O produto de redução da nicotinamida adenina dinucleotídio (NADH) foi convertido no seu derivado hidratado NADH-X (6-hidroxi-l,4,5,6-tetraidronicotinamida adenina dinucleotídio) por ação de íons polibásicos tais como: fosfato, arsenato etc, ou por ação enzimática da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD). A cinética da hidratação foi acompanhada pelo aumento de absorbância (ΔA285 nm) e o aparecimento de um efeito Cotton a 285 nm , notando-se que quando se parte do anômero β da coenzima, o efeito Cotton positivo só se desenvolve nos estágios finais da reação na presença de enzima. Com base nesses resultados postulou-se a formação de um intermediário que se transforma num produto final, o qual mostra um efeito Cotton positivo a 285 nm. Supõe-se que essa última transformação seja uma epimerização β→α, de maneira que a adição de água não afeta inicialmente a configuração do átomo C1, da ribose. Contudo, após a hidratação, o produto se transforma no epímero α, que é termodinamicamente mais estável. Na ausência da enzima, o efeito Cotton aparece em estágios anteriores, sugerindo que a hidratação, sendo lenta, dá oportunidade à epimerização. Consequentemente não há tanto acúmulo deste intermediário, que apresenta efeito Cotton praticamente nulo. A hidratação do anômero α-NADH, na presença de GDP, mostrou um aumento de absorbância a 285 nm mais rápido do que para a forma β. Por outro lado, o efeito Cotton positivo só começou a aparecer após desenvolvimento de 60% do ΔA285 nm. Isto indicou que também para α-NADH há formação de um intermediário, o qual apresenta um efeito Cotton nulo. Quando β-NADH foi hidratado na ausência da enzima, observou-se um comportamento semelhante, porém, menos marcante com relação ao aparecimento do efeito Cotton. O fato de GPD e íons polibásicos produzirem efeitos semelhantes sobre os anômeros α e β, sugere que a ação enzimática da GPD não é estereoespecífica, produzindo uma mistura de epímeros em C6. Explica, também, o efeito Cotton nulo quando já se tem grande parte da hidratação efetuada. Desta maneira pôde-se afirmar (i) que o intermediário é uma mistura de epímeros em C6; (ii) que com o tempo predomina o epímero termodinamicamente mais estável. Os mesmos estudos foram desenvolvidos com NADPH, desamino-NADH e NMNH, para esclarecimentos a respeito da influência de grupos fosfato, amino e açúcar na catálise da hidratação e dos centros responsáveis pelo efeito Cotton positivo a 285 nm, nos piridinos nucleotídios. Observou-se que NADPH tem comportamento semelhante ao β-NADH, indicando que o grupo fosfato não tem papel importante nas catálises química e enzimática. No caso do mononucleotídio e desamino-dinucleotídio não houve diferença significativa entre as velocidades de hidratação química e enzimática, o que siginifica ser importante a presença do amino grupo da adenina para catálise enzimática no caso de NADH. Os derivados acima, também, apresentaram efeito Cotton positivo nos estágios finais da reação. Com base no fato, que o mononucleotídio também apresentou efeito Cotton positivo, de mesma intensidade dos dinucleotídios, pôde-se afirmar que o açúcar ligado ao anel da nicotinamida é o responsável pela dissimetria do produto formado. Traçou-se o espectro de absorção circular dicróica do isômero 1,6-NADH, ainda desconhecido, para obter-se informações a respeito da sua estrutura. Através dos valores de elipticidades molares, concluiu-se que é mais rígida do que a do 1,4-NADH, presumivelmente, devido a ligação simples, que une os anéis piridínico e ribosídico, ter rotação mais impedida, como consequência da maior proximidade do par de hidrogênios da piridina, com a ribose. O estudo da adição de CN- aos piridinos nucleotídios e compostos relacionados, usando técnica de dicroismo circular, mostrou haver estereosseletividade na adição. O espectro de absorção circular dicróica do aduto β-NAD+/CN- mostrou uma banda negativa larga com máximo em torno de 330 nm. Esta banda é assimétrica, o que permite um desdobramento em outras duas, com máximos a 325 e a 345 nm, de intensidade semelhantes. Em analogia com a redução dos piridinos nucleotídios, que ocorre nas posições 2, 4 e 6, pôde-se afirmar que a adição de CN-, também, ocorre em outras posições e não exclusivamente em 4. A banda de dicroismo circular na região de 345 nm, pareceu indicar a presença do isômero 1,6. O fato deste estar em concentração baixa a ponto de não ser detectável espectrofotometricamente, indicou que a força rotacional é bem maior do que para o isômero 1,4. Tal fato deve estar relacionado com a maior proximidade do CN- ao anel carboidrático. No aduto da forma α do piridino nucleotídio, o espectro de dicroismo circular apresentou uma banda negativa, com máximo de 342 nm e uma inflexão a 325 nm. Essa assimetria mostrou, claramente, a existência dos dois isômeros e, que a adição de CN- em C6 é bastante estereosseletiva. Além da estereosseletividade, pode estar contribuindo, também a menor mobilidade rotacional do anel diidronicotinamídico, quando se tem aduto em C6. A estereosseletividade da adição de cianeto veio corroborar com a proposição de um equilíbrio rápido entre as conformações aberta e fechada para os piridino nucleotídios. A possível existência de uma transição fraca, associada ao núcleo diidronicotinamídico, foi confirmada detectando-se um efeito Cotton associado a ela. Esse efeito foi observado para α-NADH, β-NADH e seus correspondentes adutos de CN-. Realizando-se o mesmo estudo para o complexo de β-NADH.Cu++, verificou-se que o efeito Cotton é 15 vezes mais intenso, confirmando assim, a detecção pioneira dessa transição fraca, presumivelmente de natureza singlete-triplete. / The reduction product of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is converted into the hydration product NADH-X (6-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydronicotinamide adenine dinucleotide) by the action of polybasic ions such as phosphate, arsenate etc., or by enzymatic catalysis with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). The hydration kinetics were followed by the increase in absorbance at 285 nm. Starting with the β-anomer of the coenzyme, the transition at 285 nm begins to exhibit a positive Cotton effect only in the later stages of the reaction. On the basis of the results, the formation of an interrnediate not exhibiting a Cotton effect at 285 nm is postulated. Since the hydration would not be expected to change the configuration at C1, of the ribose, the appearance of the Cotton effect is presumably due to an epimerization from the β-epimer to the thermodynamically more stabe α-epimer. In the absence of enzyme, the Cotton effect appears at somewhat lower conversions, suggesting that the slower hydration reaction provides greater opportunity for the occurrence of the epimerization. The increase in absorbance at 285 nm is more rapid for the hydration of the α-anomer of NADH than for the β-form in the presence of GPD. A positive Cotton effect is only observed for the forrner after the reaction has gone to about 60% completion. This indicates that an intermediate not exhibiting a Cotton effect is also formed in the case of α-NADH. Similar behavior was observed in the non-enzymatic hydration, however, as in the case of β-NADH, the onset of the Cotton effect occurred at lower conversions. The fact that GPD and polybasic ions produce similar effects on both the α and β anomers suggests that the enzymatic action of GPD is non-stereospecific, producing a mixture of epimers at C6. This also explain the absence of a Cotton effect even though significant hydrations has occurred. Thus we conclude (i) that the intermediate is a mixture of C6 epimers and (ii) that the more thermodynamically stable epimer predominates at long reaction times. The same studies were carried out with NADPH, deamino-NADH and NMNH to clarify the catalytic influence of the phosphate, amino, and sugar groups on the hydration and to identify the centers responsible for the positive Cotton effect at 285 nm in pyridine nucleotides. The observation that the behavior of NADPH is similar to that of β-NADH indicates that the phosphate group does not play an important role in the chemical and enzymatic catalysis. In the case of NMNH and deamino-NADH there is no significant difference between the rates of the chemical and enzymatic hydration, which implies that the presence of the amino group of adenine is important in the enzymatic catalysis of the hydration of NADH. The above derivatives also present positive Cotton effects in the later stages of the reaction. Since that mononucleotide exhibits a positive Cotton effect of intensity equal to that of the dinucleotides, it can be concluded that the sugar attached to the nicotinamide ring is responsible for the assymetry of the product. The previously unknown circular dichroic absorption spectrum of 1,6-NADH was determined in order to gain insight into its structure. From the values of the molar ellipticity it is concluded that the assymetric center of 1,6-NADH is more rigid than that of. 1,4-NADH. This is presumably due to a greater hindrance to rotation about the single bond between the pyridine and ribose rings in 1,6-NADH. A circular dichroic study of the addition of CN- to pyridine nucleotides and related compounds demonstrated the stereoselectivity of the addition. The circular dichroic absorption spectrum of the B-NAD+/CN- adduct exhibits a broad assymetric negative band with a maximum at about 330 nm. This band was interpreted in terms of two bands of similar intensity with maxima at 325 and 345 nm. By analogy with the reduction of pyridine nucleotides,which occurs at position 2,4 and 6, it is concluded that CN- addition also occurs at positions other than C4. The band at 345 nm was attributed to the 1,6-isomer. The fact that this isomer could not be detected by conventional absorption techniques indicates that it is present in low concentrations relative to the 1,4-isomer. It must have therefore has a much greater rotational strength, which is reasonable in view of the proximity of the CN- to the carbohydrate ring. The circular dichroic absorption spectrum of the α-NAD+/CN- adduct exhibited a negative band with a maximum at 342 nm and an inflection at 325 nm. This assymetry clearly demonstrated the presence of two isomers and the stereoselectivity of CN- addition at C6. Although the l,6-adduct could not be detected by conventional absorption techniques, the stereoselectivity of the addition and a large rotational strength contribute to its circular dichroic intensity. The stereoselectivity of the CN- addition corroborates the existence of a rapid conformational equilibrium between the folded and unfolded forms of pyridine nucleotides. A Cotton effect associated with the weak electronic transition attributed to the dihydronicotinamide nucleus was observed for α-NADH, β-NADH, and the corresponding CN- adducts, confirming the existence of the transition. For the β-NADH.CU++ complex, the Cotton effect was found to be 15 times more intense, thus confirming the original detection of this weak transition, which presumably has singlet-triplet character.

O genoma de Xanthomonas citri (Xac) possui mais de 20 tipos de transportadores do tipo ABC incluindo o operon ssuABC associado ao transporte de alcano sulfonatos. Deste operon, escolhemos a proteína periplasmática ligadora de alcano sulfonatos SsuA2, para caracterização e análises espectroscópicas e estruturais. A rSsuA2 foi expressa no citoplasma de células de Escherichia coli e utilizada para a preparação de anticorpos em camundongos, que foram capazes de reconhecer a proteína recombinante, mas não a nativa no extrato de células de Xac. A rSssuA2 apresenta estrutura característica de proteínas alfa-beta, maior estabilidade em pH neutro (7.0), como também foi evidenciado pela obtenção de cristais somente nesta faixa, e pouca flexibilidade ao desenovelamento térmico. Os cristais difratam com resolução de 1.8 Å e pertencem ao grupo espacial de simetria P21. Além do o operon ssu (ssu2) altamente conservado, Xac apresenta o operon tau (ssu1) para captação de taurina. O papel do operon para Xac é discutido. / Xanthomonas citri (Xac) genome has more than 20 different ABC transporters, including the ssuABC operon. In this work, the alkanosulphonate-periplasmic binding protein SsuA2 was chosen for spectroscopic and structural analysis. The rSsuA2 protein was expressed as a soluble form and purified by immobilized metal affinity chromatography. Antibodies produced from the recombinant protein were able to recognize the rSsuA2, but not the native protein in the Xac extract samples. The protein presents secondary structure defined by alfa helices and beta-sheets, high stability in neutral pH and low flexibility to the thermal denaturation. The determination of the optimal pH range was important to produce crystals of high quality diffracting at 1.8 Å with symmetry of the P21 spatial group. Besides the highly conserved operon ssu (ssu2), Xac has the tau operon (ssu1) for taurine uptake.

Resumo: Estudos fitoquímicos visando o isolamento de benzopiranos quirais foram realizados em Peperomia obtusifolia e Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Da espécie P. obtusifolia foram isolados dois cromanos racêmicos, a peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1- benzopirano carboxílico, bem como oito ésteres isoméricos deste último com os monoterpenos borneol e fenchol, inéditos na literatura. P. gaudichaudianum forneceu o cromeno ácido gaudichaudiânico, também como racemato. As misturas estereoisoméricas foram resolvidas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência quiral e os estereoisômeros purificados tiveram sua configuração absoluta determinada por comparação dos espectros experimentais de dicroísmo circular vibracional e eletrônico com aqueles preditos por cálculos mecânico-quânticos ab initio. Peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)- 2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1-benzopirano carboxílico foram assinalados como (+)-R, enquanto o ácido gaudichaudiânico foi assinalado como (+)-S. Os ésteres de cromano com borneol foram assinalados como (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S e (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, enquanto os ésteres com fenchol foram assinalados como (−)- 2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Com a configuração absoluta assegurada, foi possível a verificação do potencial tripanocida seletivo e sinérgico para os enantiômeros do ácido gaudichaudiânico e inibidor de HIV-1 protease seletivo para o (−)-(S)-ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4- metil-1,3-pentadienil)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phytochemical investigations focused on chiral benzopyrans were carried out on Peperomia obtusifolia and Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Two racemic chromanes, peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2- butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid, as well as eight novel isomeric esters of the latter with the monoterpenes borneol and fenchol, were isolated from P. obtusifolia. P. gaudichaudianum afforded the racemic chromene gaudichaudianic acid. All stereoisomeric mixtures were resolved using chiral high performance liquid chromatography and the purified compounds had their absolute configuration determined by comparison of experimental vibrational and electronic circular dichroism spectra with those calculated using ab initio quantummechanical methods. Peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3- methyl-2-butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid were assigned as (+)-R, whereas gaudichaudianic acid was assigned as (+)-S. The borneol chromane esters were assigned as (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S and (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, while the fenchol esters were assigned as (−)-2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Once the absolute configuration had been established it was possible to identify a selective and synergistic trypanocidal activity for the enantiomers of gaudichaudianic acid as well as a selective HIV-1 protease inhibitory potential for (−)-(S)-3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-2-(4- methyl-1,3-pentadienyl)... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maysa Furlan / Coorientador: Silvia Noelí López / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: André Luiz Meleiro Porto / Banca: Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva / Banca: Angelo da Cunha Pinto / Doutor

Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Edson Crusca Junior / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: José Luiz de Souza Lopes / Resumo: O peptídeo antimicrobiano Pantinina-3 (P3) possui 13 resíduos e é derivado do veneno do escorpião africano Pandinus imperator. Ele apresenta alta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, principalmente Enterococcus resistente à vancomicina (VRE-S13) in vitro. Entretanto, este peptídeo também possui atividade hemolítica. Neste contexto, foram desenhados e sintetizados cinco análogos de P3 a partir de substituições pontuais de resíduos específicos por um resíduo de lisina, os quais foram denominados L2K, I5K, N7K, I9K e L13K. O objetivo da criação destes análogos foi estudar a relação de estrutura e atividade do peptídeo P3, a fim de investigar o efeito da modificação de suas características biofísicas em sua atividade biológica. Para isso, os peptídeos foram sintetizados por meio da técnica de síntese em fase sólida (SPFS), purificados por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (CLAE-FR) e identificados por espectrometria de massas (SM). Os peptídeos purificados foram testados quanto à sua atividade biológica e foi verificado que o análogo L2K apresentou atividade somente para a bactéria Gram-negativa testada, o análogo N7K mostrou ser mais ativo que P3 tanto para Gram-positivas quanto para Gram-negativas e os outros análogos não apresentaram atividade antimicrobiana. Foi avaliada também a atividade hemolítica dos peptídeos, e foi verificado que o único análogo que apresentou atividade contra eritrócitos foi N7K. A hidrofobicidade d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The antimicrobial peptide Pantinin-3 (P3) has 13 residues and is derived from the venom of the African scorpion Pandinus imperator. It has high antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, mainly vancomycin-resistant Enterococcus (VRE-S13) in vitro. However, this peptide also has hemolytic activity. In this context, five P3 analogs were designed and synthesized from point substitutions of specific residues by a lysine residue, which were named L2K, I5K, N7K, I9K and L13K. The objective of the creation of these analogues was to study the structure and activity relationship of the P3 peptide in order to investigate the effect of the modification of its biophysical characteristics on its biological activity. For this, the peptides were synthesized using the solid-phase peptide synthesis technique (SPPS), purified by high performance liquid chromatography on a reverse phase column (HPLC-RF) and identified by mass spectrometry (MS). The purified peptides were tested for their biological activity and it was found that the L2K analog showed activity only for the Gram-negative bacteria tested, the N7K analog showed to be more active than P3 for both Gram-positive and Gram-negative and the others did not present antimicrobial activity. The hemolytic activity of the peptides was also evaluated, and it was verified that the only analog that showed activity against erythrocytes was N7K. The hydrophobicity of the peptides was analyzed by the retention time obtained by HPLC-RF an... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Our investigation was focused on a secondary protein structure called polyproline I. This helical structure has been known for a long time, but its occurrence and significance in nature is not yet fully known. In this thesis, we use Raman spectroscopy and chiral sensitive Raman optical activity. These methods are sensitive to the structure of proteins but are more informative and sensitive to the local arrangement than the commonly used ECD and UV absorption. We were able to obtain polyproline I Raman and ROA spectra that have not yet been published. We have described important differences between the spectra of polyproline I and II and observed the process of mutarotation. The experimental part of the work is supplemented by quantum chemistry calculations of spectra using the transfer of molecular property tensor. The calculated spectra corresponded very well with the experimental spectra.

Malaria is a serious disease that can lead to fatal consequences if not treated. It is mainly spread via Plasmodium falciparum, a parasite carried by mosquitoes as host organisms. As a potential way of treating malaria, research is being done on possible inhibitors of calmodulin (CaM) in the parasite. CaM is a highly conserved protein found in all eukaryotes, and is important in many essential biochemical reactions. The potential inhibitor analysed in this study is calmidazolium (CZM). This study aims to characterise structure and stability differences between the C-lobes of human and P. falciparum CaM, while analysing the effect of the presence of CZM.  Previous studies have proven that CZM acts as an inhibitor to human CaM by binding to the C-lobe, with a dissociation constant in the nano molar range. In other studies, thermal stability measurements have shown that the secondary structure of P. falciparum CaM is more stable than that of human CaM.  In this study, the stability measurements showed that for the ANS binding site and around tyrosines, the C-lobe of human CaM was more stable than the C-lobe of P. falciparum CaM, knowledge which was previously unknown. When studying the entire secondary structure, the C-lobe of P. falciparum CaM was found to be more stable, which is in agreement with previous studies for the secondary structure of the complete CaM variants. For binding, the dissociation constants for both the C-lobe of human CaM and for the C-lobe of P. falciparum CaM were proven to be at a lower range than micro molar, most likely in the nano molar range. This is in agreement with earlier findings regarding the entire human CaM. Furthermore, CaM and CZM were proven to have their absorbance at the same wavelengths. Finally, several amino acid differences between the C-lobes of human and P. falciparum CaM were found that could play a role in binding and stability. One specific amino acid that was suggested to contribute to the stabilisation of the C-lobe of P. falciparum CaM was isoleucine. In the C-lobe of human CaM, these isoleucines were exchanged to threonine and arginine. Another amino acid difference that could potentially play a key role was the valine versus isoleucine, where valine might contribute to the stabilisation of the ANS binding site of the C-lobe of human CaM. To perform this study, the methods fluorescence spectroscopy, UV spectroscopy and circular dichroism were used, as well as several bioinformatic tools.  Overall, both stability and structure analyses have helped determine several differences between the two CaM variants, opening up possibilities to find an inhibitor that targets only the CaM of P. falciparum. CZM still remains as an interesting potential inhibitor, and can hopefully be a part of future research in malaria treatment.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第19406号 / 工博第4122号 / 新制||工||1635(附属図書館) / 32431 / 京都大学大学院工学研究科高分子化学専攻 / (主査)教授 中條 善樹, 教授 澤本 光男, 教授 赤木 和夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DFAM

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