ABSTRACT Protein-protein interactions play a central role in most biological processes. One such biological process is the maintenance of a reducing environment inside the cell. To maintain an internal reducing environment, living cells have evolved two enzymatic systems (glutathione and thioredoxin (Trx) systems). The Trx system is composed of the enzyme TrxR and its substrate Trx. The two proteins constitute an important thiol-dependent redox system that catalyzes the reduction of many proteins that are responsible for a variety of cellular functions. The system relies on transient protein-protein interactions between Trx and TrxR for its function. Cross-reactivity of components of the Trx system between species has been shown to be medically relevant. For example, Helicobacter pylori Trx (HP Trx) is thought to mediate catalytic reduction of human immunoglobulins and thus facilitate immune evasion. It has also been proposed that Helicobacter pylori gains access to the impenetrable gastric mucous layer by using secreted HP Trx to reduce the disulfide bonds present in the cysteine-rich mucin regions that are responsible for cross-linking mucin monomers. Therefore, disruption of secreted HP Trx-host protein interaction may result in restoration of the viscoelastic and hydrophobic protective properties of mucus. Previous studies aimed at understanding the nature of cross-reactivity of Trx system components among various species have shown that Trxs have higher affinity for cognate TrxRs (same species), than for TrxRs from different species. However, the basis for this specificity is not known. A growing body of evidence suggests that most protein-protein interactions are mediated by a small number of protein-protein interface residues, referred to as hot spot residues or binding epitopes. Therefore, understanding the biochemical basis of the affinity of proteins for their partners usually begins by identifying the hot spot residues responsible for the protein complex interactions. In this study, the crystal structures of Deinococcus radiodurans thioredoxin reductase (DR TrxR) and Helicobacter pylori TrxR (HP TrxR) were determined at 1.9 Å and 2.4 Å respectively. Analysis of the Trx-binding sites of both structures suggests that the basis of affinity and specificity of Trx for TrxR is primarily due to the shape rather than the charge of the surface. In addition, the complex between Escherichia coli thioredoxin reductase (EC TrxR) and its substrate thioredoxin (EC Trx) was used to identify residues that are responsible for TrxR-Trx interface stability. Using computational alanine scanning mutagenesis and visual inspection of the EC TrxR-Trx interface, 22 EC TrxR side chains were shown to make contact across the TrxR-Trx interface. Although more than 20 EC TrxR side chains make contact across the TrxR-Trx interface, our results suggest that only 4 residues (F81, R130, F141, and F142) account for the majority of the EC TrxR-Trx interface stability. Individual replacement of equivalent DR TrxR residues (M84, K137, F148, F149) with alanine resulted in drastic changes in binding affinity, confirming that the four residues account for most of TrxR-Trx interface stability. These hot spot residues are surrounded by less important residues (hydrophobic and hydrophilic) that are also predicted to contribute to interface stability. F148 and F149 are invariant across bacterial TrxRs, however other residues that contact Trx are less conserved including M84 and K137. When M84 and K137 were changed to match equivalent E. coli TrxR residues (K137R, M84F); D. radiodurans TrxR substrate specificity was altered from its own Trx to that of E. coli Trx. The results suggest that a small subset of the TrxR-Trx interface residues are responsible for the majority of Trx binding affinity and specificity, a property that has been shown to general to protein-protein interfaces.

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR.

Les bactéries du genre Deinococcus sont des microorganismes qui présentent des propriétés remarquables de résistance aux conditions extrêmes telles que les radiations ionisantes, les stress oxydatifs, la dessiccation ou encore les températures extrêmes. L'exploitation de leurs capacités présente donc un réel intérêt pour les procédés biotechnologiques de production de métabolites d'intérêt, les biocarburants. Néanmoins, la physiologie et le métabolisme de ces microorganismes ont été très peu étudiés à ce jour. L'objectif de ce travail est d'identifier les exigences nutritionnelles d'une souche de déinocoques, Deinococcus geothermalis, dans le but de définir la composition d'un milieu synthétique permettant une croissance sans limitation. L'étude statistique de quarante huit formulations de milieux de culture a mis en évidence la variabilité qualitative et quantitative des compositions des milieux utilisés pour leur culture. Il ressort que l'ajout de facteurs stimulant la croissance, sous forme d'extrait de levure, est indispensable à la croissance non limitée de la souche Deinococcus geothermalis DSM 11300. En bioréacteur à 45 °C, sur un milieu complexe et substrat glucose, une concentration finale de 2,7 gMS.L-1 a été obtenue en six heures avec un taux de croissance égal à 0,65 h 1. Les résultats ont montré une variabilité intra-espèce importante ; parmi les trois souches de Deinococcus geothermalis étudiées, DSM 11300, DSM 11301 et DSM 11302, la souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente la meilleure croissance en termes de nombre de générations, en milieu défini ou complexe. L'étude de l'influence des étapes de préparation de l'inoculum a permis de standardiser les conditions de préparation de l'inoculum préalablement aux cultures en bioréacteur. La souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente une croissance exponentielle durant quatre heures en bioréacteur sur un milieu défini avec 10 g.L-1 de glucose ; le taux de croissance de 0,25 h-1 ne se maintient pas sur une durée plus longue. Le rendement de production de biomasse à partir du glucose atteint 0,25 gX.gGlc-1 soit 0,30 CmolX.CmolGlc-1. L'ajout de sources carbonées, sources soufrées, vitamines ou autres facteurs de croissance ne permet pas d'améliorer la croissance de la souche dans ces conditions. Sur ces bases, la quantification de la physiologie de Deinococcus geothermalis DSM 11302 a été étudiée lors d'une culture en mode discontinu alimenté avec une stratégie d'apport de deux substrats, l'extrait de levure et le glucose. Le mode de conduite a permis de révéler que le glucose n'est pas la source de carbone assimilée préférentiellement et que l'extrait de levure peut être consommé comme source azotée organique et/ou comme source carbonée. Les déinocoques sont caractérisés par un métabolisme principalement protéolytique : il a été possible de confirmer que l'extrait de levure est indispensable à la croissance non limitée de Deinococcus geothermalis DSM 11302. Avec cette stratégie d'alimentation co-substrats, 253 g d'extrait de levure et 26 g de glucose ont été ajoutés pour produire 99 gMS de biomasse soit 9,6 gMS.L-1 en six heures. Les vitesses spécifiques maximales de consommation des substrats, extrait de levure et glucose, atteignent respectivement 0,68 et 0,39 Cmol.CmolX-1.h-1. Le taux de croissance exponentiel maximal obtenu est égal à 1.05 h-1, meilleur résultat décrit à ce jour pour un déinocoque. Ces résultats contribuent ainsi à implémenter l'état des connaissances sur la physiologie et les exigences nutritionnelles de Deinococcus geothermalis et donnent accès aux valeurs de paramètres cinétiques et de rendements, données absentes de la littérature

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