Der generalisierte Einsatz von Antibiotika im medizinischen Sektor erzeugt einen hohen Selektionsdruck auf Bakterien. Daher weisen bakterielle Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen eine zunehmende Inzidenz auf. Gegen Antibiotika multiresistente Erreger (MRE), insbesondere Multiresistente Gram-Negative Erreger (MRGN), stellen in Krankenhäusern, aber auch in Tierkliniken ein ernstzunehmendes Problem dar. Das Therapieversagen bei der Behandlung von Infektionen mit 3MRGN oder 4MRGN gefährdet die Gesundheitsversorgung. Die Bedeutung effektiver Kontrollmaßnahmen in der Unterbrechung nosokomialer Infektionsketten rückt in den Fokus. Infektionsprophylaxe wird durch eine Umweltdekontamination in Form von Reinigung und Desinfektion durchgeführt. Zertifizierte Biozide werden routinemäßig eingesetzt. Jedoch weisen einigen Studien auf eine Toleranz von Bakterien gegenüber Desinfektionsmitteln hin. Spezifische Dekontaminationsmaßnahmen könnten daher für die Bekämpfung von MRGN notwendig sein. Ziel der Untersuchung war es zu evaluieren, ob klinische 3MRGN und 4MRGN im Vergleich zu nicht resistenten Referenzstämmen unempfindlicher gegenüber Desinfektionsmitteln reagieren und Desinfektionsprotokolle gegebenenfalls angepasst werden müssen. Dazu wurden sechzehn klinische Stämme der Gattungen Acinetobacter, Pseudomonas und Klebsiella wurden mit fünf korrespondierenden Referenzstämmen in vitro auf deren Empfindlichkeit gegenüber den gängigen Desinfektionsmitteln Natriumhypochlorit, Ethanol, Peressigsäure und Benzalkoniumchlorid untersucht. Die Effizienz wurde anhand von vier aufeinander aufbauenden Testverfahren gemäß den Richtlinien des Verbunds für angewandte Hygiene (VAH, 2015) beurteilt. Diese beinhalten die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) und die Durchführung von Suspensionstests und Keimträgerversuchen. Es wurden wirksame Konzentrations-Zeit-Relationen für jeden Teststamm und jede aktive Substanz determiniert. Die Ergebnisse der Suspensionstests über- beziehungsweise unterschreiten die Werte der MHK-Bestimmung um ein Vielfaches. P. aeruginosa tolerierte die höchsten Benzalkoniumchlorid-Konzentrationen, während Acinetobacter-Stämme am empfindlichsten reagierten. Im Vergleich zu Suspensionstests wurden in den praxisnahen Keimträgerversuchen signifikant höhere Konzentrationen an Peressigsäure und Benzalkoniumchlorid ermittelt. Die geringere Empfindlichkeit von P. aeruginosa gegenüber Benzalkoniumchlorid wurde bestätigt. Signifikante Unterschiede zwischen klinischen 3MRGN, 4MRGN und den jeweiligen Referenzstämmen in ihrer Sensitivität gegenüber Bioziden wurden - unabhängig von der angewandten Testmethodik - nicht festgestellt. Im Vergleich der Bakterienspezies wiesen Pseudomonaden eine geringere Sensibilität gegenüber Benzalkoniumchlorid auf, jedoch lagen die bakteriziden Konzentrationen in jedem Fall unterhalb der gelisteten Anwendungskonzentrationen. Der Einfluss organischer Belastung auf die Wirksamkeit von Natriumhypochlorit war signifikant. Die Expositionsdauer führte zu keiner signifikanten Absenkung der Wirkkonzentrationen. Die Annahme, dass antibiotikaresistente Bakterien zwangsläufig biozidresistent sind, konnte anhand unserer Ergebnisse nicht bestätigt werden. Spezielle Desinfektionsprotokolle sind nicht notwendig, solange eine konsequente Einhaltung der durch den Hersteller vorgeschriebenen Konzentrations-Zeit-Relationen gegeben ist. Die Höhe der Desinfektionsmittelkonzentration ist für den Desinfektionserfolg ausschlaggebend, während der Einfluss der Einwirkzeit vernachlässigbar ist. Die MHK-Bestimmung eignet sich im Gegensatz zu praxisnahen Keimträgerversuchen nicht zur Ableitung von Anwendungs-konzentrationen von Desinfektionsmitteln.:1 Einleitung 2 Literatur 2.1 Desinfektion 2.1.1 Allgemeines 2.2 Wirksamkeitsprüfung chemischer Desinfektionsmittel 2.2.1 Allgemeines 2.2.2 VAH-Richtlinie 2.2.3 Minimale Hemmkonzentration 2.2.4 Qualitativer Suspensionstest 2.2.5 Quantitativer Suspensionstest 2.2.6 Quantitativer Keimträgertest 2.3 Bakterielle Resistenzen gegenüber Antibiotika 2.3.1 Allgemeines 2.3.2 Nosokomiale Infektionen 2.3.3 Acinetobacter spp. 2.3.4 Klebsiella spp. 2.3.5 Pseudomonas aeruginosa 2.4 Bakterielle Resistenzen gegenüber Bioziden 2.4.1 Allgemeines 3 Veröffentlichungen 3.1 Veröffentlichung 1 3.2 Veröffentlichung 2 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Referenzen 7.1 Literaturverzeichnis 7.2 Tabellenverzeichnis 8 Danksagung

No description available.

Einleitung: Reproduktionsstörungen sind die wichtigste Abgangsursache von Sauen. Nicht selten ist der Uterus erkrankt. Einige der Sauen mit Uteropathien sind klinisch auffällig, andere hingegen auch mittels konventioneller B-Mode-Ultrasonographie nicht zu erkennen. Bei solchen Sauen erscheint es sinnvoll, zusätzlich zum B-Mode dopplersonographisch zu untersuchen, um anhand der Uterusdurchblutung ergänzende diagnostische Informationen zu erhalten, wie es schon vormals bei Stuten und Kühen erfolgte. Zur Beurteilung pathologischer Perfusionsverhältnisse des Uterus beim Schwein bedarf es jedoch der Kenntnis des physiologischen Zustandes, die bisher fehlt. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es, die Durchblutung des Uterus von Jungsauen mittels transabdominaler Dopplersonographie während des Sexualzyklus zu charakterisieren. Dabei sollte auch getestet werden, ob sich diese Methode intra vitam, d.h. bei der lebenden Sau eignet. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 15 zyklussynchronisierte, gynäkologisch gesunde Jungsauen einbezogen und in dem darauffolgenden spontanen Sexualzyklus zwischen Proöstrus und Diöstrus in einem mobilen Kastenstand dopplersonographisch untersucht. Es fanden Color, Power und Pulse Wave Doppler Anwendung, um die uterine Perfusion anhand der Gefäßversorgung innerhalb und zwischen den Uterusschlingen zu charakterisieren. Durch Aufstallung der Jungsauen in einem mobilen eigens angefertigten Stand wurden Tierbewegungen soweit reduziert, dass Untersuchungen mit Color und Power, nicht aber Pulse Wave Doppler möglich waren. Zudem gelang es mittels Pulse Wave Doppler nicht, das Messtor (gate) aufgrund der geschlängelten Gefäßanatomie konstant auf uterinen Gefäßen zu platzieren. Im Vergleich zum Power Doppler überzeugte der Color Doppler durch geringere Empfindlichkeit für Bewegungsartefakte und höhere Bildaufbauraten. Er wurde deshalb zur Auswertung aufgezeichneter Einzelbilder und Videos genutzt. Dabei kam die Software PixelFlux® zur Anwendung, mit deren Hilfe eine in ihrer Größe standardisierte „Region of Interest“ (ROI) hinsichtlich Anzahl und Farbton der vorhandenen Pixel ausgewertet wurde, um Blutflussgeschwindigkeit, perfundierte Fläche, Blutflussintensität, sowie Resistenz- und Pulsatilitätsindex zu berechnen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte in SPSS. Da die Zyklusphasen der untersuchten Jungsauen in ihrer Länge variierten, wurden diese normalisiert und an der Ovulation als Tag 2 ausgerichtet. Die danach für jeden Zyklustag vorhandenen Werte/Parameter wurden entsprechend der Zyklusphasen gemittelt und nach Bonferroni-Korrektur mit dem Friedman- und Wilcoxontest analysiert. Zusammenhänge zwischen den Parametern wurden mit der Korrelationsanalyse nach Spearman oder Pearson untersucht. Ergebnisse: Uterine Durchblutung konnte jederzeit zwischen und gelegentlich auch innerhalb der Uterusschlingen dargestellt werden. Alle erhobenen Blutflussparameter zeigten im Verlauf des Zyklus einen charakteristischen Verlauf. Blutflussgeschwindigkeit, durchblutete Fläche und Blutflussintensität waren im Proöstrus hoch, sanken im Östrus, um im Met- und den meisten Teilen des Diöstrus niedrig zu bleiben und danach wieder anzusteigen. Alle drei Parameter korrelierten mittelstark bis stark positiv miteinander (r: 0,63-0,95; p<0,05). Nahezu reziprok verhielten sich Resistenz- und Pulsatilitätsindex mit den vorherigen Parametern. Sie korrelierten mit der Blutflussgeschwindigkeit, der durchbluteten Fläche und der Blutflussintensität mittelstark bis stark negativ (r: -0,52 – -0,88; p<0,05), miteinander jedoch mittelstark bis stark positiv (r: 0,6-0,85; p< 0,05). Schlussfolgerungen: In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass die Dopplersonographie zur Charakterisierung der Durchblutung des Uterus bei im Stand immobilisierten Jungsauen prinzipiell möglich ist. Während Pulse Wave und Power Doppler nicht oder nur begrenzt anwendbar waren, konnten mittels Color Doppler charakteristische Blutflussveränderungen während des Sexualzyklus festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen zu weiterführenden Untersuchungen unter anderem im Rahmen der Abklärung von Ursachen uterin-bedingter Sub- bzw. Infertilität.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Sexualzyklus der Sau 4 2.2 Gefäßversorgung des Uterus 6 2.3 Dopplersonographie 8 2.3.1 Physikalische Grundlagen 8 2.3.2 Dopplermodi 9 2.3.3 Insonationswinkel 11 2.3.4 Artefakte 12 2.3.5 Auswertung von Doppleruntersuchungen 13 2.3.5.1 Qualitative Analyse 13 2.3.5.2 Semiquantitative Analyse 14 2.3.5.3 Quantitative Analyse 15 2.3.5.4 Pixelanalytische Methode 16 2.3.5.4.1 Vergleich pixelanalytischer Programme 17 2.3.6 Dopplersonographie am ingraviden Uterus in der Humanmedizin 18 2.3.7 Dopplersonographie am ingraviden Uterus in der Veterinärmedizin 19 3 Publikation 21 4 Diskussion 22 4.1 Immobilisation der Jungsau 23 4.2 Insonationswinkel 24 4.3 Uterusgefäße. 25 4.4 Analysen von Einzelbildern bzw. Videos. 27 5 Zusammenfassung 29 6 Summary 31 7 Literaturverzeichnis Anhang Danksagung

Einleitung Der Evaluierung und Behandlung von Schmerzen beim Nutztier wird eine große Bedeutung für die Bewertung des Tierwohls zugeschrieben. Produktionsbedingt werden Schafe schmerzhaften zootechnischen Maßnahmen ausgesetzt. Zusätzlich können sie krankheitsbedingt schmerzhafte Zustände, wie die Dermatitis interdigitalis contagiosa (Dinco) entwickeln. Da sich Schmerz beim Tier nicht direkt erfassen lässt, werden seine Auswirkungen auf physiologische, biochemische und ethologische Prozesse ermittelt. Die Beurteilung von Verhalten durch erfahrene Beobachter liefert gute Ergebnisse für die Evaluierung von Schmerzen. Beim Schaf ist die Erkennung von Schmerz eine klinische Herausforderung, denn als potenzielles Beutetier tendiert es instinktiv dazu, diesen nicht zu zeigen. Wiederkäuer sind nicht für eine routinemäßige Applikation einer Allgemeinanästhesie geeignet. Techniken der Lokalanästhesie eignen sich auch aus ökonomischer Sicht besonders gut. Für Eingriffe an der distalen Gliedmaße beim Schaf ist die retrograde intravenöse Stauungsanästhesie (RIVA) eine beschriebene Methode, um die Zehe zu betäuben. Bisher hat sie beim Schaf noch keine breite Anwendung in der Praxis gefunden. Ziel Ziel der Studie war, Verhaltensmerkmale zu identifizieren, mit denen Schafe akute und chronische Schmerzen zum Ausdruck bringen. Zusätzlich wurde überprüft, welche der beobachteten Verhaltensmerkmale sich eignen, den durch Manipulationen am Tier verursachten Stress zu identifizieren. Darüber hinaus sollte die Durchführbarkeit, Sicherheit und Wirksamkeit der RIVA überprüft werden. Es sollte weiterhin ermittelt werden, ob das Schmerzmanagement durch die Kombination aus RIVA und Sedation verbessert werden kann und ob sich diese Methode positiv auf das postoperative Wohlergehen auswirkt. Tiere, Material und Methoden Die Tierversuchsanzeige der Studie wurde durch das Landesverwaltungsamt in Sachsen-Anhalt geprüft und unter AZ 42502-3-734 bestätigt. Es wurden 36 Merinofleischschafen mit Dinco und 12 gesunde Kontrolltiere eingeschlossen. Bei den Tieren wurde das Verhalten während der Behandlung der Läsionen unter verschiedenen Methoden des Schmerzmanagements (RIVA, Sedation mit Xylazinhydrochlorid + RIVA, Placebo) oder alleiniger Klauenpflege (Kontrolle) erfasst. Die Beurteilung schloss zusätzlich auch die Zeit prä- sowie postoperativ in der Herde ein. Die beobachteten Merkmale wurden mit numerischen Scores bewertet und die Ausprägung zwischen den Tieren der vier Gruppen verglichen. Die Auswertung erfolgte mit SAS, 2012 durch Nutzung eines generalisierten linearen gemischten Modells (GLMM) unter Annahme einer Bernoulli-Verteilung. Die numerische Umsetzung erfolgte innerhalb der Prozedur MCMC. Die Einhaltung der vorgegebenen Irrtumswahrscheinlichkeit (p=0,05) der multiplen Vergleiche wurde durch eine Bonferroni-Korrektur gesichert. Ergebnisse Die deutlichsten Hinweise auf das Vorliegen chronischer Schmerzen lieferten Merkmale wie Entlastungshaltung (p≤0,05), Trippeln (p≤0,05) und Veränderungen im Gangbild (p≤0,05). Erkrankte Schafe setzten häufiger Harn ab (p≤0,05). Vermehrtes Zähneknirschen trat bei diesen Tieren nur stressassoziiert vor der Behandlung auf (p≤0,05). Während der Behandlung konnten Merkmale wie Wedeln mit dem Schwanz (p≤0,05) und gesteigerte Abwehrbewegungen (p≤0,05) als Ausdruck akuten Schmerzes identifiziert werden. Das Schlagen mit dem Kopf schien vor allem stressassoziiert durch die Rückenlage aufzutreten. Die RIVA konnte erfolgreich durchgeführt werden. Bei zwei Tieren kam es zu lokalen Veränderungen im Bereich der Applikationsstelle und des Stauschlauches, die vollständig abheilten. Eine Reduktion (p>0,05) der Abwehrbewegungen während der Behandlung belegt die Wirksamkeit der RIVA. Es ist davon auszugehen, dass die RIVA-Tiere aufgrund des Handlings in Rückenlage vergleichbar viel Stress empfunden haben wie die Placebo-Tiere. Eine Sedation führte zusätzlich zur Reduktion der Ausprägung schmerz- und stressassoziierter Merkmale. Postoperativ entlasteten die Tiere der Behandlungsgruppen die betroffene Gliedmaße signifikant häufiger (p≤0,05) als die gesunden Tiere. Schlussfolgerung Die ausgewählten Merkmale erwiesen sich als geeignet, Schmerzen im Bereich der Gliedmaße beim Schaf zu identifizieren. Die Beurteilung erfordert allerdings die Beobachtung durch eine trainierte Person. Die RIVA ist eine einfach durchführbare und sichere Methode der Schmerzausschaltung an der Zehe von Schafen. Eine zusätzliche Sedation reduziert die Stress- und Schmerzantwort. Dieses Management hat zudem einen positiven Effekt auf das postoperative Wohlergehen der Tiere. Dennoch wurde deutlich, dass das überprüfte Management nicht ausreichend ist, um den postoperativen Schmerz vollständig zu behandeln. Eine weitere Komponente im multimodalen Schmerzmanagement ist daher erforderlich und muss Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Schmerz bei Mensch und Tier 2.1.1 Nozizeption und Schmerzempfinden 2.1.1.1 Schmerzeigenschaften 2.1.1.2 Sensibilisierung 2.1.2 Schmerz und Stress 2.2 Erfassung von Schmerz und Stress beim Tier 2.2.1 Ethologie 2.2.1.1 Erfassung ethologischer Merkmale 2.2.1.2 Schmerzverhalten beim Schaf 2.3 Schmerzmanagement in der Nutztierhaltung 2.3.1 Anästhesie und Analgesie beim kleinen Wiederkäuer 2.3.1.1 Retrograde intravenöse Stauungsanästhesie 2.3.1.2 Arzneimittelrechtliche Aspekte 2.3.2 Multimodales Schmerzmanagement 2.4 Dermatitis interdigitalis contagiosa (Moderhinke) als Schmerzmodell 2.5 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Diskussion 5.1 Ziel und Ergebnisse der Studie 5.2 Erfassung ethologischer Merkmale 5.2.1 Einfluss des Beobachters 5.2.2 Einfluss von Stress 5.2.3 Wertung der Merkmalserfassung 5.2.4 Fazit 5.3 Schmerzmanagement 5.3.1 Lokalanästhesie mit Procainhydrochlorid 5.3.2 Xylazinhydrochlorid 5.3.3 Kombination aus Sedation mit Xylazinhydrochlorid und Lokalanästhesie mit Procainhydrochlorid 6 Zusammenfassung 6.1 Einleitung 6.2 Ziel 6.3 Tiere, Material und Methoden 6.4 Ergebnisse 6.5 Schlussfolgerung 7 Summary 7.1 Introduction 7.2 Objective 7.3 Animals, Material and Methods 7.4 Results 7.5 Conclusion 8 Literaturverzeichnis 9 Danksagung

Ziel dieser Studie ist die Charakterisierung der anatomischen Verhältnisse im äußeren Gehörgang brachyzephaler Rassen, speziell die Vermessung des Porus acusticus externus anhand computertomografischer Untersuchungen und der Vergleich mit normozephalen Hunden. Weiterhin wurde durch otoskopische und zytologische Untersuchungen ein möglicher Zusammenhang mit einer Otitis externa untersucht.

Die Kryptosporidiose der Kälber wird zumeist durch die Spezies C. parvum verursacht, einem ubiquitär verbreiteten Parasiten mit zoonotischem Potential. Die Infektion geht insbesondere in den ersten Lebenswochen mit wässrigem Durchfall einher, was in der Nutztierhaltung durch eine erhöhte Sterblichkeit enorme wirtschaftliche Verluste bedeuten kann. Neben einer Vielzahl anderer Einflussfaktoren trägt der Erreger mit unterschiedlicher Virulenz zur Ausprägung der Klinik bei. Aufgrund limitierter kausaler Therapeutika ist das Desinfektionsmanagement auf einem Kälber haltenden Betrieb bei der Bekämpfung entscheidend. Epidemiologische Studien sind essentiell, um die eher unterschätze Parasitose im Sinne eines One-Health-Ansatzes mehr in den Fokus der Aufmerksamkeit zu rücken. Mit der Testung verschiedener chemischer Substanzen und UV-Bestrahlung auf die Wirksamkeit gegen C. parvum-Oozysten sollten mögliche Alternativen zu den antiprotozoären Desinfektionsmitteln für das Labor aufgezeigt werden. Anhand von Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus wurden C. parvum-Feldisolate von Kälbern aus sächsischen Milchviehbetrieben molekulargenetisch charakterisiert, um einen Überblick über die im Untersuchungsgebiet verbreiteten Subtypen generieren zu können. Diese Feldisolate wurden außerdem in vitro unter standardisierten Laborbedingungen in humanen Adenokarzinomzellen (HCT-8) auf Zytopathogenität getestet, um möglicherweise auf die Erregervirulenz in vivo rückschließen zu können. C. parvum-Oozysten eines Laborstammes wurden in denaturiertem Ethanol, Ethanol (70 %, 100 %), Wasserstoffperoxid (H2O2, 3 %, 10 %) oder Natriumhypochlorit (NaOCl, 1,5 %, 3 %, 6 %) über 30 min, 2 h, 4 h, 12 h oder 24 h in Suspension inkubiert oder auf einem Keimträger über 10 min, 20 min und 30 min einer UV-C-Strahlung ausgesetzt. Anschließend wurden mit diesen Oozysten HCT-8-Zellen infiziert und die Infektiosität mittels Real-Time-PCR quantifiziert. In einer epidemiologischen Studie wurden bis zu 13 Kälber aus 61 Milchviehbetreiben klinisch untersucht. Entnommene Kotproben wurden nach ihrer Konsistenz gescort und semiquantitativ mittels Heine-Färbung auf Cryptosporidium spp. untersucht. Gewonnene Feldisolate wurden in vitro zur Infektion von HCT-8-Zellmonolayern verwendet, um deren Zytopathogenität mit Hilfe eines Zellviabilitätsassay (MTT-Assay) zu ermitteln. Nicht infizierte Zellmonolayer dienten als Negativkontrolle. Zur genetischen Subtypisierung der Feldisolate erfolgten Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus mittels Amplifizierung in zwei unterschiedlichen PCR-Verfahren. Alle Zellkulturexperimente wurden in Triplikaten durchgeführt und der Mittelwert (Inaktivierungsstudien) bzw. der Median (Zellviabilität) errechnet. Die ermittelten Daten wurden auf Normalverteilung getestet (Shapiro-Wilk-Test). Gruppenvergleiche erfolgten mit dem Mann-Whitney-U-Test (keine Normalverteilung) bzw. dem t-Test (Normalverteilung). Korrelationsanalysen wurden mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten durchgeführt. Die Anwendung von 10 %igem H2O2 mit einer Einwirkzeit von mindestens 12 h sowie die Inkubation in NaOCl (3 % und 6 %) über 12 h führte zu einer fast vollständigen Inaktivierung (> 99 %) der C. parvum-Oozysten. Diese Effektivität wurde auch mit der UV-Bestrahlung über 30 min (100 mJ/cm2) erreicht. 89 % (455/512) der beprobten Kälber wurden positiv auf Cryptosporidium spp. getestet und in jedem Betrieb wurde mindestens ein Ausscheider detektiert. Infizierte Tiere zeigten signifikant häufiger Durchfall als negativ Getestete. Die Subtypisierung war für 47 Feldisolate erfolgreich. IIaA15G2R1 wurde in 66 % der Betriebe gefunden, IIaA16G3R1 in 13 %. Acht weitere Gp60-Subtypen der Gruppe IIa wurden weniger häufig (< 8,5 %) nachgewiesen, der Subtyp IIaA17G4R1 dabei erstmals in Deutschland. 26 Feldisolate konnten in vitro auf ihre Zytopathogenität getestet werden. Es wurden Werte zwischen 17,7 % (± 5,1 %) und 99,5 % (± 7,1 %) lebender Zellen nach Infektion ermittelt. Die Feldisolate wurden in drei Zytopathogenitätskategorien gruppiert. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen In vitro- und In-vivo-Daten ermittelt. Außerdem hatte die Lagerungsdauer der Oozysten signifikanten Einfluss auf die Zytopathogenität. UV-C-Strahlen (100 mJ/cm2) und 10 %iger H2O2 sind bei Einhaltung entsprechender Einwirkzeiten geeignet C. parvum-Oozysten effizient zu inaktivieren. Die Studienergebnisse bestätigen in einem regional eingeschränkten Rahmen, dass C. parvum als Primärpathogen entscheidend am Durchfallgeschehen junger Kälber beteiligt ist. Alle in Sachsen detektierten Subtypen weisen ein zoonotisches Potential auf. Durch die Anwendung des MTT-Assay ist eine Aussage über die Qualität von C. parvum-Oozysten nach Lagerung bei 4 °C möglich. Zur Eignung als diagnostisches Tool bedarf es weiterer Untersuchungen.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2. 1 Taxonomie des Erregers 2. 2 Morphologie und Entwicklungszyklus intestinaler Kryptosporidien 2. 3 In-vitro-Kultivierung des Erregers 2. 4 Invasionsmechanismen und Modulation der Apoptose 2. 5 Klinik, Pathogenese und Bekämpfung von C. parvum beim Kalb 2. 6 Humane Kryptosporidiose 2. 7 Diagnostik und molekulargenetische Charakterisierung von Feldisolaten 2. 8 Viabilitäts- und Infektiositätsnachweis von C. parvum-Oozysten 2. 8. 1 Bewertung der Viabilität 2. 8. 2 Bewertung der Infektiosität 2. 9 Inaktivierung des Parasiten 2. 9. 1 Physikalische Inaktivierung 2. 9. 1. 1 Temperatur 2. 9. 1. 2 UV-Bestrahlung 2. 9. 1. 3 Gammastrahlung 2. 9. 1. 4 Ultraschall 2. 9. 1. 5 Sonstige Methoden der physikalischen Inaktivierung 2. 9. 2 Chemische Inaktivierung 2. 9. 2. 1 Chlorverbindungen 2. 9. 2. 2 Ozon 2. 9. 2. 3 Alkohole und Aldehyde 2. 9. 2. 4 Ammoniumverbindungen 2. 9. 2. 5 Wasserstoffperoxid 2. 9. 3 Kommerziell erhältliche Desinfektionsmittel 3 Publikation 1: Inactivation of Cryptosporidium parvum under laboratory conditions 4 Publikation 2: Distribution of Cryptosporidium parvum gp60 subtypes in calf herds of Saxony, Germany 5 Publikation 3: Bovine Cryptosporidium parvum field isolates differ in cytopathogenicity in HCT-8 monolayers 6 Diskussion 6. 1 Chemische Desinfektion von C. parvum unter Laborbedingungen 6. 2 Physikalische Inaktivierung von C. parvum mittels UV-Bestrahlung 6. 3 Nachweisraten von Cryptosporidium spp. in Sachsen 6. 4 Zytopathogenität der C. parvum-Feldisolate 6. 5 Verbreitung von Gp60-Subtypen in Sachsen 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis

Der Ersatz von geschädigtem Gewebe durch körpereigene Reparaturprozesse wird auf zellulärer Ebene durch Stammzellen unterstützt. Diese Regenerationsfähigkeit ist allerdings in einigen Geweben nur eingeschränkt vorhanden. So kommt es bei der Sehnenheilung des Pferdes unter konventioneller Therapie zur narbigen Reparation mit hohen Rezidivraten. Die Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine innovative Therapiemethode dar, da die tenogene Differenzierung zum Zellersatz mit anschließender Matrixmodulation führen könnte. Es ist jedoch unklar, ob eine entzündliche Umgebung in diesem Zusammenhang Einfluss auf funktionelle Eigenschaften der MSC hat. In dieser Arbeit wurden erstmalig funktionelle Eigenschaften, mit dem Fokus des tenogenen Differenzierungspotentials, von aus Fettgewebe isolierten equinen MSC, unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine und einer direkten Leukozyten-Ko-Kultur, untersucht. Es wurde ein komplexes In-vitro-Modell entwickelt, um die in vivo vorherrschenden Bedingungen bestmöglich zu berücksichtigen. Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass funktionelle und tenogene Eigenschaften von MSC in einem komplexen In-vitro-Modell unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen oder Leukozyten beeinträchtigt werden. Dies hebt die Notwendigkeit zur Untersuchung der komplexen Zusammenhänge während einer akuten Entzündungsreaktion hervor. Es bleibt zu klären, ob trotz der starken Beeinflussung der tenogenen Eigenschaften der vorherrschende Mechanismus der Stammzell-unterstützten Sehnenheilung die tenogene Differenzierung der MSC sein kann.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multipotente mesenchymale Stromazellen 2.1.1 Eigenschaften 2.1.2 Quellen und Charakterisierung 2.1.3 Therapeutisches Potential 2.2 Pathologie der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Tiermodell Pferd 2.2.2 Erkrankungen der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.3 Die Bedeutung der Entzündungsreaktion 2.2.4 Die Bedeutung proinflammatorischer Zytokine und Leukozyten 2.3 Therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Sehnenpathologien 2.4 Sehnen-Tissue Engineering 2.5 Induktion der tenogenen Differenzierung von MSC 2.6 Bioreaktorsysteme im Sehnen-Tissue Engineering 3 Zielstellung und Hypothesen 4 Tiere, Material und Methoden 4.1 Mesenchymale Stromazellen 4.1.1 Tiere 4.1.2 Material 4.1.3 Methoden 4.1.3.1 Auftauen von AT-MSC 4.1.3.2 Kultivierung von AT-MSC 4.1.3.3 Passagieren von AT-MSC 4.2 Equine oberflächliche Beugesehnen 4.2.1 Material 4.2.2 Methoden 4.2.2.1 Gewinnung von equinen OBS 4.2.2.2 Dezellularisierung von equinen OBS 4.2.2.3 Zuschnitt zu Sehnenscaffolds 4.3 Leukozyten 4.3.1 Spendertier 4.3.2 Material 4.3.3 Methoden 4.3.3.1 Blutentnahme 4.3.3.2 Leukozytenisolierung durch Dichtegradientenzentrifugation 4.3.3.3 Leukozytenstimulation 4.4 Versuchsaufbau 4.5 Aussaat von Scaffold- und Monolayerkulturen 4.5.1 Material 4.5.2 Methoden 4.5.2.1 Monolayerkulturen 4.5.2.2 Scaffoldkulturen 4.6 Bioreaktor 4.7 Stimulation und Stimulationsmuster 4.8 Zugabe von Zytokinen 4.9 Auswertung 4.10 Phasenkontrastmikroskopie und Zellzahlbestimmung 4.10.1 Material 4.10.2 Methoden 4.10.2.1 Automatisierte Auswerung von Aufnahmen der Phasenkontrastmikroskopie 4.10.2.2 Zellzahlbestimmung 4.11 Lebend/Tot-Färbung 4.11.1 Material 4.11.2 Methoden 4.11.2.1 Lebend/Tot-Färbung der Monolayerkulturen 4.11.2.2 Lebend/Tot-Färbung der Scaffoldkulturen 4.11.2.3 Auswertung 4.12 Histologie 4.12.1 Material 4.12.2 Methoden 4.12.2.1 Fixierung und Paraffineinbettung 4.12.2.2 Mikrotomschnitte 4.12.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 4.12.2.4 Auswertung 4.13 Real-Time PCR 4.13.1 Material 4.13.2 Methoden 4.13.2.1 RNA-Isolierung aus Scaffoldkulturen 4.13.2.2 Zellaufschluss der Monolayerkulturen 4.13.2.3 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription 4.13.2.4 Real-Time PCR 4.14 Tripotente Differenzierung 4.14.1 Material 4.14.2 Methoden 4.14.2.1 Zellaussaat, Kultivierung und Fixierung 4.14.2.2 Färbung der adipogenen Differenzierung 4.14.2.3 Färbung der osteogenen Differenzierung 4.14.2.4 Färbung der chondrogenen Differenzierung 4.14.2.5 Automatische Auswertung 4.15 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 Morphologie, Proliferation und Konfluenz der MSC 5.2 Lebend/Tot-Färbung 5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 5.4 Genexpression der muskuloskelettalen Marker 5.4.1 Monolayerkultur 5.4.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 5.4.3 Stimulierte Scaffoldkultur 5.4.4 Vergleichende Analyse der Versuchsreihen 5.5 Tripotente Differenzierung 5.5.1 Adipogene Differenzierung 5.5.2 Chondrogene Differenzierung 5.5.3 Osteogene Differenzierung 6 Diskussion 6.1 Diskussion der verwendeten Methoden 6.2 Diskussion der Ergebnisse 6.3 Schlussfolgerung 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Anhang 10.1 Herstellung von Reagenzien 10.2 RNA-Isolierung mittels RNeasy Mini Kit® 10.3 Färbeprotokolle 10.4 Herstellung von Silikonschalen 10.5 Extreme Ausreißerwerte der Genexpressionsanalysen 10.5.1 Monolayerkultur 10.5.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 10.5.3 Stimulierte Scaffoldkultur Danksagung

In-vitro-Koinfektionsstudien mit Toxoplasma gondii und Eimeria tenella in primären Hühnermakrophagen Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Feburar 2020 91 Seiten, 3 Publikationen, 2 eingreichte Manuskripte, 17 Abbildungen, 5 Tabellen, 188 Literaturangaben Schlüsselwörter: Toxoplasma gondii, Eimeria tenella, Koinfektion, Makrophagen, in vitro, Wirt-Parasit-Interaktion, Parasitenwachstum, Wirtsimmunantwort, Cell-imaging Einleitung: Toxoplasma gondii und Eimeria tenella sind intrazelluläre apikomplexe Parasiten, die in Hühnern weit verbreitet sind. Während Infektionen mit dem zoonotischen Erreger T. gondii beim Geflügel im Allgemeinen subklinisch verlaufen, kann E. tenella in Hühnerbeständen schwere Erkrankungen und wirtschaftliche Verluste verursachen. Aufgrund der hohen Seroprävalenz beider Parasiten bei Hühnern sind Koinfektionen wahrscheinlich. Hühnermakrophagen sind wichtig für die Wirtsimmunantwort gegen diese beiden Protozoen. Es ist jedoch wenig über die Wirt-Parasit- sowie Parasit-Parasit-Interaktion in Hühnermakrophagen während einer Koinfektion bekannt. Ziele der Arbeit: Ein geeignetes In-vitro-Koinfektionsmodell für T. gondii- und E. tenella-Infektionen in primären Hühnermakrophagen wurde erstellt und angewendet, um die Makrophagenantwort auf beide Parasitenarten und Koinfektionen zu untersuchen. Tiere, Material und Methoden: Von Monozyten abgeleitete Makrophagen wurden aus Hühnerblut isoliert und aufgereinigt. Eine Koinfektion mit zwei Tachyzoiten des RH-Stammes von T. gondii und zwei Sporozoiten des E. tenella-Houghton-Stammes pro Zelle wurde gleichzeitig oder nacheinander in vitro durchgeführt. Morphologische Veränderungen der Makrophagen und die Parasitenentwicklung wurden mittels Konfokalmikroskopie (CLSM) 2, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Infektion (hpi) visualisiert. Die Parasitenvermehrung wurde evaluiert, indem die Expression des 529-bp-Fragments von T. gondii und des ITS-1-Genfragments von E. tenella durch qPCR bewertet wurden. Die Makrophagen-Phagozytose wurde durch Exposition gegenüber pH-sensitiven fluoreszierenden Biopartikeln stimuliert und durch ein dreidimensionales Modell unter Verwendung von CLSM und Imaris®-Software 2, 6, 12 und 24 hpi quantifiziert. Weiterhin wurden während der Infektion relevante Zytokine (IL-6, IL-10, IL-12, iNOS, TNF-α und IFN-γ) durch Genexpressionsanalyse 24, 48 und 72 hpi untersucht. Zusätzlich wurden die Zellinvasion durch und das Überleben von T. gondii im Verlauf einer sequentiellen Infektion evaluiert, indem Makrophagen zuvor der Infektion mit E. tenella ausgesetzt waren. Die Motilität invasiver Tachyzoiten wurde innerhalb von 20 hpi durch Live-Cell-Imaging verfolgt. Ergebnisse: Die Makrophagen zeigten eine deutliche immunologische Reaktion und Phagozytoseaktivierung ab 2 hpi. Signifikante Veränderungen der Morphologie mit erhöhter Zellvakuolisierung und -ablösung wurden ab 24 hpi während der Koinfektion beobachtet. Bei zuvor E. tenella-exponierten Makrophagen fiel auf, dass T. gondii bei hoher Motilität über 4 Stunden an der Makrophagenmembran anhaftete, bevor es zu einer Penetration kam. Ab 24 hpi vermehrten sich T. gondii in koinfizierten Makrophagen besser als E. tenella. Eine Koinfektion hemmte die Phagozytoseaktivität von Makrophagen nach 2 hpi erheblich, so dass Biopartikel nicht aufgenommen wurden (12 hpi). Mittels qPCR wurde gezeigt, dass bei sequenzieller Koinfektion 2 hpi circa 4-fach weniger T. gondii überlebten als bei Monoinfektion (P < 0,05). Die Anzahl beider Parasiten nahm während der simultanen Koinfektion zu, aber bei der sequentiellen Koinfektion war die Vermehrung von T. gondii im Vergleich zur Monoinfektion bis 24 hpi auf etwa die Hälfte reduziert. Bis 72 hpi verdoppelte sich die Anzahl von E. tenella, während T. gondii bei Koinfektion in diesem Zeitraum auf dem gleichen Niveau wie 48 hpi blieb. Die mRNA-Expression von iNOS (48 hpi), TNF-α (72 hpi) und von IL-10 (48 hpi und 72 hpi) war während der Koinfektion im Vergleich zur E. tenella Monoinfektion signifikant (P < 0,05) erhöht. Schlussfolgerungen: In dem Koinfektionsmodell wurde eine Interaktion zwischen T. gondii und E. tenella beobachtet. Zusätzlich zu den morphologischen Veränderungen und der Phagozytosehemmung der Makrophagen unterschieden sich die Parasitenvermehrung sowie die Zytokinexpression zwischen Koinfektion und Monoinfektion. E. tenella beeinträchtigt das aktive Eindringen von T. gondii in Wirtszellen, wie dies erfolgt, ist derzeit noch nicht geklärt. / In vitro co-infection studies on Toxoplasma gondii and Eimeria tenella in primary poultry macrophages Institute of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2020 91 pages, 3 publications, 2 submitted manuscripts, 17 figures, 5 tables, 188 references Keywords: Toxoplasma gondii, Eimeria tenella, co-infection, macrophages, in vitro, host-parasite interaction, parasite growth, host immune response, cell imaging. Introduction: Toxoplasma gondii and Eimeria tenella are intracellular apicomplexan parasites that are widely distributed in chicken. Whereas infections with the zoonotic pathogen T. gondii are generally subclinical in poultry, E. tenella may cause severe disease and economical loss in chicken herds. Due to the high seroprevelences with both parasites in chicken, co-infections are likely to exist. Chicken macrophages are essential in the host innate immune response against these two protozoa. However, little is known about the host-parasite and parasite-parasite interaction in chicken macrophages during co-infection. Objectives: A suitable in vitro model for both T. gondii and E. tenella infection in chicken primary macrophages was established and applied to study the course of infection in mono- or co-infection. Animals, materials and methods: Monocyte-derived macrophages were isolated and purified from chicken blood. Co-infection with two T. gondii RH strain tachyzoites and two E. tenella Houghton strain sporozoites per cell were performed simultaneously or sequentially in vitro. Morphologic alterations of macrophages and parasite development were visualized by confocal laser scanning microscopy (CLSM) at 2, 6, 12, 24, 48 and 72 hours post infection (hpi). Parasite growth was evaluated by assessing expression of the 529-bp fragment of T. gondii and ITS-1 gene fragment of E. tenella by qPCR in parallel. Macrophage phagocytosis was stimulated by exposure to pH sensitive fluorescent bioparticles and quantified by a three-dimensional model using CLSM and Imaris® software at 2, 6, 12 and 24 hpi. Furthermore, infection-related cytokines (IL-6, IL-10, IL-12, iNOS, TNF-α and IFN-γ) were evaluated by gene expression analysis at 24, 48, 72 hpi. The course of sequential infection was evaluated to determine cell invasion and survival of T. gondii in macrophages previously exposed to E. tenella sporozoites. Motility of invasive stages was tracked at the early phase of infection (within 20 hpi) by real time life cell imaging. Results：By cell imaging, macrophages displayed distinctly immunologic activation and phagocytosis at 2 hpi and thereafter. Significant changes of morphology with increased cell vacuolation and detachment were observed on 24 hpi during co-infection. T. gondii tachyzoites adhered for more than 4 hours to host cells displaying high motility instead of cell entry during the early sequential co-infection. However, T. gondii showed better replication than E. tenella in co-infected macrophages from 24 hpi onwards. Co-infection caused inhibition of phagocytosis by macrophages and bioparticles were not incorporated into co-infected cells at 12 hpi by CLSM. By qPCR, it was shown that approximately 4-fold less T. gondii survived in sequentially co-infected cultures at 2 hpi as compared to mono-infection (P < 0.05). Replication of both parasites increased during simultaneous co-infection whereas only half numbers of replicated T. gondii was found in sequential co-infection compared to mono-infection at 24 hpi. At the end of the study period (72 hpi), E. tenella multiplication tended to double increase while T. gondii replication was not distinctly altered during co-infection compared to 48 hpi. Expression of mRNA for iNOS at 48 hpi, for TNF-α at 72 hpi and for IL-10 at 48 and 72 hpi was significantly elevated during co-infection compared to mono-infection (P < 0.05). Conclusions：Mutual interaction between T. gondii and E. tenella were observed in the selected co-infection model. Increased macrophage stress may explain vacuolization and phagocytosis inhibition. In addition to morphologic alterations of macrophages, cytokine up/down- regulation differed between co-infected and mono-infected macrophage cultures. It appears that E. tenella, impairs the active penetration of T. gondii into host cells which deserves further study. The established in vitro infection model may serve to investigate host immune response of macrophages to diverse intracellular pathogens that infect chicken.

Einleitung: In den letzten Jahren wurde die farbkodierte Doppler-Sonographie als diagnostisches Verfahren zur Charakterisierung der ovariellen Perfusion von Kühen, Stuten und Hündinnen vielfach angewandt. Untersuchungsergebnisse dieser Studien zeigten nicht nur zyklusabhängige Veränderungen, sondern erwiesen sich ferner als geeignet, um die Ursache von Ovarpathologien zu analysieren. Im Gegensatz dazu wurden in der porzinen Reproduktionsmedizin bisher keine dopplersonographischen Untersuchungen der Ovarien durchgeführt. Ziele der Untersuchungen: Das Ziel dieser Arbeit war es, den ovariellen Blutfluss von Jungsauen mittels transabdominaler farbkodierter Doppler-Sonographie im Verlauf eines Sexualzyklus zu analysieren. Tiere, Material und Methoden: Die Ovarien von 15 geschlechtsreifen, hormonell synchronisierten Jungsauen wurden im darauf folgenden spontanen Zyklus täglich in einem mobilen Stand transabdominal mittels farbkodierter Doppler Ultrasonographie untersucht. Es wurden Videosequenzen von mindestens 4 Sekunden (s) aufgezeichnet. Diese wurden im Anschluss mit Hilfe der Software PixelFlux® innerhalb einer definierten „Region of Interest“ analysiert. Anhand der Anzahl, Farbe und Intensität der Pixel wurden nachfolgend genannte Blutflussparameter berechnet: Blutflussgeschwindigkeit, perfundierte Fläche und die Doppler-Indizes Resistenz- und Pulsatilitäsindex. Für die statistische Auswertung der Untersuchungsergebnisse wurde SPSS verwendet. Aufgrund variierender Längen der Zyklusphasen (d.h. Proöstrus, Östrus, Metöstrus und Diöstrus) der Jungsauen wurde der Tag der Ovulation als Tag „2“ des Sexualzyklus deklariert, die Phasen daran ausgerichtet und die dann jeweils verfügbaren Werte zwischen den Zyklustagen -3 - 17 analysiert. Die Ergebnisse wurden nach Bonferroni korrigiert und mittels Friedman und Wilcoxon Test untersucht. Auf Korrelationen zwischen den einzelnen Blutflussparametern wurde mittels Pearson oder Spearman Korrelationskoeffizienten getestet. Ergebnisse: Der ovarielle Blutfluss war zu jedem Untersuchungszeitpunkt messbar. Alle Blutflussparameter wiesen einen zyklusabhängigen Verlauf auf. Die Blutflussgeschwindigkeit und die durchblutete Fläche waren im Diöstrus am höchsten und im Östrus am niedrigsten. Diese Parameter korrelierten mittel bis stark positiv im Proöstrus und Östrus (r: 0,59 - 0,88; p<0,05). Der Resistenz-und Pulsatilitätsindex zeigten beide einen umgekehrt proportionalen Verlauf zu den zuvor genannten Blutflussparametern und korrelierten mittel bis stark negativ in einzelnen Zyklusabschnitten mit diesen (r: -0,58 - -0,76; p<0,05). Die Doppler-Indizes korrelierten untereinander im Östrus und Diöstrus stark positiv (r: 0,77 - 0,93; p<0,05). Schlussfolgerungen: Es ist zu schlussfolgern, dass die transabdominale farbkodierte Doppler-Sonographie ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung der ovariellen Perfusion von Jungsauen ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass sich der ovarielle Blutfluss von Jungsauen zyklusabhängig ändert und im Diöstrus am höchsten ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit mögen helfen, etwaig perfusionsrelevante Erkrankungen des Ovars beim Schwein, wie Gelbkörperinsuffizienz, zu charakterisieren.

No description available.