde das Wiederauftreten von ERU im Zeitraum von 8 bis 54 Monate nach der Single-Port-PPV durch wiederholte Augenuntersuchungen sowie durch telefonische Befragungen überweisender Tierärzte und Pferdebesitzer ermittelt. Zur Auswertung der klinischen Studie wurde Fishers exakter Test mit dem Signifikanzniveau bei P ≤ 0,05 verwendet. Ergebnisse: In der ersten Studie wurden insgesamt bei 127/221 (57,5 %) Pferden positive Antikörpertiter (≥1:100) im Blutserum festgestellt. Am häufigsten wurden Antikörper gegen L. interrogans serovar Grippotyphosa nachgewiesen (79/127). Die kulturelle Leptospirenanzucht aus Glaskörpermaterial erbrachte bei 34/212 Pferden (16 %) ein positives Ergebnis. Im Glaskörpermaterial konnten bei 79/225 Pferden (35,1 %) Antikörper gegen Leptospiren nachgewiesen werden, wobei L. interrogans serovar Grippotyphosa am häufigsten (67/79) vorkam. In der zweiten Studie wurden im Blutserum bei 55 von 118 Pferden (46,6 %) positive Antikörpertiter (≥ 1:100) nachgewiesen. Die Leptospirenisolation aus Glaskörpermaterial erbrachte bei 16 von 118 ERU-Patienten (13,6 %) ein positives Ergebnis. Im Glaskörpermaterial wurde mittels MAT bei 49/118 Pferden (41,5 %) Antikörper gegen Leptospiren nachgewiesen. Am häufigsten wurden Antikörper gegen L. interrogans serovar Grippotyphosa ermittelt. Rezidivfreiheit wurde bei 41/49 Pferden (83,7 %) mit positivem Leptospiren-Antikörper-Nachweis sowie bei 49/69 Pferden (71,0 %) mit negativem Leptospiren-Antikörper-Nachweis ermittelt, wobei der Unterschied nicht signifikant war (P = 0,1287). Schlussfolgerungen: Neben der Leptospirenätiologie sollte aus Sicht der Autoren die genetische Veranlagung der autoimmunassoziierten ERU vermehrt in den Fokus der ophthalmologischen Forschung rücken. Jede klinisch diagnostizierte ERU ist eine Indikation zur PPV, um zeitnah durch Austausch der Glaskörperflüssigkeit eine rezidivierende Entzündung des Auges zu verhindern.:1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Vorkommen und Krankheitsbild 3 2.2 Ätiopathogenese 4 2.2.1. Leptospiren 4 2.2.2. Autoimmunreaktionen 6 2.2.3 Genetische Ursachen 7 2.3 Diagnose 8 2.4 Therapie 10 2.5 Erfolg der Pars-plana-Vitrektomie 12 3. Ergebnisse 14 3.1 Publikation 1 15 3.2 Publikation 2 22 4. Diskussion 30 5. Zusammenfassung 39 6. Summary 41 Literaturverzeichnis Danksagung

Einleitung: Der Tierschutz ist in Deutschland seit 2002 als Staatsziel im Grundgesetz verankert. Die Schlachtung tragender Tiere widerspricht den Grundsätzen des Tierschutzes, da Schmerzen und Leiden bei den Muttertieren und deren Feten nicht ausgeschlossen werden können. Auf der Basis dieser Überlegungen ist durch die Verabschiedung eines nationalen Gesetzes, welches ab September 2017 in Kraft tritt, die Abgabe tragender Säugetiere im letzten Trächtigkeitsdrittel zur Schlachtung verboten. Schafe und Ziegen sind von dieser Regelung ausgenommen. Dies liegt unter anderem daran, dass für diese Tierarten im Vergleich zum Rind bislang keine Daten zu Vorkommen, Ausmaß und eventuellen Gründen einer Schlachtung im fortgeschrittenen Trächtigkeitsstadium vorliegen. Zur Klärung dieser Fragestellungen fördert das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL) aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestags über die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung (BLE) seit Beginn 2015 das Forschungsprojekt „Untersuchungen zum Anteil von Trächtigkeiten bei geschlachteten Tieren und zu den Ursachen für die Abgabe trächtiger Schlachttiere unter Berücksichtigung der verschieden Tier- und Nutzungsarten“ (kurz: „SiGN“) unter dem Förderkennzeichen 2814HS005/012. Zielstellung: In dieser Arbeit wurde erstmalig systematisch untersucht, ob und in welchem Umfang tragende kleine Wiederkäuer in Deutschland der Schlachtung zugeführt werden. Insbesondere wurden dabei die Häufigkeit dieser Schlachtungen, die vorliegenden Trächtigkeitsstadien und der saisonale Verlauf genauer untersucht. Ein weiterer wesentlicher Punkt dieser Arbeit war eine Umfrage zur Erhebung möglicher Ursachen, die zu diesen Schlachtungen führen. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten dienen als Basis der anschließenden Erarbeitung von Empfehlungen zur Vermeidung der Schlachtung tragender kleiner Wiederkäuer. Material und Methoden: Die Datenerhebung zur Feststellung der Prävalenz sowie weiterer tierschutzrelevanter Parameter im Zusammenhang mit der Schlachtung tragender kleiner Wiederkäuer erfolgte zweistufig. Zum einen übermittelten amtliche Tierärzte Daten aus den von ihnen überwachten Schlachtbetrieben, zum anderen wurden parallel vor Ort Untersuchungen an kooperierenden Schlachtbetrieben durchgeführt. Die Befragung zur Ursachenermittlung erfolgte mittels spezifischer Fragebögen im Rahmen von Vortragsveranstaltungen. Dabei wurden Tierhalter und auf kleine Wiederkäuer spezialisierte Tierärzte befragt. Ergebnisse: Von Januar 2015 bis Januar 2017 wurden von den amtlichen Tierärzten Untersuchungsergebnisse zu 6 335 geschlachteten weiblichen Schafen übermittelt. Von diesen waren 213 (3,4 %) tragend. Bei den Untersuchungen in den kooperierenden Schlachtbetrieben zeigte sich eine Prävalenz von 17,9 % (213/1 193). Die Schafe befanden sich auf beiden Ebenen der Untersuchung insbesondere im ersten und zweiten Drittel der Trächtigkeit. Von den tragenden Tieren waren 9,9 % (amtliche Ebene) bzw. 3,3 % (Projektebene) im letzten Trächtigkeitsdrittel tragend. Die Schlachtungen tragender Schafe und Ziegen trat chargenweise sowie saisonal gehäuft von September bis März auf, wobei der Anteil hochtragend geschlachteter Tiere zum Ende dieses Zeitraums zunahm. Angaben zu 42 weiblichen Ziegen wurden von den amtlichen Kollegen übermittelt. Vier waren im ersten Drittel tragend. Bei den Erhebungen vor Ort waren zwei von drei untersuchten weiblichen Ziegen ebenfalls im ersten Trächtigkeitsdrittel tragend. Aus der Befragung von 275 Tierhaltern und 42 Tierärzten geht hervor, dass besonders managementbedingte Ursachen zur Schlachtung gravider kleiner Wiederkäuer führen. Somit haben die Dauer des Bockeinsatzes und das Aufzuchtmanagement der Bocklämmer einen hohen Einfluss auf eine unkontrollierte Bedeckung. Die Unwissenheit im Hinblick auf eine bestehende Trächtigkeit wird als wahrscheinlichste Ursache von beiden Personengruppen angegeben. Ein sicherer Ausschluss des Deckkontaktes und eine sachgemäße Selektion der Schlachttiere sehen die Befragten als effektivste Maßnahmen zur Vermeidung dieser Schlachtungen an. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Schlachtung tragender Schafe und Ziegen in Deutschland regelmäßig vorkommt. Zur Generierung einer sicheren Datenlage ist eine genauere und kontinuierliche amtliche Überwachung nötig. Eine gezielte Beratung der Tierhalter und Tierhalter-betreuenden Personen ist notwendig, um insbesondere die Situation der Tierhalter langfristig zu verbessern. Prinzipiell scheint durch die Anwendung praxistauglicher und leicht zu implementierender Maßnahmen (Geschlechtertrennung, sachgemäße Selektion der Schlachttiere, frühzeitige Entnahme/Kastration der Bocklämmer) eine Reduzierung der Anzahl dieser Schlachtungen möglich. Allerdings ist zur Managementoptimierung eine Rückmeldung seitens der Schlachtbetriebe unerlässlich. Diese erstmalige systematische Datenerhebung zur Schlachtung tragender kleiner Wiederkäuer in Deutschland liefert relevante Informationen zur gezielten und bedarfsgerechten Schulung der Tierhalter und Tierärzte. Die Arbeit ist darüber hinaus die Grundlage zur Erarbeitung tierartspezifischer Empfehlungen zur Vermeidung dieser Schlachtungen bei Schafen und Ziegen. Weiterhin können unter anderem mit Hilfe dieser neuen Datensammlung Indikatoren erarbeitet werden, die eine sichere Alterseinteilung der Feten in die entsprechenden Trächtigkeitsdrittel ermöglichen.

Bei einer Erkrankung des Gehirns ist häufig anhand von alleiniger Routinediagnostik, wie Magnetresonanz (MRT)- und Computertomographie (CT) des Kopfes sowie Liquoranalysen, keine eindeutige Diagnosestellung möglich. Für eine gezielte Therapie ist aber eine gesicherte histopathologische Diagnose essentiell. Aufgrund der hohen Komplexität und Verletzlichkeit des Nervensystems ist eine besonders präzise und sichere Biopsiemethode nötig, die jedoch gleichzeitig nicht zu kostenintensiv sein darf. Ziel der experimentellen Kadaverstudie war die Bestimmung der Genauigkeit eines neuen MRT-basierten patientenindividuellen stereotaktischen Gehirnbiopsiesystems durch die Berührung vordefinierter intrakranieller Zielpunkte im Hundegehirn unter Zuhilfenahme einer Gehirnbiopsienadel. Zur Ermittlung der Genauigkeit des Systems wurden an 22 Hundekadavern zweier Körpermassenklassen (Gruppe 1: kleine Hunde < 15 kg, Gruppe 2: große Hunde > 20 kg) drei spezielle Knochenanker und darauf aufsetzende Marker, welche sowohl in CT- als auch in MRT-Untersuchungen sichtbar waren, an vordefinierten Knochenpunkten befestigt. Anschließend wurden sowohl ein MRT- als auch ein CT-Datensatz des Kopfes angefertigt. Je Kadaver wurden zwei Zielpunkte festgelegt. Linksseitig wurde ein Zielpunkt im Gehirnbereich des Nucleus caudatus zur Simulation oberflächlicher Gehirnläsionen angesteuert, rechtsseitig ein Zielpunkt im Bereich des Lobus piriformis als Beispiel einer tiefen Gehirnläsion festgelegt. Des Weiteren wurden die Trajektorien der Biopsienadel im MRT-Datensatz markiert. Die Eintrittspunkte der Biopsienadel mussten jeweils in einem Gyrus liegen und die Biopsienadel durfte auf ihrem Weg durch das Gehirngewebe die Ventrikel nicht penetrieren. Basierend auf den MRT-Bildern wurde ein patientenindividueller Rahmen zum Erreichen der eingezeichneten Zielpunkte konzipiert und anschließend mit einem 3D-Drucker der Firma Stratasys gedruckt. Der patientenindividuelle Rahmen, welcher aus drei Beinen und zwei Biopsieports (Instrumentenführung) bestand, wurde am Hundekopf mit speziellen Schrauben an den bereits vorhandenen Knochenankern befestigt. Mit Hilfe der Instrumentenführung des 3D- Rahmens konnte anschließend ein minimalinvasiver Zugang für die Biopsienadel geschaffen werden. Die Biopsienadel wurde entsprechend der vorgeplanten Trajektorien im Gehirn platziert. Es folgte ein erneuter CT-Scan des Hundekopfes mit der Biopsienadel im Hundeschädel für die Zielpunkte 1 und 2. Die Zielpunktabweichung (in Millimetern) zwischen den Ist- und Soll-Zielpunkten wurde nach der Fusion der MRT- und der zwei CT-Datensätze in einem Koordinatensystem ermittelt. Dabei erfolgt die Fusion der MRT- und CT-Daten basierend auf den am Patienten befestigten Markern, die in beiden Schnittbildverfahren sichtbar waren, und die Fusion der CT-Scans anhand von Knochenpunkten. Die CT-Untersuchungen wurden nur für die Ermittlung der Genauigkeit des Biopsieverfahrens angewendet. Der zukünftige Einsatz am klinischen Patienten dagegen kann ausschließlich auf MRT-Datensätzen basieren. Die mediane Zielpunktabweichung aller 43 Zielpunkte an 22 Kadavern ergab einen Wert von 0,83 mm mit einer Spannweite von 0,09 bis 2,76 mm. Die mediane Zielpunktabweichung aller Hunde im Zielpunkt 1, einem Punkt im oberflächlicher gelegenen Nucleus caudatus, betrug 0,57 mm (Spannweite 0,09 – 1,25 mm) und im Zielpunkt 2, einem Punkt im tiefer gelegenen Lobus piriformis, ergab einen Wert von 0,85 mm (Spannweite 0,14 – 2,76 mm). Es konnte kein signifikanter Unterschied der Zielpunktabweichungen zwischen dem Zielpunkt 1 und 2 in allen Hunden festgestellt werden. In der Gruppe 1 (kleine Hunde < 15 kg) wurde eine mediane Zielpunktabweichung im Zielpunkt 1 von 0,50 mm und im Zielpunkt 2 von 0,84 mm ermittelt. In der Gruppe 2 (große Hunde > 20 kg) ergab sich eine mediane Zielpunktabweichung im Zielpunkt 1 von 0,96 mm und im Zielpunkt 2 von 0,93 mm. Es konnte ein signifikanter Unterschied der Zielpunktabweichung im Zielpunkt 1 (Nucleus caudatus, oberflächlich) nachgewiesen werden. Es kann davon ausgegangen werden, dass in kleineren Hunden (im Vergleich zu in großen Hunden) oberflächlichere Zielpunkte mit einer erhöhten Genauigkeit beprobt werden können. Im Zielpunkt 2 (Lobus piriformis, tief) konnte kein Unterschied der Genauigkeit zwischen den unterschiedlichen Patientenmassengruppen ermittelt werden. In den bisherigen Studien zu den derzeit in der Veterinärmedizin eingesetzten Gehirnbiopsiesystemen wurden mittlere Zielpunktabweichungen von 0,9 bis 4,3 mm oder mediane Zielpunkabweichungen von 1,5 und 1,55 mm berichtet. Somit erreichte das MRT-basierte patientenindividuelle stereotaktische Gehirnbiopsiesystem eine höhere Genauigkeit als die meisten bisher eingesetzten Systeme und lässt sich zusätzlich bei jeder Hundekopfgröße und –form anwenden. Damit qualifiziert sich das Gehirnbiopsiesystem für den Einsatz an klinischen Patienten.:INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1. Gehirnbiopsien in der Veterinärmedizin 2.1.1. Minimalinvasive nicht-stereotaktische Gehirnbiopsieverfahren 2.1.2. Minimalinvasive stereotaktische Gehirnbiopsieverfahren 2.1.2.1. Klinisch eingesetzte rahmenbasierte stereotaktische Gehirnbiopsieysteme 2.1.2.2. Klinisch eingesetzte rahmenlose stereotaktische Gehirnbiopsiesysteme 2.1.3. Anwendungsgebiete moderner Neuronavigationssysteme 2.2. Genauigkeiten der in der Kleintierneurochirurgie eingesetzten Gehirnbiopsiesysteme 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1. Allgemeiner Aufbau der Studie 3.2. Präparation der Hundekadaver 3.3. Bildgebung zur Erfassung der Planungsdaten 3.4. Konstruktion der Gehirnbiopsievorrichtung 3.5. Platzierung und Kontrolle der Gehirnbiopsienadel am Kadaver 3.6. Auswertung der Zielpunktgenauigkeit 3.7. Statistische Auswertung 4. ERGEBNISSE 4.1. Rasse und Körpermasse der Hundekadaver 4.2. Zielpunktgenauigkeit des MRT-basierten patientenindividuellen stereotaktischen Gehirnbiopsiesystems 5. DISKUSSION 5.1. Genauigkeit des MRT-basierten patientenindividuellen stereotaktischen Gehirnbiopsiesystems im Vergleich zu der Genauigkeit anderer Gehirnbiopsiesysteme 5.2. Ablauf einer Gehirnbiopsieentnahme am klinischen Patienten 5.3. Vorteile des MRT-basierten patientenindividuellen stereotaktischen Gehirnbiopsiesystems 5.4. Nachteile und Limitationen des MRT-basierten patientenindividuellen stereotaktischen Gehirnbiopsiesystems 5.5. Bedeutung und Ausblick 6. ZUSAMMENFASSUNG 7. SUMMARY 8. LITERATURVERZEICHNIS 9. ANHANG 9.1. Ausreißer: Fall Nr. 21, Labrador Retriever (Gruppe 2), Zielpunkt 1 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Tabellenverzeichnis 10. DANKSAGUNG

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) auf das Phospho- und Sphingolipidmuster der Non-raft- und Lipid raft-Bereiche in Membranen von RAW264.7-Makrophagen massenspektrometrisch untersucht. Außerdem wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie die Auswirkungen einer PUFA-Zugabe auf die Lokalisation des immunologisch bedeutsamen Mustererkennungs-Rezeptor TLR2 und seinen Ko-Rezeptoren TLR1 und TLR6 untersucht.

Einleitung In der heutigen industriellen Schweinehaltung führen die aus ökonomischen Gründen eingesetzten intensiven Haltungssysteme zu erheblichen Beeinträchtigungen des Tierwohls. Eine Zuchtsau kann nur in einer gesunden körperlichen Verfassung und unter guten Haltungsbedingungen ein Optimum an Leistung erbringen. Häufig erreicht eine Zuchtsau jedoch nicht ihren Leistungshöhepunkt und wird vorzeitig aus der Reproduktion ausgeschlossen. Die häufigsten Abgangsursachen sind Erkrankungen des Reproduktionssystems oder Lahmheiten. Gründe für Lahmheiten sind Erkrankungen des Bewegungsapparates, also Klauenläsionen, sowie Läsionen der Gelenke und Weichgewebe des Bewegungsapparates, und hier insbesondere Arthritiden oder Osteochondrose. Bei letzterer stehen Knorpelschäden im Mittelpunkt der Pathogenese. Über Auftreten, Art und Verteilung von Schäden des Gelenkknorpels in sämtlichen Gelenken der 4 Gliedmaßen liegen bei Sauen bisher keine umfassenden systematischen Untersuchungen vor. Ziele der Untersuchungen Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, das Auftreten von Gelenksknorpelveränderungen an allen Gelenken der 4 Gliedmaßen von Zuchtsauen systematische makroskopisch- anatomisch zu evaluieren und diese mit einem geeigneten Klassifikationsmodell in Bezug auf ihre Morphologie und ihren Schweregrad zu charakterisieren. Tiere, Material, Methoden Makroskopisch untersucht wurden alle Gelenke der vier Gliedmaßen von 30 Zuchtsauen. Das Probenmaterial entstammte einer externen Untersuchungsreihe in der Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen. Die Sauen wurden zufällig ausgewählt, der Abgangsgrund aus dem Zuchtbetrieb stand zum Zeitpunkt der Befunderhebungen nicht fest. Zur Beurteilung des Gelenksknorpels wurden alle Gelenke von proximal nach distal mit einem Skalpell eröffnet. Die Gelenksoberflächen wurden makroskopisch evaluiert und fokale Knorpelveränderungen mit dem Outerbridge-Knorpelläsionenscore kategorisiert. Dieser Grad umfasst fünf Einteilungen, wobei Grad 0 einem gesunden Knorpel entspricht, eine Grad-4-Läsion zeigt Veränderungen bis auf den subchondralen Knochen Die Auswertung erfolgte rein deskriptiv und umfasste die Verteilung der Outerbridge Graduierung der einzelnen Gelenke von Vorder- und Hintergliedmaße, die Lokalisation der Knorpelveränderungen, ein Rechts-Links-Vergleich der Gliedmaßen, sowie ein Vergleich der distalen Vorder- und Hintergliedmaße. Ergebnisse Knorpelläsionen aller Outerbridge-Grade konnten in allen Gelenken dokumentiert werden. Die Anzahl knorpelfreier Areale war an den Vordergliedmaßen in der Cavitas glenoidalis, sowie an den Gelenkflächen des Ellbogens höher als an den anderen Gelenken. An den Hintergliedmaßen zeigten sich die knorpelfreien Areale besonders häufig im Talokruralgelenk an der Cochlea tibia und am Talus. Makroskopisch lassen diese veränderten Knorpelbereiche eine hochgradige Gelenkspathologie vermuten, müssen aber von physiologischen Gelenksstrukturen, den Gelenkgruben (Fossae synoviales), abgegrenzt werden. Im Vergleich von distaler Vordergliedmaße zu distaler Hintergliedmaße fällt auf, dass die Knorpelläsionen im Fessel- und Krongelenk an den Hintergliedmaßen häufiger und in höherem Schweregrad auftreten. Im Recht-LinksVergleich ließ sich kein Seitentrend erkennen. Schlussfolgerung In dieser Arbeit konnten an den Gelenken zahlreiche Knorpelläsionen, sowie knorpelfreie Areale befundet und klassifiziert werden. Diese sind aber nicht immer pathologische Läsionen oder Veränderungen im Rahmen einer Osteochondrose. Die erhobenen Veränderungen des Gelenkknorpels repräsentieren einerseits Läsionen, die typischerweise bei der Osteochondrose auftreten. Anderseits sind die knorpelfreien Gelenkareale aber Synovialgruben, also physiologischerweise vorhandene Strukturen. Es wird deutlich, dass in vielen Fällen allein durch die makroskopische Befunderhebung keine eindeutige Abgrenzung von physiologischen Gelenkgruben und pathologischen Gelenksveränderungen vorgenommen werden kann. Hier wären pathohistologische Untersuchungen an geeignet frischem Material erforderlich. Biomechanische Untersuchungen zur Druckbelastung in den einzelnen Gelenken sollten durchgeführt werden, um Erklärungen für die unterschiedliche Häufigkeit und Schwere von Knorpelveränderungen an den distalen Gliedmaßen von Vorder- und Hintergliedmaßen zu erhalten.

Geriatrische Pferde machen einen erheblichen Anteil der equinen Population aus, der langfristig weiter an Bedeutung gewinnt. Da Stuten auch im hohen Alter zur Reproduktion fähig sind, wird auch die Anzahl alter Stuten, die zur Zucht vorgestellt werden, zunehmen. Diese Stuten zeigen jedoch häufig Fertilitätsprobleme. Ziel der Arbeit ist die Charakterisierung der Endometriumbioptate alter Stuten, um eine Aussage hinsichtlich möglicher, innerhalb des Endometriums lokalisierter Ursachen für die Subfertilität dieser Tiere zu treffen. Zu diesem Zweck werden 819 Endometriumbioptate von insgesamt 814 alten Stuten (≥ 20 Jahre alt) hinsichtlich des Vorliegens von entzündlichen, degenerativen sowie funktionellen Alterationen untersucht. Auf Basis der histologischen Befunde erfolgt eine Einstufung der Proben gemäß dem Kategorisierungssystem von KENNEY und DOIG (1986) mit und ohne Berücksichtigung der Güstzeit der Stute. Die Mehrheit der untersuchten Tiere ist jünger als 25 Jahre. Bei 429 Stuten liegen genaue Angaben bezüglich der Anzahl der Abfohlungen vor. Betrachtet man nur diese, dann ist die Mehrzahl der Stuten multipar. Daneben treten aber auch nulli- und unipare Tiere auf. Angaben zur Güstzeit fehlen bei 19 % der Stuten. Die übrigen Tiere sind fast immer güst. Nahezu alle Bioptate weisen eine Endometrose auf, die überwiegend mittelgradig ausgeprägt ist. Mindestens 25 Jahre alte Stuten weisen tendenziell häufiger mittel- und hochgradige Endometrosen sowie destruierende Formen auf als Tiere in ihren frühen zwanziger Jahren (Unterschiede nicht statistisch signifikant). Ein Zusammenhang zur Anzahl der Abfohlungen einer Stute und dem Auftreten von Endometrosen besteht nicht. In 89 % der Bioptate sind bereits mittels H.E.-Färbung degenerative Gefäßläsionen erkennbar. Es treten vor allem mittel- und hochgradige Angiosklerosen auf. Es ist ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Anzahl der Abfohlungen einer Stute und dem Auftreten von Angiosklerosen nachweisbar. In nahezu jedem 2. Bioptat liegt eine Endometritis vor, die meist nicht-eitrig ist. Es dominieren geringgradige Entzündungsprozesse. In 58 % der Bioptate sind in einer oder mehreren Lokalisationen periglandulär akzentuierte mononukleäre Entzündungszellinfiltrate (PAME) vorhanden, die überwiegend gering- bis mittelgradig ausgeprägt sind. Perivaskulitiden treten in 43 % der Proben auf. Die perivaskulären Entzündungsprozesse sind meist geringgradig und nicht-eitrig. Differenzierungsstörungen sind in 134 Bioptaten vorhanden. Die irreguläre glanduläre Differenzierung stellt die häufigste Form der Fehldifferenzierung dar, während eine ungleichmäßige glanduläre Differenzierung und vor allem eine endometriale Inaktivität während der Zuchtsaison nur vereinzelt vorkommen. Eine endometriale Atrophie sowie Lymphlakunen sind im Untersuchungsgut nicht nachweisbar. Die Einstufung der Proben gemäß dem Kategorisierungssystem verläuft mit folgenden Ergebnissen: Bei Kategorisierung der Fälle ausschließlich auf Basis der histologischen Befunde ohne Berücksichtigung der Güstzeit entfällt die Mehrzahl der Proben zu etwa gleichen Anteilen auf die Kategorien IIb und III. Bei Einbeziehung der Güstzeit entfallen dagegen 68 % der Proben auf die Kategorie III. Die im Zusammenhang mit fortgeschrittenem Alter einer Stute auftretenden Fertilitätsprobleme sind in der Regel multifaktoriell bedingt, wobei das Endometrium eine zentrale Rolle einnimmt. Das Endometrium alter Stuten weist meist eine Kombination verschiedener Alterationen auf. Viele dieser Befunde (z.B. Angiosklerosen) werden im gängigen Kategorisierungssystem equiner Endometriumbioptate nicht berücksichtigt, wenngleich sie die Fertilität einer Stute beeinflussen.

Background: Idiopathic inflammatory bowel disease (IBD) and food-responsive diarrhea (FRD) are common categories of chronic inflammatory enteropathy (CIE) in dogs. The intestinal microbiota is considered a major contributing factor to the pathogenesis of IBD. Intestinal dysbiosis has been identified in dogs with IBD, but only little information is available on differences in the mucosal microbiota of dogs diagnosed with IBD and FRD. In humans, dyslipidemia has also been described in patients with IBD. However, studies on the lipid profile in dogs with IBD or FRD are currently lacking. Objectives: This is the first study to (1) compare the intestinal mucosal microbiota of dogs with IBD and FRD in the duodenum and the colon, (2) evaluate differences in the mucosal microbiota of each dog before and after the induction phase of treatment, and (3) evaluate the systemic phospholipid profile of dogs with IBD or FRD also both prior to and after the induction phase of treatment. Materials and Methods: Duodenal and colonic mucosal biopsies from 24 dogs with CIE (15 FRD, 9 IBD) and EDTA-plasma and whole blood from 32 dogs (16 FRD, 16 IBD) were retrieved from a former study on canine CIE. All client-owned dogs were prospectively enrolled in the study. All dogs received a standardized diagnostic work-up and treatment including a dietary trial. Dogs that responded to the elimination diet within 14 days were classified as FRD; the remaining dogs requiring additional immunosuppressant treatment were classified as IBD. Biopsy specimens of duodenum and colon were obtained endoscopically both before and after standard therapy. DNA was extracted from these biopsies and the intestinal mucosal microbiota of the duodenum and colon were evaluated by Illumina sequencing of the bacterial 16S rRNA gene. The phospholipids in whole blood and EDTA plasma, collected both before and after treatment, were analyzed by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC). Differences in the composition were statistically assessed by alpha diversity indices, principal coordinate analysis, analysis of similarities (ANOSIM) and linear discriminant (LDA) analysis effect size (LEfSe) for the microbiota and by principal component analysis (PCA), analysis of variance (ANOVA) and random forest analysis for the phospholipid profile. Results: All differences in the microbial composition and phospholipid profile described below are statistically confirmed with significance set at p-value < 0.05 or LDA score > 2.0. No difference in the global bacterial composition was identified neither between the two disease groups of dogs nor with the treatment status. However, abundances of several bacterial taxa varied between disease groups and also with the treatment status. When comparing disease groups, an unclassified genus of Neisseriaceae was more abundant in the duodenum in the IBD group, whereas Bilophila spp. occurred more frequently in the duodenum of the FRD group. Comparison before and after treatment revealed Enterococcus spp., Corynebacterium spp. and Proteobacteria to be enriched in the duodenum of FRD dogs before treatment. Bacteroides spp. was more abundant in the colon in the FRD group post-treatment. In the IBD dogs, Unclassified_Neisseriaceae was more abundant in the duodenum and mainly Proteobacteria (Burkholderia spp., Citrobacter spp.) in the colon prior to treatment. Bacteroides spp. was significantly more abundant in the colon after treatment. The phospholipidome differed dependent on the type of specimen (whole blood vs. plasma). In addition, treatment and disease severity presented the most significant factors determining the variance of the phospholipid profile. An increase in lysolipids and a significant shift of the phosphatidylcholine (PC) species from PC 38:4 (18:0 / 20:4) to mainly lysophosphatidylcholine 18:0 was observed after treatment. Conclusions: Some differences in individual bacterial taxa were identified both between disease groups of dogs and with regard to treatment status. The role of these bacterial groups in the pathogenesis of IBD and FRD is still unknown. However, Bacteroides spp. might be of importance, and this species could potentially serve as marker of treatment response. Furthermore, significant variances were identified in the phospholipid profiles of dogs with IBD and FRD, which were particularly associated with the type of specimen used, disease severity, and treatment status. These alterations in the phospholipid profile could potentially aid in monitoring the response to treatment. Subsequently, specific modulation of the intestinal microbiota and the phospholipid profile might also present novel therapeutic strategies in dogs with CIE.

Die Amnionmembran (AM) stellt aufgrund ihrer wundheilungsfördernden und narbenreduzierenden Eigenschaften ein nützliches Substrat zur erfolgreichen Behandlung kornealer Läsionen bei Mensch und Tier dar. Beim Hund kommen derzeit für diese Indikation überwiegend xenogene Transplantate zum Einsatz, über allogene Transplantate liegen nur sehr wenige Informationen vor. Um die zeitnahe Verfügbarkeit der AM zu sichern, stellt die Kryopräservation zurzeit ihre häufigste Lagerungsmöglichkeit über einen längeren Zeitraum von bis zu zwei Jahren dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der morphologischen, morphometrischen und mikrobiellen Eigenschaften der kaninen Amnionmembran (KAM) zum Zeitpunkt der Gewinnung und über die Zeit der Kryopräservation bis zu 180 Tagen. Mit der hier vorliegenden Arbeit ist es gelungen die kanine Amnionmembran erstmalig, sowohl im frischen als auch im kryokonservierten Zustand, in ihren morphologischen, morphometrischen und mikrobiellen Eigenschaften zu beschreiben. Es handelt sich hierbei um ein im Gewebe, welches sowohl im frischen als auch im kryokonservierten Zustand eine maßige bis schlechte Gewebsmorphologie aufweist und dessen Dicke im Verlauf der Untersuchung tendenziell abnimmt. Da es sich hierbei um ein sehr dünnes, fragiles Gewebe handelt, sollte es besonders vorsichtig manipuliert werden. Ob der mäßige bis schlechte Zustand der kaninen Amnionmembran, sowohl im frischen als auch kryokonservierten Zustand, einen Einfluss auf das klinische Ergebnis bei der Anwendung an kornealen Defekten hat, muss durch weiterführende Studien geklärt werden.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Die Kornea (Hornhaut) 3 2.1.1 Histologischer Aufbau der Kornea 3 2.1.2 Physiologie der Kornea 6 2.1.3 Korneale Defekte 7 2.1.3.1 Ulzerationen 7 2.1.3.2 Andere ausgewählte korneale Erkrankungen 8 2.1.4 Therapie der ulzerativen Keratitis 9 2.1.4.1 Antibakterielle Therapie 10 2.1.4.2 Uveitisprophylaxe und Analgesie 12 2.1.4.3 Gewebsstabilisierung 12 2.1.4.4 Erhalt der kornealen Funktionalität und Transparenz 12 2.1.4.5 Gewebsunterstützung 13 2.1.4.6 Chirurgische Therapie 14 2.1.5 Die Hornhauttransplantation (Keratoplastik) 16 2.1.6 Wundheilung der Kornea 17 2.1.6.1 Epithelheilung 17 2.1.6.2 Stromale Wundheilung 18 2.1.6.3 Endothelheilung 19 2.2 Das Amnion 19 2.2.1 Anatomischer Aufbau beim Fleischfresser 20 2.2.2 Histologischer Aufbau 20 2.3 Eigenschaften der Amnionmembran 21 2.3.1 Antiinflammatorische sowie Narben reduzierende Eigenschaften 21 2.3.2 Reepithelisierung 22 2.3.3 Immunmodulatorische Effekte 23 2.3.4 Einfluss auf die Angiogenese 23 2.3.5 Antimikrobielle Eigenschaften 24 2.3.6 Analgetische Wirkung 25 2.3.7 Mechanische Eigenschaften 25 2.3.8 Permeabilität 25 2.4 Anwendung der Amnionmembran 26 2.4.1 Anwendung der Amnionmembran in der Humanmedizin 26 2.4.2 Anwendung der Amnionmembran in der Veterinärmedizin 26 2.4.3 Chirurgische Techniken zur Rekonstruktion der Korneaoberfläche 29 2.4.4 Konservierungsmethoden der AM zur kornealen Rekonstruktion 30 3 Material und Methoden 34 3.1 Gewinnung und Präparation der kaninen Amnionmembran 34 3.1.1 Gewinnung der Fruchthüllen 34 3.1.2 Ein-und Ausschlusskriterien 35 3.1.3 Isolierung der Amnionmembran 35 3.2 Kryokonservierung der kaninen Amnionmembran 36 3.2.1 Herstellung der Kryokonservierungslösung 36 3.2.2 Durchführung der Kryokonservierung und Lagerung der Proben 36 3.2.3 Definition der Untersuchungszeitpunkte 37 3.3 Histologische Probenaufarbeitung 38 3.3.1 Paraffineinbettung und Schnittpräparation 38 3.3.2 Histologische Auswertung 38 3.3.2.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung) 38 3.3.2.2 Periodic Acid Schiff Reaktion (PAS-Reaktion) 38 3.3.2.3 Immunhistologische Färbung 43 3.4 Bakteriologische und mykologische Untersuchung 47 3.5 Statistische Auswertung 48 4 Ergebnisse 49 4.1 Histologische Ergebnisse 49 4.1.1 Dickenmessung der Amnionmembran 49 4.1.2 Beurteilung der Basalmembran des Amnions 52 4.1.3 Morphologische Beurteilung der Amnionmembran 61 4.1.4 Zusammenhang zwischen der Dicke und der Stromabeschaffenheit der Amnionmembran 70 4.2 Bakteriologische und mykologische Ergebnisse 71 5 Diskussion 73 5.1 Material und Methoden 74 5.2 Ergebnisse der Dickenmessung der AM 81 5.3 Ergebnisse der Basalmembranbeurteilung (Immunhistologische Untersuchung) 82 5.4 Ergebnisse der morphologischen Untersuchung der AM 84 5.5 Ergebnisse der bakteriologischen und mykologischen Untersuchung 89 5.6 Fazit 93 6 Zusammenfassung 96 7 Summary 98 Literaturverzeichnis 100 Anhang 119 Protokoll der immunhistologischen Färbung (Laminin) 119

Introduction: The intracellular protozoan Toxoplasma gondii is a uniquely successful parasite that globally exploits a wide host range encompassing essentially all warm-blooded animals including both mammalian and avian species. Felidae are the only definitive hosts in the facultative heteroxenous life cycle. Pathogenesis of T. gondii infection has been studied mainly in mammals. There is only rare information on the immune reaction in chickens although birds are known to be important hosts. Considering that the host’s peripheral blood cells serve as target and thus interact with the intracellular parasite during distribution in the infected host, invasion and intracellular replication of the tachyzoites of T. gondii in different mononuclear cell populations isolated from chicken peripheral blood (erythrocytes, thrombocytes, monocyte-derived macrophages (MM)) were studied. Objectives: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), namely thrombocytes and erythrocytes as well as MM were characterized concerning their capability to host T. gondii. Primary cell infection models were established in order to assess parasite replication. In MM two different strains, ME49 (strain type II) and NED (strain type III), were compared for their replication rate. Cellular response to infection with ME49 was studied in primary MM. Furthermore, the response of the primary macrophages to infection with the ME49 strain was observed by evaluation of gene expression of IL-1ß, IL-12p40, Lipopolysaccharide induced TNF-α factor (LITAF) and inducible nitric oxide synthase (iNOS). Gene transcription data were normalized to those of GAPDH and G6PDH. Parasite replication as well as the fold change of cytokines were statistically evaluated. Results: Primary cultures containing at least 80 % of the respective target cells and suitable for long-term observations were produced by the procedures established in the current study. It was demonstrated that cultivation at 40°C (representing the physiological body temperature in chickens) and using of primary avian cells instead of mammalian cell lines such as Vero or HD11 as host cells distinctly affected parasite replication. T. gondii tachyzoite numbers significantly increased in MM (300 percent at 48 h p.i., ME49) during long-term investigation over 72 h but with initial and final decrease. In comparison, the number of parasite stages increased 1000 percent in Vero and 300 percent in HD11 by only robust increases (ME49), respectively. In contrast, the number of parasite stages significantly decreased in primary erythrocytes and thrombocytes down to less than 20 percent not increasing again. No significant differences were detected between strain type II (ME49) and III (NED) regarding their replication potential in MM. The mRNA expression for cytokines and iNOS of MM infected with viable ME49 tachyzoites was significantly different from uninfected MM and MM incubated with heat-inactivated ME49 tachyzoites. Especially at 8 to 24 h p.i., parasite replication coincided with upregulation of gene expression (IL-1ß, LITAF, iNOS) in infected MM. For infection with heat-inactivated tachyzoites, mRNA regulation increased directly after infection with subsequent decrease between 4 to 12 h p.i. and in this entirely, level of fold change for IL-1 ß was significantly higher (5 times as high), but lower for iNOS (approximately half). In comparison, mRNA upregulation of IL-12p40 was delayed for both with only one peak for infection with heat-inactivated tachyzoites at 8 h p.i., but repeated increase (8, 24, 36 h p.i.) for viable ME49 being in total almost twice as high (at 36 h p.i.). Conclusion: Primary chicken MM are a suitable host cell system to study immune reaction to T. gondii tachyzoite infection, while erythrocytes and thrombocytes are not supporting parasite replication. Avian MM are likely an important vehicle for distributing the parasite from blood vessels into different organs and thus promote infection. In addition to this putative Trojan horse function, MM react to pathogen invasion by pro-inflammatory upregulation of IL-1ß, IL-12p40, LITAF and iNOS. Activation of these mediators points to contribution of MM to immunity against T. gondii in chicken. These seemingly contradictory findings during T. gondii infection of MM needs further investigation. It was hypothesized that nucleated avian erythrocytes and thrombocytes might also serve as host cells, however, no parasite replication could be demonstrated in these cells. Nevertheless, they may though play a role in the progress and systemic distribution of infection which should be investigated in more detail.:1 INTRODUCTION ............................................................................... 1 1.1 TOXOPLASMA GONDII................................................................................... 1 1.1.1 Structures and life cycle .............................................................................. 1 1.1.2 Life cycle .................................................................................................... 3 1.1.3 Genotypes.................................................................................................. 4 1.2 ZOONOSIS .................................................................................................... 5 1.3 RELEVANT DIFFERENCES OF AVIAN SPECIES FROM MAMMALS AS IH ..... 7 1.4 T. GONDII INFECTION IN CHICKENS ............................................................. 8 1.5 AIMS AND FOCUSES OF THIS STUDY .......................................................... 9 2 RESULTS........................................................................................ 10 2.1 1 ST PUBLICATION ...................................................................................... 10 2.2 2ND PUBLICATION ....................................................................................... 19 2.3 3RD PUBLICATION: ...................................................................................... 29 3 DISCUSSION .................................................................................. 38 3.1 ESTABLISHMENT OF PRIMARY BLOOD CELL CULTURES ......................... 38 3.2 CHICKEN ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES.................................... 40 3.3 MONOCYTE-DERIVED MACROPHAGES (MM) ............................................ 41 3.4 T. GONDII STRAIN DIVERSITY .................................................. .................. 44 3.5 PRIMARY CELLS AS A TOOL FOR T. GONDII RESEARCH ......................... 46 3.6 OUTLOOK..................................... ............................................................... 47 3.7 CONCLUSIONS ............................................................................................ 48 4 SUMMARY........................................................................ .............. 49 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................ .......... 51 6 REFERENCE LIST................................................................ .......... 53 / Einleitung: Der intrazellulär-lebende Protozoe Toxoplasma gondii ist einzigartig erfolgreich. Er nutzt weltweit eine große Bandbreite verschiedener Wirtsspezies, zu denen im Wesentlichen alle warmblütigen Tiere, vor allem Säugetiere und Vögel, zählen. Feliden sind die alleinigen Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus. Die Pathogenese der T. gondii-Infektion wurde hauptsächlich im Säugetier betrachtet. Über die Immunantwort im Huhn gibt es nur wenige Informationen, obwohl Vögel als Wirtsspezies eine große Bedeutung haben. Wegen der Schlüsselrolle, welche den peripheren Blutzellen des Wirtes im Verlauf der Infektion hinsichtlich der Verteilung des eindringenden Parasiten im Wirt zukommt, wurden Invasion und Vermehrung von T. gondii-Tachyzoiten in verschiedenen mononukleären Zellpopulationen (Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten-abstammende Makrophagen (MM)) betrachtet. Ziele der Arbeit: Periphere mononukleärer Blutzellen (PBMCs), im Detail Erythrozyten, Thrombozyten und MM, sollten hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für T. gondii charakterisiert werden. Zur Prüfung der Parasitenvermehrung wurden Infektionsmodelle mit Primärzellen etabliert. In MM wurden zudem zwei verschiedene Stämme (ME49, Typ II und NED, Typ III) in ihrer Replikationsrate verglichen und die zelluläre Immunantwort (ME49) untersucht. Die Immunantwort der MM wurde mittels Genexpressionsanalyse von IL-1 ß, IL-12p40, Lipopolysaccharid-induzierter TNF-α Faktor (LITAF) und der induzierbaren Stickstoffmonooxid-Synthase (iNOS) untersucht und die Infektion lebender mit Hitze-inaktivierten Tachyzoiten (ME49) verglichen (über 36 h p.i.). Die Transkription der Zielgene wurde gegen GAPDH und G6PDH normalisiert und diese Daten sowie die der Parasitenvermehrung statistisch evaluiert. Ergebnisse: Die hier entwickelten Methoden resultieren in Primärzellkulturen mit ausreichender Reinheit (Anteil Zielzellen ≥ 80 Prozent) und Verwendbarkeit. Die Bedeutung von 40°C (physiologische Körpertemperatur Huhn) als Kultivierungstemperatur sowie der Verwendung von Primärzellen anstatt immortalisierter Zelllinien (Vero, HD11) für die Parasitenvermehrung von T. gondii konnten gezeigt werden. Der signifikante Anstieg der Tachyzoitenzahl in MM über 72 h Betrachtung (etwa 300 Prozent 48h p.i., ME49) war begleitet von initialem und finalem Abfallen. Im Vergleich dazu haben Vero-Kulturen (1000 Prozent Vermehrung, ME49) und HD11 (300 Prozent Vermehrung, ME49) einen linearen Anstieg. Infizierte Erythrozyten und Thrombozyten zeigen im Gegensatz zu MM einen signifikanten Abfall (≤ 20 Prozent bei 12 h p.i.) der Parasitenstadien ohne erneuten Wiederanstieg. In MM wurden für die beiden untersuchten Tachyzoiten-Stämme (ME49, NED) keine signifikanten Unterschiede in der arasitenvermehrung festgestellt. Die Genexpressionsanalyse der Zytokine und iNOS zeigte im Vergleich signifikante Unterschiede zwischen uninfizierten bzw. mit Hitze-inaktivierten Tachyzoiten infizierten MM zu den mit lebenden Stadien infizierten MM. Insbesondere im Zeitraum 8 bis 24 h p.i. überschneiden sich diese Feststellungen zur Hochregulation der Genexpression (IL-1 ß, LITAF, iNOS) mit der detektierten Parasitenvermehrung in lebend-infizierten MM. Hitze-inaktivierte Tachyzoiten steigern die Genexpression direkt nach der Infektion mit anschließendem Abfall (4 bis 12 h p.i.), wobei im Vergleich für IL-1 ß ein signifikant höherer Anstieg (5 facher fold change), aber ein deutlich niedrigerer für iNOS (etwa halber fold change) festgestellt wurde. Die Regulation von IL-12p40 war verspätet mit nur einem Anstieg (8 h p.i.) bei Infektion mit Hiltze-inaktivierten Tachyzoiten, aber wiederholtem Anstieg (8, 24, 36 h p.i.) bei lebenden ME49 (etwa zweifacher fold change). Schlussfolgerungen: Primäre Hühner-MM sind als Wirtszell-System im Infektionsversuch mit T. gondii-Tachyzoiten gut geeignet für Studien zur Immunantwort. Im Gegensatz dazu sind Erythrozyten und Thrombozyten durch fehlende Parasitenvermehrung ungeeignet. Die Empfänglichkeit der MM für Tachyzoiten weist auf Ihre besondere Bedeutung im Verlauf der Verbreitung des Parasiten im Wirtsorganismus hin. Unabhängig von dieser Funktion als Trojanisches Pferd sind MM gleichzeitig von Bedeutung für die Vermittlung der Immunantwort, wie die Hochregulation von IL-1 ß, IL-12p40, LITAF and iNOS als Mediatoren einer proinflammatorischen Aktivierung zeigen. Diese zunächst gegensätzlich erscheinenden Erkenntnisse benötigen weitere Betrachtung. Darüber hinaus sollte die Bedeutung von Erythrozyten und Thrombozyten für den Verlauf der T. gondii-Infektion im Wirt trotz fehlender Wirtszelleignung genauer untersucht werden.:1 INTRODUCTION ............................................................................... 1 1.1 TOXOPLASMA GONDII................................................................................... 1 1.1.1 Structures and life cycle .............................................................................. 1 1.1.2 Life cycle .................................................................................................... 3 1.1.3 Genotypes.................................................................................................. 4 1.2 ZOONOSIS .................................................................................................... 5 1.3 RELEVANT DIFFERENCES OF AVIAN SPECIES FROM MAMMALS AS IH ..... 7 1.4 T. GONDII INFECTION IN CHICKENS ............................................................. 8 1.5 AIMS AND FOCUSES OF THIS STUDY .......................................................... 9 2 RESULTS........................................................................................ 10 2.1 1 ST PUBLICATION ...................................................................................... 10 2.2 2ND PUBLICATION ....................................................................................... 19 2.3 3RD PUBLICATION: ...................................................................................... 29 3 DISCUSSION .................................................................................. 38 3.1 ESTABLISHMENT OF PRIMARY BLOOD CELL CULTURES ......................... 38 3.2 CHICKEN ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES.................................... 40 3.3 MONOCYTE-DERIVED MACROPHAGES (MM) ............................................ 41 3.4 T. GONDII STRAIN DIVERSITY .................................................. .................. 44 3.5 PRIMARY CELLS AS A TOOL FOR T. GONDII RESEARCH ......................... 46 3.6 OUTLOOK..................................... ............................................................... 47 3.7 CONCLUSIONS ............................................................................................ 48 4 SUMMARY........................................................................ .............. 49 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................ .......... 51 6 REFERENCE LIST................................................................ .......... 53

Introduction: Cryptosporidium parvum is a protozoan parasite that causes diarrhoea in many host species worldwide. CpCDPK1 appears to be essential for invasion and a promising drug target. Aim of the study: The aims of this study were to expand the knowledge of CpCDPK1. To achieve that, attempts were made to inhibit this gene by BKI-1294 in vitro and generate CpCDPK1 KO C. parvum. To maintain the genetically modified parasites, I studied the suitability of infection and propagation in a new animal model RAGgc × IFN-gamma mouse and in vitro model COLO - 680 N cell line. Animals, materials and methods: 4×106 freshly excysted C. parvum sporozoites were seeded into transfected GFP-MDBK cultures at the confluency of 70 – 80 % and simultaneously exposed to 500 nM of BKI-1294. IFA was applied to observe the invasion and host cell actin accumulation. Guide RNA (gRNA) for CRISPR-mediated transfection was designed and the Nluc-neoR repair cassette was flanked with 50 bp long 5’- and 3’UTR of CpCDPK1 by PCR. Transfection was performed by octaarginine transportation and compared to electroporation. COLO - 680 N cells with the confluency of 70 – 80% were infected with 4×106 non-transfected and transfected sporozoites of C. parvum. To establish a laboratory animal model for propagation of C. parvum and drug screening RAGgc × IFN-gamma mice were infected with 500 (G2), 1000 (G3) and 5000 (G4) of oocysts. BALB/c WT mice were inoculated with 5000 (G1) oocysts as control. Faeces were sampled for C. parvum DNA extraction. Real time PCR was applied to calculate the oocyst yield. Results: In the presence of 500 nM BKI-1294, parasite-induced host cell actin accumulation was not observed at 24 and 48 h after inoculation in vitro pointing at altered infectivity of CDPK inhibited sporozoites. Extracellular noninvasive sporozoites were found at 24 h p.i., only one meront was observed in a host cell at 72 h p.i. CRISPR-mediated gene editing was applied to C. parvum to knock out CDPK1. Transfected C. parvum were found in COLO-680 N cells through 6 passages. However, no newly generated oocysts were harvested. RAGgc × IFN-gamma mice were tested suitable as an animal model for C. parvum infection studies and oocyst propagation. These crossbred mice are very sensitive to infection at doses as low as 500 oocysts. They displayed emaciation, rough fur and trembling. The survival percentage was 71.4 % (G2), 85.7 % (G3), 57.1 % (G4) and 100 % (G1) at the end of study. Oocyst yield of 108 OPG was calculated in the crossbred mice whereas only 104 OPG were counted in Balb/C mice. Yields did not differ significantly (P > 0.05) in crossbred mice infected with different oocysts doses. Conclusions: 1.The function of CpCDPK1 is obviously important to the invasion process including attachment and utilization of host cell actin to form PV. This assumption was confirmed by CDPK inhibition and genetic KO. However, methods that increase the transfection efficiency are needed to enhance the generation of KO C. parvum. 2. The transfection method mediated by octargninine is superior to electroporation in consideration of DNA consumption and requirement of device. 3. Due to the low required infection dose and clinical manifestation RAGgc × IFN-gamma mice appear very well suited to serve as an in vivo laboratory model of C. parvum infection and for propagation of particularly transgenic C. parvum strains. 4. COLO – 680 N cells appear suited to be an in vitro model for C. parvum infection and transfection study, however, not qualified for propagation.:Contents 1. Introduction 1 2. Literature Review 2 2.1 Biology 2 2.1.1 Systematics 2 2.1.2 Life cycle 2 2.1.3 Tenacity of oocysts 4 2.1.4 Excystation of oocysts and invasion of host cells 4 2.1.5 Formation of the PV 6 2.1.6 Nutrient supply by the host 7 2.2 Epidemiology 8 2.2.1 Human Cryptosporidiosis 8 2.2.2 Animal Cryptosporidiosis 9 2.3 Detection and Diagnosis 11 2.4 Treatment options 12 2.5 Hygiene 14 2.6 Vaccine 16 2.7 In vitro and vivo Models 16 2.8 Structure and function of Calcium-dependent protein kinases 18 3. Animals, materials and methods 21 3.1 Animals and materials 21 3.1.3 Mice 21 3.1.4 Cells 21 3.1.5 C. parvum oocysts 21 3.1.6 Reagents 21 3.1.7 Plasmids and oligonucleotides 23 3.1.7.1 Plasmids 23 3.1.7.2 Primers and probes 24 3.1.8 Kits 25 3.1.9 Instruments and software 25 3.2 Methods 26 3.2.1 Preparation of reagents 26 3.2.2 C. parvum oocysts maintaince 27 3.2.3 PCR 27 3.2.3.1 Amplification of NdeI and AatII flanked 5’CDPK1 27 3.2.3.2 Annealing of gRNA 27 3.2.3.3 Amplification of repair cassette via Touchdown PCR (TD-PCR) 28 3.2.3.4 Colony PCR 29 3.2.3.5 Real-time PCR for C. parvum hsp70 30 3.2.4 Restriction enzyme digestion 31 3.2.4.1 Restriction enzyme digestion of pA - pD 31 3.2.4.2 Enzyme digestion and dephosphorylation of p185 31 3.2.5 Agarose gel electrophoresis 32 3.2.6 Gel purification 32 3.2.7 Ligation 33 3.2.7.1 Ligation of CDPK1 KO plasmids 33 3.2.7.2 Ligation of gRNA and p185 33 3.2.8 Transformation 34 3.2.9 Plasmid extraction 34 3.2.10 C. parvum oocysts excystation 35 3.2.11 C. parvum infection 35 3.2.11.1 In vitro infection 35 3.2.11.2 C. parvum infection in mice 36 3.2.12 Transfection 36 3.2.12.1 Electroporation for MDBK transfection 36 3.2.12.2 Electroporation for C. parvum transfection 37 3.2.12.3 CpCDPK1 knock out through Cell penetrating peptide (CPP) - octaarginine mediated transfection 38 3.2.13 Geneticin screening for GFP-MDBK cells 39 3.2.14 Indirect immunofluorescent assay (IFA) 39 3.2.15 Animal feeding and body conditioning score (BCS) monitoring 40 3.2.16 Faecal sample collection 43 3.2.17 DNA extraction and oocysts per gram (OPG) determination of fecal samples 43 3.2.18 Statistical analysis 44 4. Results 45 4.1 CDPK1 knockout by REMI 45 4.1.1 Construction of Knockout plasmid 45 4.1.2 Electroporation protocol and in vitro analysis 49 4.2 CDPK1 knockout by CRISPR/Cas 9-mediated gene editing 50 4.2.1 Constructing CRISPR/Cas9_CpCDPK1_7 plasmid 51 4.2.2 Amplification of CDPK1 flanked repair cassette 52 4.2.3 Knockout CDPK1 via CRISPR/cas 9 53 4.2.3.1 Electroporation and in vitro analysis 53 4.2.3.2 CPP transfection and in vitro analysis 55 4.2.3.3 Genetic assay of transfection 57 4.3 In vitro and in vivo model for infection and propagation 58 4.3.1 In vitro model - C. parvum cultivation in COLO - 680 N cells 58 4.3.2 In vivo model Infection pattern of C. parvum in RAGgc x IFN-g KO mice 60 4.3.2.1 Clinical symptoms 60 4.3.2.2 Oocysts excretion 63 4.4 In vitro inhibition of CDPK1 66 4.4.1 Generating bAct-GFP-MDBK cells 67 4.4.2 Influence of CDPK1 inhibition on infection 70 5. Discussion 73 5.1 Sub-cloning 73 5.2 Inhibition of CpCDPK1 delays the host cell actin accumulation in vitro 73 5.3 RAGgc x IFN-gamma KO mice for C. parvum propagation 76 5.4 CpCDPK1 knockout by CRISPR/cas 9 79 5.5 COLO-680 N cells are not suited to propagate C. parvum in vitro 82 6. Summary 85 7. Zusammenfassung 87 8. References 89