Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Charakterisierung des XIAP-Gens bei zwei Familien mit X-chromosomalem lymphoproliferativem Syndrom Eingereicht von: Peter Christian Horn geboren am 04.08.1982 in Freiburg Angefertigt an: Der Universitätsklinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche Leipzig und dem Zentrum für familiären Brust- und Eierstockkrebs der technischen Universität München Betreuer: Prof. Dr. med. Volker Schuster (Universität Leipzig) Prof. Dr. rer. nat. Alfons Meindl (TU München) Eingereicht im Dezember 2014 Das X-linked-inhibitor-of-apoptosis Protein XIAP nimmt eine zentrale Rolle in der Hemmung von Apoptoseprozessen beim Menschen ein. In Abwesenheit von XIAP kann eine defekte Immunabwehr gegenüber viralen Infektionen beobachtet werden. In Folge können lebensbedrohliche Immunreaktionen wie hämophagozytäre Lymphhistiozytose, aplastische Anämie und persistierende Hypogammaglobulinämie auftreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob bei einem Patientenkollektiv mit lymphoproliferativem Syndrom Mutationen im XIAP-Gen Auslöser der Erkrankung sind. Es wurde eine molekulargenetische Sequenzierung und Auswertung des XIAP- 5 Zusammenfassung der Arbeit 53 Gens bei 36 Verdachtsfällen eines X-chromosomal vererbten lymphoproliferativen Syndroms durchgeführt. In allen Fällen wurde der gesamte exonische Abschnitt des Gens sequenziert und auf Polymorphismen und Mutationen untersucht. Bei zwei Proben wurden Mutationen im XIAP-Gen gefunden. Weiter konnten Mutter und Bruder eines der Betroffenen untersucht werden, so dass insgesamt drei Knaben mit XIAP-Gendefekt sowie eine heterozygote Konduktorin identifiziert wurden. Nach der Identifikation der Mutationsträger erfolgte eine Auswertung der Krankenge- schichte und ein Vergleich mit den verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz. Die beiden neu identifizierten Mutationen verursachen ein Krankheitsbild, das mit den wenigen verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz vereinbar ist. Die Auswer- tung der Klinik der drei Betroffenen unterstützt die Hypothese, dass bei XIAP- Defizienz keine Lymphome auftreten. Die Therapieentscheidung bei XIAP-Defizienz ist einzelfallabhängig. Die Arbeit ver- gleicht den Krankheitsverlauf der neu beschriebenen Patienten mit der Literatur und unterstreicht, dass die Entscheidung zu einer Knochenmarkstransplantation gut begrün- det werden muss. Es sind inzwischen mehr Patienten bekannt, die ohne Therapie oder unter IVIG-Gabe asymptomatisch sind, als solche, die eine Knochenmarkstransplantati- on überlebt haben. Alle hier beschriebenen Patienten konnten ohne Transplantation be- handelt werden. Eine Stammzelltransplantation kann jedoch erfolgreich sein. Bei kon- servativ behandelten Patienten können Rezidive auftreten. Kritisch zu sehen sind im Licht der Erfahrung mit den XIAP-defizenten Patienten An- strengungen, XIAP-Inhibitoren zur Tumortherapie am Menschen zu entwickeln – dies könnte als Nebenwirkung paradoxe Folgen wie Lymphoproliferation oder HLH haben. Die in der Arbeit beschriebenen Patienten waren die ersten Patienten mit XIAP- Defizienz, die im deutschsprachigen Raum identifiziert wurden. Die beiden Mutationen die bei den Familien gefunden wurden, waren bisher nicht beschrieben.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Charakterisierung des XIAP-Gens bei zwei Familien mit X-chromosomalem lymphoproliferativem Syndrom Eingereicht von: Peter Christian Horn geboren am 04.08.1982 in Freiburg Angefertigt an: Der Universitätsklinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche Leipzig und dem Zentrum für familiären Brust- und Eierstockkrebs der technischen Universität München Betreuer: Prof. Dr. med. Volker Schuster (Universität Leipzig) Prof. Dr. rer. nat. Alfons Meindl (TU München) Eingereicht im Dezember 2014 Das X-linked-inhibitor-of-apoptosis Protein XIAP nimmt eine zentrale Rolle in der Hemmung von Apoptoseprozessen beim Menschen ein. In Abwesenheit von XIAP kann eine defekte Immunabwehr gegenüber viralen Infektionen beobachtet werden. In Folge können lebensbedrohliche Immunreaktionen wie hämophagozytäre Lymphhistiozytose, aplastische Anämie und persistierende Hypogammaglobulinämie auftreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob bei einem Patientenkollektiv mit lymphoproliferativem Syndrom Mutationen im XIAP-Gen Auslöser der Erkrankung sind. Es wurde eine molekulargenetische Sequenzierung und Auswertung des XIAP- 5 Zusammenfassung der Arbeit 53 Gens bei 36 Verdachtsfällen eines X-chromosomal vererbten lymphoproliferativen Syndroms durchgeführt. In allen Fällen wurde der gesamte exonische Abschnitt des Gens sequenziert und auf Polymorphismen und Mutationen untersucht. Bei zwei Proben wurden Mutationen im XIAP-Gen gefunden. Weiter konnten Mutter und Bruder eines der Betroffenen untersucht werden, so dass insgesamt drei Knaben mit XIAP-Gendefekt sowie eine heterozygote Konduktorin identifiziert wurden. Nach der Identifikation der Mutationsträger erfolgte eine Auswertung der Krankenge- schichte und ein Vergleich mit den verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz. Die beiden neu identifizierten Mutationen verursachen ein Krankheitsbild, das mit den wenigen verfügbaren Beschreibungen von XIAP-Defizienz vereinbar ist. Die Auswer- tung der Klinik der drei Betroffenen unterstützt die Hypothese, dass bei XIAP- Defizienz keine Lymphome auftreten. Die Therapieentscheidung bei XIAP-Defizienz ist einzelfallabhängig. Die Arbeit ver- gleicht den Krankheitsverlauf der neu beschriebenen Patienten mit der Literatur und unterstreicht, dass die Entscheidung zu einer Knochenmarkstransplantation gut begrün- det werden muss. Es sind inzwischen mehr Patienten bekannt, die ohne Therapie oder unter IVIG-Gabe asymptomatisch sind, als solche, die eine Knochenmarkstransplantati- on überlebt haben. Alle hier beschriebenen Patienten konnten ohne Transplantation be- handelt werden. Eine Stammzelltransplantation kann jedoch erfolgreich sein. Bei kon- servativ behandelten Patienten können Rezidive auftreten. Kritisch zu sehen sind im Licht der Erfahrung mit den XIAP-defizenten Patienten An- strengungen, XIAP-Inhibitoren zur Tumortherapie am Menschen zu entwickeln – dies könnte als Nebenwirkung paradoxe Folgen wie Lymphoproliferation oder HLH haben. Die in der Arbeit beschriebenen Patienten waren die ersten Patienten mit XIAP- Defizienz, die im deutschsprachigen Raum identifiziert wurden. Die beiden Mutationen die bei den Familien gefunden wurden, waren bisher nicht beschrieben.:Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................... 2 Abbildungsverzeichnis.................................................................................................... 4 Tabellenverzeichnis......................................................................................................... 4 Bibliographische Beschreibung ..................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 6 Vorwort ............................................................................................................................ 8 1 1.1 1.2 Einleitung................................................................................................................... 9 Ziele / Fragestellung ................................................................................................ 9 Wissensstand zu Beginn der Arbeit ....................................................................... 10 1.2.1 Begriffserklärung: Lymphoproliferative Erkrankung ......................................... 10 1.2.2 Begriffserklärung: Mononukleose ....................................................................... 11 1.2.3 Begriffserklärung: Hämophagozytische Lymphhistiozytose (HLH) .................. 11 1.2.4 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome – Erstbeschreibung ............... 13 1.2.5 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome - Entdeckung der XIAP- Defizienz.............................................................................................................. 18 1.2.6 X-chromosomale lymphoproliferative Syndrome – Klinik der XIAP- Defizienz.............................................................................................................. 22 1.3 2 2.1 Aufgabenstellung ................................................................................................... 22 Material und Methoden.......................................................................................... 25 Auswahl der zu untersuchenden Proben ................................................................ 25 2.2 2.2.1 Isolierung der DNA ............................................................................................. 26 2.2.2 Herstellung der Primer......................................................................................... 27 2.2.3 Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und Sequenzierung ..................................... 29 2.3 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 Genetische Untersuchung ...................................................................................... 25 Auswertung ............................................................................................................ 31 Resultate................................................................................................................... 32 Genveränderungen ................................................................................................. 32 Single Nucleotide-Polymorphismen .................................................................... 32 Mutationen ........................................................................................................... 32 Klinik der Patienten ............................................................................................... 33 Familie I: S347Lfs5x-Mutation ........................................................................... 33 Familie I: Mutter und zwei Onkel der Betroffenen ............................................. 34 Familie I: 27 Jahre alter, positiv getesteter Erwachsener .................................... 35 Inhaltsverzeichnis 3 3.2.4 3.2.5 3.3 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.3 Familie I: 29 Jahre alter, positiv getester Erwachsener ....................................... 35 Familie II: 17 Jahre alter Knabe mit R222X-Mutation ....................................... 37 Übersicht über die Klinik der Patienten ................................................................. 38 Diskussion ................................................................................................................ 41 Hauptthese: Im Patientenkollektiv können XIAP-Gen Mutationsträger identifiziert werden .............................................................................................. 41 Prozentualer Anteil positiv getesteter Proben und Vergleich mit der Literatur .. 42 Vergleich der erhobenen klinischen Daten mit der Literatur .............................. 44 Nebenthese: Bei XIAP-Defizienz werden im Gegensatz zur SAP-Defizienz keine Lymphome beobachtet ............................................................................... 46 Nebenthese: Bei der Therapie kann ein konservativer Ansatz einer Knochenmarkstransplantation vorzuziehen sein ................................................. 47 5 Anhang: Einwilligungen ............................................................................................... 54 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 56 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ......................................... 62 Lebenslauf...................................................................................................................... 63 Verzeichnis eigener Veröffentlichungen ..................................................................... 64 Danksagung ................................................................................................................... 65

Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) gehören zu den wichtigsten Redox-Coenzymen und sind an zentralen Stoffwechselprozessen aller Organismen beteiligt. Sie entstehen aus Riboflavin (Vitamin B2). Das bifunktionale RIBA Enzym, das Peptiddomänen für die GTP Cyclohydrolase II (GCHII) und 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat-Synthase (DHBPS) Aktivität umfasst, führt die beiden ersten Schritte der Riboflavin Biosynthese in Pflanzen durch. Die RIBA Proteine werden durch drei Gene in Arabidopsis thaliana und anderen Blütenpflanzen kodiert. Eines der Ziele war es, die physiologischen Rollen der drei RIBA Isoformen aufzuklären. Detaillierte enzymatische Untersuchungen wurden mit rekombinanten RIBA Proteinen IN VITRO durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass RIBA2 und RIBA3 jeweils die GCHII oder die DHBPS Aktivität verloren haben. Des Weiteren konnte die Phosphorylierung von RIBA1, sowie die Hemmung von dessen GCHII Aktivität durch FMN nachgewiesen werden. Ein Knockout von RIBA1 führte zu Embryoletalität. Die schrittweise Reduzierung des RIBA1 Proteingehaltes in Arabidopsis, welches zu einem verringerten Flavingehalt führte, ergab einen schwerwiegenden Bleichungsphänotyp. Die konstitutive Antisense-Mutante, sowie das Verfahren des Virus-induzierten Gen-„Silencing“ wurden verwendet, um den durch RIBA1-Mangel hervorgerufenen Flavin-Defizienz-Effekt zu beschreiben. Eine Metabolomics Analyse ergab, dass die Abnahme des Flavingehaltes zu einer Deregulierung verschiedener Zitronensäurezyklus assoziierten Flavoenzyme und zu einer starken Reduktion der katabolischen Kapazität diverser Aminosäuren führt, während flavinabhängige Stickstoffassimilationsprozesse eher priorisiert wurden. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Erweiterung des Kenntnisstands über den pflanzlichen Riboflavin Biosyntheseweg, sowie zum Verständnis über die Folgen von Flavinmangel in Pflanzen. Darüber hinaus wird hier der erste Versuch zu Erhöhung des Vitamin B2-Gehalt in Pflanzen beschrieben. / Flavin mononucleotide (FMN) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) belong to the main redox coenzymes and are involved in central metabolic processes. They derive from riboflavin also referred to as vitamin B2. The bifunctional RIBA enzyme, which comprises peptide domains for GTP cyclohydrolase II (GCHII) and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (DHBPS) activity, performs the two initial steps of riboflavin biosynthesis in plants. Three genes encode RIBA proteins in Arabidopsis thaliana and many other flowering plants. One of the main aims of this study was to elucidate the physiological roles of the three RIBA isoforms. Detailed enzymatic studies were performed with recombinant RIBA proteins IN VITRO. It revealed for RIBA2 and RIBA3 the loss of either GCHII or DHBPS activity, respectively. The phosphorylation of RIBA1 as well as the inhibition of its GCHII activity by FMN could be demonstrated. A knockout of RIBA1, encoding the dominant RIBA isoform, led to embryo lethality. The gradual reduction of the RIBA1 protein content in Arabidopsis was associated with reduced flavin amounts and a severe bleaching phenotype that was caused by the gradual loss of pigments during leaf development. Flavin deficiency effects caused by RIBA1 depletion were characterised with a constitutive antisense mutant and the virus induced gene silencing method. A comprehensive metabolite profiling, revealed that the loss of almost one third of total flavin content led to a deregulation of several citric acid cycle-associated flavoenzymes. Moreover, a severe reduction of the catabolic capacity of numerous amino acids is seen, while seemingly flavin-dependent processes of the nitrogen assimilation are prioritised. In summary, this thesis contributes to the extended knowledge about the riboflavin biosynthesis pathway as well as to the understanding about consequences of flavin deficiency in plants. Moreover, the first attempt to increase the vitamin B2 content in plants is presented.

Die Dissertation ``Asymptotische \Äquivalenz f\ür ein Modell unabh\ängiger nicht identisch verteilter Daten'' besch\äftigt sich mit der Le Camschen Theorie der Experimente. Le Cam hat den sogenannten $\Delta$-Abstand zwischen statistischen Experimenten definiert; ist dieser Abstand f\ür zwei Modelle klein, so sind ihre statistischen Eigenschaften \ähnlich. Zwei Folgen von Experimenten nennt man asymptotisch \äquivalent, falls ihr $\Delta$-Abstand gegen Null konvergiert.\\ In dieser Arbeit beweisen wir asymptotische \Äquivalenz zwischen einem Modell mit unabh\ängigen, nicht identisch verteilten Beobachtungen und einem Gaußschen Shift-Modell. Die i-te Beobachtung des ersten Experimentes ist dabei gem\äß einer Dichte $h(i/n,.)$ verteilt, wobei die Funktion h eine Schar von Dichten bildet. Wir approximieren also ein kompliziertes statistisches Experiment durch ein einfacheres, n\äymlich ein Gaußsches Shift-Modell. Die Dichten h geh\ören einer Menge h\ölderstetiger Funktionen an, so daß wir es mit einem nichtparametrischen Problem zu tun haben. Das von uns bewiesene \Äquivalenzresultat kann auch als eine nichtparametrische Version der ebenfalls von Le Cam eingef\ührten LAN Bedingung aufgefaßt werden. Ein wichtiges Hilfsmittel zum Beweis des oben beschriebenen Resultats ist das sogenannte Coupling von stochastischen Prozessen, d.h. die Konstruktion solcher Prozesse auf einem gemeinsamen Wahrscheinlichkeitsraum, so daß die Prozesse nahe beieinander liegen. Im zweiten Teil der Arbeit beweisen wir eine funktionale Version eines solchen Coupling Resultats f\ür den sequentiellen empirischen Prozeß und den Kiefer-M\üller Prozeß unter Verwendung der sogenannten Ungarischen Konstruktion. / The thesis "Asymptotic Equivalence of Experiments for a Model with Independent and Nonidentically distributed Observations" deals with the theory of experiments that was developped by Le Cam. \\ Le Cam defined the so called $\Delta$-distance between experiments. If this distance is small for two given models it means that their statistical properties are similar. We call two sequences of experiments asymptotic equivalent if their $\Delta$-distance converges to zero.\\ In this thesis we prove asymptotic equivalence between a model with independent and nonidentically distributed observations and a Gaussian shift model. The i-th observation in the first model is distributed according to a density $h(i/n,.)$ where $h$ is a bunch of densities on the unit interval. This means that we approximate a complicated statistical experiment by a simpler one, namely a Gaussian shift model. The densites h belong to a H\"older ball such that we have a nonparametric problem. Our result can also be viewed as a nonparametric version of the LAN property which was also defined by Le Cam. An important tool for proving our result is the coupling of stochastic processes, i.e. the construction of processes on a common probability space such that they are close in a strong sense. In the second part of the thesis we prove a functional version of such a coupling result for the sequential empirical process and the Kiefer-M\"uller process by using the Hungarian construction.

In der vorliegenden experimentell durchgeführten Dissertation wurden neue Mutationen im FOLR1-Gen molekular charakterisiert. Die untersuchten Mutationen führten zu Veränderungen im Folatrezeptor α, einem von Zellen des Plexus choroideus exprimierten Protein, welches den Haupttransporter von  5-MTHF über die Blut-Liquor-Schranke darstellt. Mutationen im FOLR1-Gen sind kürzlich als Ursache einer zerebralen Folattransport-Defizienz identifiziert worden. Diese Erkrankung gehört zu einer Gruppe neurologischer Störungen, die sich durch isoliert niedrige Liquorfolatwerte  auszeichnen und zusammenfassend als zerebrale Folatdefizienz bezeichnet werden. Die zerebrale Folattransportdefizienz manifestiert sich typischerweise im frühen Kleinkindesalter und äußert sich klinisch in Form einer chronisch-progredienten psychomotorischen Regression mit zerebralen Krampfanfällen und einer durch MRT nachweisbaren Myelinisierungsstörung. Eine Substitution mit  5‘-Formyltetrahydrofolat konnte bei der Mehrzahl der identifizierten Patienten eine partielle Remission der Symptome bewirken.  Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Mutationen im FOLR1-Gen hinsichtlich ihrer molekularen Auswirkungen auf die Proteinxpression, die Funktionalität bzw. Rezeptor-Bindungsfähigkeit und die Lokalisation des Proteins untersucht. Bei den Mutationen handelt es sich um zwei neue, aus Patienten-DNS identifizierte Punktmutationen, p.C169Y und p.N222S, sowie die bereits beschriebenen FRα-Mutanten p.C105R und FRα p.K44_P49dup.  Die heterologe Expression der mutanten Folatrezeptoren zeigte in Westernblot-Analysen keine signifikanten Veränderungen der Protein-Expressionsrate, verglichen mit dem Wildtyp-Protein. Allerdings bestand eine stark verminderte Rezeptor-Folsäurebindung in radioaktiven Bindungsassays. Ein funktioneller Unterschied zwischen den einzelnen Mutanten konnte im Verlauf der Experimente identifiziert werden. Die FRα-Proteinmutanten p.N222S und p.K44_P49dup zeigten verglichen mit den anderen Mutanten eine höhere Folsäure-Restbindung von ca. 20 % des Wildtypproteins. Im Rahmen von Immunfluoreszenzmikroskopien konnte gezeigt werden, dass die FRα-Mutante p.K44_P49dup partiell zellmembranständig, entsprechend dem FRα-Wildtyp, exprimiert wurde. Die übrigen untersuchten Proteinmutanten zeigten in intrazellulären Kompartimenten zumindest teilweise eine Kolokalisation mit dem Marker des endoplasmatischen Retikulums. Alle Untersuchungen wurden mit transfizierten CHO-K1-Zellen durchgeführt und konnten in zwei polaren Zelllinien, immortalisierten Epithelzellen des Plexus choroideus (Z310) und humanen Leberzellkarzinomzellen (HepG2) bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation sind Bestandteil einer kürzlich in BRAIN veröffentlichten Arbeit (Grapp et al. 2012) und tragen zum besseren Verständnis der molekularen Grundlagen der zerebralen Folattransport-Defizienz, einer neuerkannten, behandelbaren neuropädiatrischen Erkrankung, bei. Die  Pathogenität der untersuchten FOLR1-Mutationen wird auf molekularer Ebene belegt. Die Bedeutung dieser molekulargenetischen Untersuchungen besteht darin, dass eine frühzeitige Folat-Behandlung erkrankter Kinder zu einer deutlichen Verbesserung der Symptome führt.

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