Deinococcus radiodurans is a highly UV and radio resistant bacterium. The addition of Mn2+ could induce an Mn-CD effect in this bacterium. In this study, we used two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis to compare and analyze the expressed-proteins under various growth conditions, such as temperature and the presence of Mn2+ or not. The results showed that Mn2+ could affect the similarity proteins expression. As the time of Mn-CD effect elapsed longer, the similarity of the proteins from different growth phages became lower. This indicated that Mn2+ indeed could induce or repress the gene expression. From the 2-D gel analysis, there were fourteen proteins had been induced or overexpressed. Five of them were the proteins with the functions for the synthesis and decomposition of proteins and DNA, others were ATP-binding cassette¡]ABC¡^transporter¡Bsuperoxide dismutase［Mn］, and the rest five were the hypothetical proteins with unclear function. In addition, this study also found that the cultivation temperatures caused conformational and physiological modification of the cell. The addition of Mn2+ could enhance the viability of the bacterium at higher temperature.

Abstract Deinococcus radiodurans is highly resistant to radiation when it grown in tryptone-glucose-yeast extraxt (TGY) medium. It oxidized glucose slowly mainly by the pentose phosphate pathway (PPP) and showed little glycolytic Embden-Meyerhof pathway (EMP) activity. The addition of 10 µM Mn(II) into the stationary phase cultures, could induced new round of cell division (Mn-CD effect) and the EMP activity. Glucose metabolized by Mn-CD cells at a EMP:PPP=6:1 ratio. In analyzing the metabolites for DNA repair, we found that after the addition of Mn(II) , the concentrations of PPP metabolites such as insione monophosphate (IMP)¡Buridine monophosphate (UMP) and NAD (nicotine adenine dinucleotide) were greatly reduced. This event is also occurred when replacing the glucose by fructose, sodium acetate, or removing glucose from the TGY culture medium. Besides, we also found that the TGY and TFY grown cells contained more PPP metabolites than those of TAY and TY cells. This finding suggested that glucose and fructose were metabolized by the PPP pathway in D. radiodurans. Finally, the concentrations of IMP¡BUMP and NAD in the cells were greatly decreased after UV irradiation. This indicated that these metabolites were probably employed to repair the DNA damage causing by UV irradiation.

Les thérapies par irradiation sont utilisées pour traiter la plupart des cas de cancer. Une limitation majeure est l’induction de dommages dans les tissus sains. Par conséquent, l’amélioration du ciblage tumoral est un défi majeur. L'addition de nanoparticules (NPs) est proposée comme une nouvelle stratégie pour amplifier les effets des radiations dans les tumeurs (radiosensibilisation ). Les nanoparticules de Z élevé (platine, or, gadolinium) se révèlent être de bons candidats. Afin de développer de nouveaux nanoagents et d’améliorer les plans de traitement, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliqués. Il a été observé que les radiosensibilisateurs augmentent l'effet létal des radiations (ions rapides ou rayons gamma). Ceci est attribué à une cascade d'événements multi-échelle qui comprend l'activation des NPs, leur relaxation, suivi de la production de radicaux responsables de la mort cellulaire (dans les eucaryotes). Il n'est pas encore clair laquelle des étapes, entre l’excitation/relaxation électronique des NPs ou la réponse biologique joue le rôle prédominant. Par conséquent, le défi de ma thèse était de tester les effets de radiosensibilisateurs (NPs d'or, de platine ou à base de gadolinium) sur des cellules autres que des cellules eucaryotes. Pour la première fois, l’effet des NPs a été testé sur la bactérie la plus radiorésistante jamais rapportée, D. radiodurans. Les NPs ont également été testées sur E. coli. Des études à l'échelle moléculaire ont été utilisées pour comprendre les mécanismes élémentaires. En résumé, ce travail montre que les NPs radiosensibilisantes amplifient les effets des rayons γ dans les bactéries radiosensibles et radiorésistantes. Ceci est attribué à la production de grappes de radicaux et à l’induction de dommages nanométriques dans l'ADN mais également dans les protéines de réparation. Finalement la radiosensibilisation est un phénomène «universel» qui peut être induite dans tout organisme vivant. En d'autres termes, les mécanismes élémentaires liés à l’excitation/relaxation de la NP jouent un rôle majeur par rapport à la réponse biologique de la cellule. Enfin, un ensemble de méthodes ont été optimisées pour évaluer la toxicité et observer l’internalisation des NPs dans les bactéries. / Radiation therapies are used to treat most of the cancer cases. One major limitation is the damage induced in the healthy tissues and tumor targeting is a major challenge. The addition of nanoparticles (NPs) is proposed as a novel strategy to amplify the radiations effects in the tumors (radiosensitization). The high-Z nanoparticles (platinum, gold, gadolinium) are found to be good candidates. To develop new nanoagents and improve treatment planning, a deeper knowledge of the fundamental mechanisms is required. It was found that radiosensitizers enhance the lethal effect of radiations (fast ions and gamma rays). This is attributed to a multiscale cascade of events, which includes the NPs activation and relaxation, the production of water radicals up to the biological impact in mammalian cells. It is not clear yet what from the early stage processes or from the (eukaryotic) cell response is the key stage of the radiosensitization. Hence, the challenge of my thesis was to probe the effects of radiosensitizers (gold, platinum and gadolinium based nanoparticles) on cells other than eukaryotic cells. For the first time, their effect was tested on the most radioresistant bacterium ever reported Deinoccocus radiodurans (D. radiodurans). For comparison, the nanoparticles were tested on the radiosensitive bacterium E.coli. Additional studies at molecular scale were used to understand the elementary mechanisms. In summary, this work demonstrates that the radiosensitizing nanoparticles amplify the effects of -rays in radiosensitive and also radioresistant bacteria. This is attributed to the production of radical clusters and to the inducetion of nano-size biodamages in DNA but also in repair proteins. Finally, this work proves that the radiosensitization is a “universal” phenomenon that can take place in all living organisms. In other words, it tells that elementary mechanisms play a major role compared to the biological response of the cell. A set of standardized methods for evaluating the cellular uptake and the toxicity of the potential nanodrug was established throughout this study.

L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné. / The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased.

Les accidents nucléaires des centrales de Tchernobyl et de Fukushima rendent primordial la compréhension des transferts de la contamination radioactive dans l'environnement et de ses conséquences écologiques. Bien que certaines études aient été réalisées sur les organismes supérieurs, trop peu ont étudié les communautés bactériennes telluriques, qui jouent pourtant un rôle essentiel dans la mobilité des contaminants dans les sols en diminuant ou en améliorant leur transfert vers d'autres compartiments (eau, végétaux, animaux). Cependant, les radionucléides (RNs) peuvent avoir des effets toxiques sur les bactéries, entrainant une inhibition de leur rôle dans ce transfert. Les objectifs de cette étude étaient (1) d'évaluer l'impact d’une contamination radioactive sur les communautés bactériennes d’un sol de la zone d’exclusion de Tchernobyl (sol de la tranchée n°22) et (2) d’étudier les interactions bactérie-uranium pour une souche résistante, isolée à partir de ce sol. / The nuclear power plants accidents of Chernobyl and Fukushima demonstrate the importance of the understanding of the transfers of the radioactive contamination in the environment and their ecological consequences. Although certain studies have been realized on superior organisms of the food chain, studies on telluric bacterial communities are scarce. The later play nevertheless an essential role in the mobility of contaminants in soils by decreasing or by improving their transfer towards other compartments (water, vegetables, and animals). Moreover, radionuclides (RNs) can have toxic effects on bacteria, leading to an inhibition of their participation in such transfer. The objectives of this study were (1) to estimate the impact of radioactive contamination on bacterial communities belonging to a soil of a Chernobyl exclusion zone (trench n°22) and (2) to study the uranium-bacteria interactions of a resistant strain, isolated from this soil.

L'uranium est un toxique à la fois chimique et radiologique. C'est un élément que l'on retrouve à faible concentration dans l'environnement sauf lors de pollutions causées par les activités humaines. Du fait de sa forte réactivité, l'ion uranyle peut se complexer à de nombreux constituants du sol, qu'ils soient minéraux ou organiques. Ces différentes formes peuvent être ainsi plus ou moins biodisponibles pour les microorganismes et les plantes et peuvent ensuite rentrer dans la chaîne alimentaire de l'homme. La connaissance et la compréhension des mécanismes de transfert et du devenir d'éléments toxiques chimiques et radiologiques dans la biosphère constituent donc un enjeu capital pour permettre une bonne estimation des risques sanitaires et écologiques. La connaissance de la spéciation est capitale pour engager des processus de biorémédiation. Ici, c'est l'effet des microorganismes sur la spéciation de l'uranium dans l'environnement qui nous intéresse. Selon les formes initiales de l'uranium, les bactéries peuvent l'accumuler et/ou le transformer et ainsi modifier sa biodisponibilité. Les modèles utilisés dans cette étude sont Cupriavidus metallidurans CH34, bactérie tellurique résistante aux métaux lourds, Deinococcus radiodurans R1, bactérie connue pour être une des espèces les plus radiorésistantes et Rhodopseudomonas palustris, bactérie pourpre autotrophe capable de dégrader les composés aromatiques en anaérobie. Ces bactéries sont cultivées en présence de deux formes d'uranium retrouvées dans l'environnement : une forme minérale, le carbonate d'uranyle et une forme organique, le citrate d'uranyle. Ces formes ont d'abord été modélisées et les milieux de culture ont été modifiés pour pouvoir travailler avec ces espèces. La capacité des bactéries à résister, à transformer et/ou accumuler l'uranium a été étudiée. On observe une différence entre les concentrations minimales inhibitrices des deux spéciations mais celle-ci est en fait due à une différence de biodisponibilité des phosphates. Aucune accumulation ne semble être mise en évidence aux pH environnementaux par dosage de l'uranium et par observation au microscope électronique à transmission alors qu'une précipitation est observée à pH 1. La spéciation de l'uranium a été étudiée par spectroscopie d'absorption X (EXAFS). La spéciation est bien maitrisée dans les milieux de culture et les précipités observés aux pH très acide sont ces complexes de phosphates d'uranyle.

The addition of Mn(II) to an early stationary-phase Deinococcus radiodurans RI culture could induce a new round of cell division (MnCD effect). The addition of Mn(II) could also stimulate the utilization of glucose and fructose in this bacterium. Class II fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) is an Mn-dependent key enzyme in pentose phosphate pathway. Therefore, in this research, we focused on the studies of the fba gene. Base on the gene sequence, FBA protein was composed of 306 amino acids, (M.W., 32.4 kDa¡F pI, 5.4). The expected PCR product size of the fba gene is 9.3 kbp. We had amplified the fba gene by using both Taq DNA polymerase and pfu turbo DNA polymerase. The sequence of the pfu turbo DNA polymerase products showed a higher homology with the fba gene than those of using Taq DNA polymerase. These amplified fba gene was cloned into three expression vectors, pGEX-4T-2, pQE30, and pET28a, and then further expressed in E. coli BL21(DE3)RIL and JM109. The recombinant GST-FBA protein could be overproduced in pTDA2/BL21(DE3)RIL. However, the expressed insoluble protein accumulated as inclusion bodies in the cells and exhibited no enzyme activity. After partial purification, and processing by thrombin protease cleavage, urea treatment, and the addition of Mn(II), this enzyme still showed no activity. The recombinant pEDA2/BL21(DE3)RIL strain cells grew in 18¢J and induced by 0.1mM IPTG could produced a soluble form His-Thrombin-T7-FBA protein which performed a 50X higher activities than those cells grew in 30¢J. This result indicated that decreasing the indicatioin temperature could improve the protein solubility and activity.

The superoxide dismutase from a radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans has been purified to electrophoretic homogeneity. The superoxide dismutase has a specific activity of 3300 units/mg and an apparent molecular mass of 43,000 daltons. The enzyme contains 1.5 gram-atom of manganese per mol dimer, and is composed of two identical subunits of 23,500 daltons. The enzyme rapidly loses its catalytic activity and metal content upon dialysis in denaturing reagent, guanidine hydrochloride, and the metal ion chelator 8-hydroxyquinoline. The denatured apoprotein was renatured upon removal of the denaturant by dialysis. The renatured apoprotein assumed a gross conformation similar to the native enzyme as indicated by fluorescence spectroscopy. The renatured apoprotein was reconstituted to the native specific activity upon addition of manganese in the absence of denaturant. The manganese econstituted enzyme contained 1.7 gram-atom of manganese per mol dimer, and had a specific activity of 3650 units/mg. Kinetic studies revealed that the reconstitution with manganese was pH-dependent, and was inhibited by competing metal ions (iron and zinc). / Ph. D.

Les bactéries du genre Deinococcus sont des microorganismes qui présentent des propriétés remarquables de résistance aux conditions extrêmes telles que les radiations ionisantes, les stress oxydatifs, la dessiccation ou encore les températures extrêmes. L’exploitation de leurs capacités présente donc un réel intérêt pour les procédés biotechnologiques de production de métabolites d’intérêt, les biocarburants. Néanmoins, la physiologie et le métabolisme de ces microorganismes ont été très peu étudiés à ce jour. L’objectif de ce travail est d’identifier les exigences nutritionnelles d’une souche de déinocoques, Deinococcus geothermalis, dans le but de définir la composition d’un milieu synthétique permettant une croissance sans limitation. L’étude statistique de quarante huit formulations de milieux de culture a mis en évidence la variabilité qualitative et quantitative des compositions des milieux utilisés pour leur culture. Il ressort que l’ajout de facteurs stimulant la croissance, sous forme d’extrait de levure, est indispensable à la croissance non limitée de la souche Deinococcus geothermalis DSM 11300. En bioréacteur à 45 °C, sur un milieu complexe et substrat glucose, une concentration finale de 2,7 gMS.L-1 a été obtenue en six heures avec un taux de croissance égal à 0,65 h 1. Les résultats ont montré une variabilité intra-espèce importante ; parmi les trois souches de Deinococcus geothermalis étudiées, DSM 11300, DSM 11301 et DSM 11302, la souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente la meilleure croissance en termes de nombre de générations, en milieu défini ou complexe. L’étude de l’influence des étapes de préparation de l’inoculum a permis de standardiser les conditions de préparation de l’inoculum préalablement aux cultures en bioréacteur. La souche Deinococcus geothermalis DSM 11302 présente une croissance exponentielle durant quatre heures en bioréacteur sur un milieu défini avec 10 g.L-1 de glucose ; le taux de croissance de 0,25 h-1 ne se maintient pas sur une durée plus longue. Le rendement de production de biomasse à partir du glucose atteint 0,25 gX.gGlc-1 soit 0,30 CmolX.CmolGlc-1. L’ajout de sources carbonées, sources soufrées, vitamines ou autres facteurs de croissance ne permet pas d’améliorer la croissance de la souche dans ces conditions. Sur ces bases, la quantification de la physiologie de Deinococcus geothermalis DSM 11302 a été étudiée lors d’une culture en mode discontinu alimenté avec une stratégie d’apport de deux substrats, l’extrait de levure et le glucose. Le mode de conduite a permis de révéler que le glucose n’est pas la source de carbone assimilée préférentiellement et que l’extrait de levure peut être consommé comme source azotée organique et/ou comme source carbonée. Les déinocoques sont caractérisés par un métabolisme principalement protéolytique : il a été possible de confirmer que l’extrait de levure est indispensable à la croissance non limitée de Deinococcus geothermalis DSM 11302. Avec cette stratégie d’alimentation co-substrats, 253 g d’extrait de levure et 26 g de glucose ont été ajoutés pour produire 99 gMS de biomasse soit 9,6 gMS.L-1 en six heures. Les vitesses spécifiques maximales de consommation des substrats, extrait de levure et glucose, atteignent respectivement 0,68 et 0,39 Cmol.CmolX-1.h-1. Le taux de croissance exponentiel maximal obtenu est égal à 1.05 h-1, meilleur résultat décrit à ce jour pour un déinocoque. Ces résultats contribuent ainsi à implémenter l’état des connaissances sur la physiologie et les exigences nutritionnelles de Deinococcus geothermalis et donnent accès aux valeurs de paramètres cinétiques et de rendements, données absentes de la littérature / Bacteria belonging to Deinococcaceae family are microorganisms with exceptional resistance properties to extreme environmental conditions such as ionizing radiations, oxidative stress, dehydration or extreme temperatures. These properties make them interesting targets for biotechnological processes for metabolite production like biofuels. Nevertheless, physiological behaviour and metabolism of these microorganisms have been little studied to date. The main objective of this work was to study the nutritional requirements for the growth of a Deinococcaceae strain, Deinococcus geothermalis, in order to define a synthetic medium sufficient for a non-limiting growth of this strain. The statistical study of 48 culture media formulations highlighted a lot of variability between the compositions used for their growth. A limiting growth of the strain Deinococcus geothermalis DSM 11300 was obtained on the defined medium DM chosen for this work, in Erlenmeyer flasks and in bioreactor, unless yeast extract was added to the medium. Cultivated in a bioreactor at 45 °C, on a complex medium with glucose (CMG), the biomass concentration reached 2.7 gMS.L-1 in six hours with a growth rate of 0.65 h-1. The results showed intra-specie variability; the strain Deinococcus geothermalis DSM 11302 exhibits the best number of generation in both complex and defined media. The study of the influence of inoculum preparation steps allowed standardizing the conditions of inoculum preparation before cultures in bioreactor. The strain Deinococcus geothermalis DSM 11302 has a four hours exponential growth when cultured in bioreactor on the defined medium DM at 45 °C, but the maximal growth rate of 0.28 h-1 decreases rapidly. The yield of biomass production on glucose reached 0.25 gX.gGlc-1 (0.30 CmolX.CmolGlc-1). Oxygen uptake and glucose specific uptake rates were 3.3 mmol.L-1.h-1 and 0.57 CmolGlc.CmolX.h-1 respectively. None of the carbon sources, sulfur sources or growth factors added to the defined medium DM could improve growth results of the strain Deinococcus geothermalis DSM 11302. For the quantification of Deinococcus geothermalis DSM 11302 physiology, a fed batch culture strategy with a yeast extract and glucose co-substrate feed was chosen. This strategy revealed that glucose is not the preferential carbon source for biomass production. In addition, yeast extract can be consumed as organic nitrogen source and/or as carbon source. Deinococcaceae are mainly proteolytic microorganisms, yeast extract is an essential element to obtain a non-limiting growth of Deinococcus geothermalis DSM 11302. With this co substrate feed strategy, 253 g of yeast extract and 26 g of glucose were added to produce 99 gMS of biomass or 9.6 gMS.L-1 in six hours. The maximal yeast extract and glucose specific uptake rate reached respectively 0.68 and 0.39 Cmol.CmolX 1.h 1. The maximal exponential growth rate is 1.05 h-1, which is the best result describes to date for a Deinococcaceae strain. These results implement the knowledge on physiology and nutritional requirements of Deinococcus geothermalis and give access to quantitative values for characteristic kinetic parameters and conversion yields

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR. / Deinococcus radiodurans is a Gram-positive bacterium known for its extreme resistance to a broad variety of DNA damaging agents. Among these, Ionizing Radiations and desiccation are the most harmful for the cell, since they introduce breaks in the genome. Double Strand Breaks (DSB) are particularly hazardous for the cell and they need to be repaired very efficiently, in order to avoid mutations leading to altered, if not lethal, phenotypes. Homologous Recombination (HR) is the most efficient mechanism by which DSBs are repaired. D. radiodurans is able to completely restore its genome in only 3 hours, and it accomplishes the entire process through the RecFOR pathway. In order to be repaired, DSBs first need to be recognized. The protein believed to be responsible for this important step that takes place soon after the damage occurs in the cell, is RecN. RecN is recruited at the early stages of DNA repair and in vivo studies have demonstrated its propensity to localize to discrete foci. In vitro studies also suggest that RecN possesses a DNA end-joining activity previously observed for SMC proteins (such as cohesin), which are structurally related to RecN. Several structural studies have been carried out on the SMC-like protein, Rad50, but so far no structural information is available for RecN. The work presented here focused on the structural characterization of RecN and its constitutive domains. We obtained crystal structures of three partially overlapping constructs of RecN and Small Angle X-ray Scattering was performed on the individual domains and the full-length protein. The study of RecN in solution complemented our crystallographic study and enabled us to build a reliable, atomic model of the full-length protein. Mutations were designed and the mutant RecN proteins were produced in order to characterize the ATP hydrolysis activity of RecN, which is a conserved feature of this family of proteins. Extensive biochemical studies were carried out on wild-type and mutants of both the full-length protein and the single domains, in order to determine the role and function of each of the domains. Our results led us to propose a model for how RecN might recognize DSBs, tether two broken DNA ends and prepare the DNA for subsequent repair by the RecFOR machinery.