Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276691.pdf: 1483324 bytes, checksum: b4f538164d553239d6fa75c6a1ac46f6 (MD5) / As lipases são enzimas altamente versáteis que catalisam reações químicas com diversos substratos em diferentes condições e possuem características tanto bioquímicas quanto estruturais que lhes conferem resistência e termotolerância, além de serem empregadas em vários bioprocessos industriais como na produção de alimentos e biocombustíveis. A lipase de S. xylosus (AF208229) foi recentemente isolada e inicialmente caracterizada por nosso grupo de pesquisa e colaboradores. Essa proteína possui uma alta homologia e identidade estrutural com diversas outras lipases da família I.5, e apresenta atividade enzimática sobre p-nitrofenil-ésteres. Apesar de ser considerada uma enzima moderadamente termoestável e ter atividade enzimática sobre diferentes ésteres, o mecanismo de ação catalítica ainda permanece desconhecido, e principalmente, os mecanismos estruturais envolvidos em sua estabilização térmica nunca foram descritos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquimicamente a lipase recombinante AF208229 de S. xylosus recentemente clonada e expressa heterologamente, e investigar os possíveis mecanismos envolvidos em sua termotolerância por meio de análises de espectroscopia de dicroísmo circular (DC). Nesse trabalho a lipase de S. xylosus (AF208229) foi expressa e purificada, submetida a ensaios enzimáticos em três temperaturas (25°C, 37°C e 42°C), e três pH (7,0 8,0 e 9,0), sua especificidade catalítica foi analisada utilizando-se diferentes p-nitrofenil-ésteres como substratos (de 2 a 18 carbonos) e sua termoestabilidade foi acompanhada durante 10, 20 e 30 minutos em 95°C. Para as análises espectroscópicas, a enzima foi submetida a um tratamento de remoção de íons (produzindo-se a apo enzima) e sua atividade enzimática e sua termotolerância foram reavaliadas. Por fim o espectro de dicroísmo circular (DC) da apo e da holo_enzima foram analisados em diferentes condições. Os resultados obtidos apresentam pela primeira vez o perfil estrutural e os mecanismos de estabilidade 8 térmica dessa lipase. O perfil de DC da holo_enzima foi avaliado nas mesmas temperaturas descritas para os ensaios enzimáticos, bem como sua capacidade de re-enovelamento. O perfil de DC e a capacidade de re-enovelamento também foram observados para a apo_enzima. O efeito dos cofatores metálicos Zn2+ e Ca2+ foram avaliados nos ensaios enzimáticos da apo_enzima, na sua termotolerância, no seu perfil de DC e na sua capacidade de re-enovelamento. Observou-se que a holo_enzima apresenta sua maior atividade em pH 9,0 e 42°C, que tem preferência por substratos de cadeias curtas (pNP-acetato, 2 carbonos) e que retem 77% de sua atividade enzimática após 10 minutos de tratamento térmico (95°C). A holo_enzima é capaz de se re-enovelar, readquirindo sua conformação estruturalmente estável e ativa. A apo_enzima também é capaz de se re-enovelar após o tratamento térmico, porém perde quase totalmente sua atividade. Observou-se que na presença do íon Zn2+ a apo_enzima se re-enovelou e reteve sua atividade enzimática. Com base nesses resultados poderia afirmar-se que a lipase de S. xylosus (AF208229) é uma metaloenzima dependente de zinco e que esse íon possivelmente localizado em um motivo estrutural rico em -hélices próximo ao ativo site. / Lipases are highly versatile enzymes, which catalyze many chemical reactions with different substrates in different conditions. These enzymes have particular biochemical and structural characteristiscs which promote stability and thermal resistance. Besides, they are used by industries, i.e: food technology, detergents and biofuels. S. xylosus lipase (AF208229) was recently isolated and characterized by our group. This enzyme shares a high homology with other lipases among I.5 lipases family and has activity on p-nitrophenyl esters. Although considered a moderated thermostable lipase, its catalytic function remains unclear and its structural mechanisms for thermal stabilization have never been described. This work assessed the enzymatic activity of the recombinant lipase from S. xylosus in three different temperatures (25°C, 37°C and 42°C) and pH (7.0, 8.0 and 9.0), and the thermostability (incubation at 95°C for 10, 20 and 30 minutes). In order to investigate the mechanism involved in enzymatic activation, the enzyme was submitted to an ion removal treatment (to obtain an apo_- enzyme) and its activity and themotolerance were evaluated in the presence and absence of Zn2+ and Ca2+. The structural profile of apo-_enzyme and holo_enzyme were assessed by circular dichroism (CD) at different conditions in the presence an in the absence of metal cofactors as: Zn2+ and Ca2+. These results represent the first insights on S. xylosus lipases secondary structure and its mechanism for thermal stabilization. S. xylosus lipase (AF208229) was more active in pH 9.0, 42°C with specificity for short-chain substrates (pNP-acetate C2). In addition, this enzyme was able to maintain 77% of its activity after a thermal treatment (95°C for 10 min) and to refold to its stable conformation. apo_enzyme showed the same ability to refold as seen to holo_enzyme, but was not able to keep its activity after thermal treatment, which indicate the need of metal for its activity stabilization. Interesting, in the presence of Zn2+ the apo_enzyme was able to acquire a more stable conformation after thermal treatment and still keep residual activity. 10 These results propose that S. xylosus lipase (AF208229) is a metalloenzyme which uses Zn2+ as its metal coordinating, and the Zn2+ is possibly located in a-helical rich motif close to the active site.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-29Bitstream added on 2014-11-10T11:58:48Z : No. of bitstreams: 1 000773281_20150701.pdf: 797370 bytes, checksum: 434b28b11c8cac6876c6e828292d965f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-07-01T11:47:24Z: 000773281_20150701.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-01T11:48:07Z : No. of bitstreams: 1 000773281.pdf: 6334511 bytes, checksum: ac228b59d3dede16f09efc26274c2ef6 (MD5) / O sistema toxina-antitoxina ParE-ParD é um sistema bacteriano de morte póssegregacional codificado numa ampla gama de hospedeiros. ParE é uma proteína pequena, de aproximadamente 12 kDa codificada pelo gene parE. ParD é uma antitoxina de cerca de 9 kDa, codificada pelo gene parD, capaz de complexar com ParE e neutralizá-la. Estudos têm mostrado o envolvimento da enzima DNA girase no processo de morte celular pela ParE, entretanto, não se tem disponível na literatura nenhuma evidência de inibição desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV. Embora encontrada numa ampla diversidade de microorganismos, ParE não possui função celular totalmente elucidada e seu mecanismo de citotoxicidade permanece ainda desconhecido. Com base na estrutura primária da proteína ParE de E. coli e nos escassos dados disponíveis para esta toxina, peptídeos miméticos foram racionalmente projetados visando compreender o mecanismo de inibição de ParE sobre a atividade da DNA girase, bem como, avaliar a ação destes miméticos na atividade da Topoisomerase IV e da Topo II humana. Estas sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. A capacidade de inibição destes peptídeos miméticos sobre a atividade das topoisomerases foi testada por ensaios de eletroforese em gel. Os peptídeos que apresentaram melhores resultados de inibição sobre a atividade das topoisomerases foram o ParERM3 e o ParEC3, projetados para conter os resíduos de aminoácidos L61-R100 e L69-R100, respectivamente, presentes na porção C-terminal da estrutura da proteína ParE de Escherichia coli. A sequência “LNIES” (L101 a S105), quando presente nos peptídeos miméticos atenuou a toxicidade dos mesmos frente às topoisomerases, provavelmente por interferir na interação peptídeo-topoisomerase. Embora não existam... / The toxin-antitoxin system ParE-ParD is a bacterial system of post-segregational death encoded in a wide range of hosts. ParE is a small protein of approximately 12 kDa encoded by parE gene. ParD is an antitoxin about 9 kDa, encoded by the parD gene, able of complexing with ParE and neutralize it. Studies have shown the involvement of the enzyme DNA gyrase in the cell death process by ParE, however, is not available in the literature any evidence of inhibition of this protein on the activity of topoisomerase IV. Although found in a wide variety of micro-organisms, the ParE function has not been fully elucidated and its cytotoxic mechanism remains unknown. Based on the primary structure of the E. coli ParE and the limited data available for this toxin, mimetic peptides were rationally designed aiming at understanding the mechanism of inhibition of ParE on the activity of DNA gyrase, as well as on the topoisomerase IV and human topoisomerase II activities. These peptides sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. The ability of these mimetics to inhibit the activity of topoisomerases was tested by electrophoresis on agarose gel. The peptides that showed better results on the inhibition activity of topoisomerases were ParERM3 and ParEC3 , designed to contain the L61-R100 and L69-R100 amino acids sequence, respectively, found of the C-terminal portion of the ParE structure of Escherichia coli. The LNIES sequence (L101 to S105), when present in the mimetic peptides, attenuated the toxicity of the peptides on topoisomerases activity, probably by interfering in the topoisomerase - peptide interactions. Despite the absence of data in the literature regarding the toxicity of ParE protein on the topo IV and human topo II activities, the peptides ParERM3 and ParEC3 showed better inhibitory activity on these enzymes when compared...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-19Bitstream added on 2014-06-13T20:21:35Z : No. of bitstreams: 1 vicente_ef_dr_araiq_parcial.pdf: 165362 bytes, checksum: 96b2cf2b3ae74363a4b5898b957a3b6a (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:42Z: vicente_ef_dr_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:08Z : No. of bitstreams: 1 000721605_20150819.pdf: 147542 bytes, checksum: f5cc64495e4f5a562a1e11d2ae711ce3 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-20T11:58:40Z: 000721605_20150819.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T11:59:13Z : No. of bitstreams: 1 000721605.pdf: 4723399 bytes, checksum: 29bea79ab4fbb0c39fdce178c6b55872 (MD5) / A diidroorotato desidrogenase é uma enzima que apresenta um papel central na biossíntese de pirimidinas e catalisa a oxidação do diidroorotato a orotato. A enzima atua durante a via “de novo” de síntese de pirimidinas e está presente em quase todos os organismos vivos. A diidroorotato desidrogenase humana (HsDHODH) pode representar um importante alvo para o tratamento de doenças hiperproliferativas e inflamatórias, já que sua inibição bloqueia a síntese de ácidos nucléicos, impedindo a sua proliferação. Esta enzima tem uma estrutura monomérica e está associada com a membrana interna das mitocôndrias pela sua extensão N-terminal. Assim, entender em detalhes como esta enzima interage com a membrana poderia elucidar um alvo seletivo para drogas antiproliferativas, antiparasíticas e imunossupressivas. Esta região está também envolvida com a catálise central da enzima, sequestrando moléculas de ubiquinona presentes na membrana, fundamentais para as reações de oxirredução feitas pela enzima. Deste modo, para um melhor entendimento destes aspectos, neste trabalho foram sintetizados, por meio da Síntese de Peptídeos em Fase Sólida (SPFS) o peptídeo Ac-GDERFYAEHLMPTLQGLLDPESAHRLAVRFTSLG-NH2, que corresponde ao microdomínio existente na porção N-terminal da HsDHODH, entre os resíduos 33 e 66. Três análogos marcados com o aminoácido paramagnético TOAC nas posições 0, 12 ou 20, além de dois análogos duplamente marcados também foram obtidos. Ambos os peptídeos com dupla marcação possuem uma cisteína ligada ao spin MTSSL na posição 35 (C-terminal) se diferenciando pela posição do segundo marcador: um contendo outra cisteína ligada ao MTSSL na posição 12 e o segundo possuindo o TOAC na posição 0 (ou N-terminal). Estes peptídeos foram estudados por técnicas... / The dihydroorotate dehydrogenase is an enzyme that has a central role on the pyrimidine biosynthesis and catalyses the oxidation of dihydrorotate to orotate. The enzyme acts on de novo pyrimidines nucleotides pathway and it is present in almost all the live organisms. The human dihydroorotate dehydrogenase (HsDHODH) can represent an important target for the treatment of hiperproliferative and inflammatory diseases, since its inhibition blocks the nucleic acid synthesis, which restrains the cell proliferation. This enzyme has a monomeric structure and it is associated into the inner mitochondrial membrane by the N-terminal extension. Thus, understanding in details how this enzyme interacts with the membrane could help to elucidate a selective target for antiproliferative, antineoplasic and immunosuppressive drugs. This region is also involved with the central enzyme catalysis, harboring quinones molecules that are in the membranes, which is essential for the oxidation-reduction reactions made by the HsDHODH. In this way, for a better evaluation of these aspects, in this work we synthesized through the Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) the peptide Ac-GDERFYAEHLMPTLQGLLDPESAHRLAVRFTSLG-NH2, which corresponds to the HsDHODH N-terminal microdomain, between the residues 33 to 66. Three analogues labeled with the paramagnetic amino acid TOAC in the positions 0, 12 or 20 and two doubly labeled analogues were also synthesized. Both doubly labeled peptides contain a MTSSL-attached cysteine residue bounded to the position 35 (C-terminus), differing by the position of the second spin label: one possessing a cysteine with MTSSL at position 12 and the other contains TOAC at position 0 (N-terminus). These peptides were studied by spectroscopy techniques in order to obtain information about... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf: 353281 bytes, checksum: 6786716aa7970dd6c603e25cad2d5709 (MD5) / As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura... / The experiments performed were, the production of cDNA using anti-sense primers and purified RNA, amplification of the gene encoding the 25K protein of Cole latent virus (CoLV25K), purification of the amplified fragment, cloning in multiplication vector pGEM-T for cell transformation into competent Escherichia coli strain TOP 10, vector purification, enzymatic digestion using the enzymes Bam HI and Hind III, subcloning in expression vector pET28a, transformation into competent cells of E. coli strain BL21-RIL, sequencing of the gene cloned into the expression vector and protein expression at 37 o C. When expressed at 37 °C, the protein with a molecular mass of 25 kDa was detected in inclusion bodies. Thus, the protein was purified under denaturing conditions (using 8 M urea) and subjected to dialysis to stimulate refolding. After refolding, the protein was concentrated to approximately 3 mg / mL and the circular dichroism assay was performed to verify the content of secondary structure, and dynamic light scattering, to estimate the size distribution of particle populations which are present in solution. The data from the deconvolution of circular dichroism experiments indicate a percentage of 40-46% α-helix, 12-14% β-sheet, 15-22% turns and 24-28% of other structures, indicating a structured protein; and the data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable, monodispersive, but forms a large complex of particles which must be separated to before crystallization experiments. Other techniques were used to solubilize the expressed protein: lowering the temperature of expression to 18 °C, using the method... (Complete abstract click electronic access below)

Neste trabalho, utilizando técnicas magneto-ópticas, estudamos tempos de relaxação spin-rede (T1) do estado fundamental de centros \'F\' e, cristais de halogenetos alcalinos (KCl-KBr). Descrevemos um sistema semi-automático para medidas ópticas de T1, capaz de medir tempos de relação curtos (~1mS), baseado na medida do Dicroísmo Circular magnético (DCM) que apresentam aqueles sais quando portadores de centros paramagnéticos. Obtivemos a dependência de T1 com o campo magnético H (até 65 Kgauss), bem como os espectros de DCM para diferentes concentrações nas matrizes mistas. Uma teoria desenvolvida por Panepucci e Mollenauer (1) para matrizes puras, foi adaptadas para explicar a relaxação spin-rede nos cristais mistos. Os resultados obtidos para o processo direto (T~2.0 K), confrontados com auqela teoria, mostram que o mecanismo de relaxação dominante até 25 KGauss continua sendo a modulação por fônons da interação hiperfins entre o elétron \'F\' e os núcleos vizinhos. / Using magneto-optic techniques we have studied the ground state spin- lattice relaxation times (T1) of \'F\' centers in mixed Alkali Halide cristals (KCl-KBr). We describe a computer assisted system to optically measure short relaxation times (~1mS). The technique is based on the measurement of the Magnetic Circular Dicroism (MCD) presented by F centers. We obtained the T1 magnetic field dependency at 2 K up to 65 kGauss), as well as the MCD spectra for different relative concentration at the mixed matrices. The theory developed by Panepucci and Mollenauer for F centers spin-lattice relaxation in pure matrices was modified to explain the behavior of T1 in mixed cristais. The Direct Process results (T~2.0 K) compared against that theory shows that the main relaxation mecanism, Up to 25 kGauss, continues to be phonon modulation of the hyperfine interaction between \'F\' electrons and surrounding nuclei.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:25:51Z : No. of bitstreams: 1 000841833_20170417.pdf: 281313 bytes, checksum: 8f2aa9fdfa5ffa94e65eb440978fe805 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-04-17T13:37:16Z: 000841833_20170417.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-04-17T13:38:04Z : No. of bitstreams: 1 000841833.pdf: 2174199 bytes, checksum: 085bf6e5fb3ed50c4ce7758cc704e700 (MD5) / Terminalia catappa Linn. pertence à Família Combretaceae e é comumente chamada amendoeira-da-praia ou chapéu de sol. A família Combretaceae reúne numerosas espécies que têm sido estudadas por seu uso pela população para fins medicinais. É originária da Malásia, mas, muitas vezes, cultivada e muito característica da costa brasileira. A partir do extrato hidroalcoólico das folhas, foram detectados como constituintes principais a substância majoritária punicalagina (anômeros α e β), o composto punicalina, ácido galágico e ácido elágico. Identificouse, também, as substâncias 1,2,3-Tri-O-galoil-β-D-glicose e possíveis isômeros, 1,6- Di-O-galoil-β-D-glicose, HHDP-acetilglicosídeo, HHDP-hexosídeo, ácido elágico hexosídeo, ácido galágico e apigenina 8-C-(2'-galoil)-β-D-glicopiranosil. Estes metabolitos foram confirmados por experimentos FIA-ESI-IT-MSn (Direct Flow Analysis-Electrospray ionization-Íon Trap-Tandem Mass Spectrometry) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) acoplada a arranjo de fotodiodos (PDA). Ácido elágico, ácido gálico e galato de metila foram confirmados por experimentos de co-injecção de padrão. Punicalagina foi detectada e isolada da fração hidrometanólica como uma mistura de anômeros e confirmada por experimentos de RMN 1H e 13C, mono e bidimensionais. O fracionamento da fração acetato proveniente do extrato hidroalcoólico por MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) permitiu o isolamento dos metabólitos ácido galágico e apigenina 8-C-(2'-galoil)-β-D-glicopiranosil. A configuração absoluta dos anômeros da punicalagina e do composto apigenina 8-C-(2'-galoil)-β-D-glicopiranosideo foi estabelecida por experimentos de dicroísmo circular (DC). A determinação quantitativa dos principais metabolitos secundários foi realizada por HPLC-PDA, possibilitando, assim, a determinação da concentração e teor (%) de... / Terminalia catappa Linn. belongs to Combretaceae family and is commonly called almond-the-beach or sun hat.The Combretaceae family gathers numerous species that has been studied for its use by the population for medicinal purposes. It is from Malaysia, but often cultivated and very characteristic of the Brazilian coast. From the alcoholic extract of the leaves were detected as main constituents the major substance punicalagin (α and β anomers), the punicalin compound, gallagic acid and ellagic acid. It was identified as well, the 1,2,3-Tri-O-galloyl-β-D-glucose substances, and possible isomers, 1,6-Di-O-galloyl-β-D-glucose, HHDP acetilglicoside, HHDPhesoside, ellagic acid hexoside, gallagic acid and apigenin 8-C (2 '-galloyl)-β-Dglucopyranosyl. These metabolites were confirmed by FIA-ESI-IT-MSn experiments (Direct Flow Analysis Electrospray ionization-Ion-Trap Tandem Mass Spectrometry) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) coupled with diode array (PDA). Ellagic acid, gallic acid and methyl gallate were confirmed by standard coinjection experiments. Punicalagin was detected and isolated from the hydromethanol fraction as a mixture of anomers experiments and confirmed by 1H and 13C NMR, mono- and bi-dimensional. The ethyl acetate fraction from fractionation of the hydroalcoholic extract by MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) allowed the isolation of galágico acid metabolites and 8 apigenin-C (2'- galloyl) -β-Dglucopyranosyl. The absolute configuration of anomers of the compound of punicalagin and apigenin 8-C (2'-galloyl) -β-D- glucopyranosyl was established by experiments circular dichroism (CD). Quantitative determination of the main secondary metabolites was performed by HPLC-PDA, thus allowing the determination of concentration and content (%) of metabolites present in the alcoholic extract. They were first quantified in hydroalcoholic extract of this species, the...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-24Bitstream added on 2014-06-13T18:09:16Z : No. of bitstreams: 1 vicente_ef_me_araiq.pdf: 1240368 bytes, checksum: 4c158f3620376ae0b43bb4349588c93c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nas últimas décadas, um grande número de peptídeos antimicrobianos tem sido isolado de várias espécies de seres vivos, fazendo parte da sua imunidade inata. Estes peptídeos possuem algumas características em comum: 1) apresentam carga positiva (grande ocorrência de aminoácidos básicos); 2) possuem um porcentual considerável de aminoácidos hidrofóbicos e 3) apresentam grande tendência de adotarem estruturas secundárias anfipáticas. Devido à sua propriedade de permeabilizar e destruir membranas bacterianas, levando-as à morte, estes peptídeos são um foco de interesse no desenvolvimento de novos antibióticos. Um modo de estudo destas moléculas é por meio da adição de marcadores na seqüência peptídica, permitindo relacionar as propriedades conformacionais com a atividade biológica envolvida. Desta forma, este trabalho teve como objetivo sintetizar e avaliar 3 análogos de um novo peptídeo antimicrobiano extraído da pele da rã Hypsiboas albopunctatus de seqüência GWLDVAKKIGKAAFNVAKNF( I/L), denominado de hilina C (hyC), a fim de obter informações a respeito do seu mecanismo de ação e estruturação frente a miméticos de membrana. Os análogos possuem o composto paramagnético ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxil-4- amino-4-carboxílico (TOAC) substituindo os aminoácidos alanina na posição 13 e triptofano na posição 2, ou adicionado na extremidade N-terminal do peptídeo. Os peptídeos foram sintetizados por Síntese Peptídica em Fase Sólida (SPFS) utilizando a estratégia química Fmoc. As propriedades conformacionais dos peptídeos e as suas dinâmicas foram investigadas por dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) em água, trifluoretanol (agente indutor de estrutura secundária), micelas zwitteriônicas (lisofosfatidilcolina - LPC) e em dois tipos de lipossomas de composições lipídicas diferentes:... / In recent decades, a large number of antimicrobial peptides have been isolated from several species of microorganisms as part of their innate immunity. These peptides have some particular features: 1) positive charges (high occurrence of basic amino acids), 2) a considerable percentage of hydrophobic amino acids and 3) greater tendency to adopt amphipatic secondary structures. Due to the property of permeabilizing and destroying bacterial membranes, causing cell death, these peptides are interesting regarding the development of new antibiotics. To study these molecules, markers were added in the peptide sequence, allowing conformational properties to relate with the biological activity involved. Thus, this work aimed to synthesize and evaluate 3 analogues of a new antimicrobial peptide extracted from the skin secretion of the frog Hypsiboas albopunctatus, whose sequence is GWLDVAKKIGKAAFNVAKNFI/L, called Hilina C (hyC) in order to obtain information of the mechanism of action and structure of this peptide, using membrane mimetics. The analogues have the compound paramagnetic amino acid 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid (TOAC) replacing the alanine at position 13 and triptofan in position 2, or added to the end of the Nterminal peptide. The peptides were synthesized by Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) using the Fmoc chemistry strategy. The conformational properties of peptides and their dynamics were investigated by electronic paramagnetic resonance (EPR) and circular dichroism (CD) in water, trifluorethanol (TFE) (secondary structure inducer agent), zwitterionics micelles (lysophosphatidylcholine - LPC) and two types of liposomes in different lipid compositions: PE:PA:PC and SM:PA:PC. The biological activities were examined by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) in bacteria (two Gram-positive and two Gram-negative) and the minimal... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:10:35Z : No. of bitstreams: 1 cruscajunior_e_me_araiq.pdf: 1168682 bytes, checksum: e68054a6af1b3d4f9d9235d07ed0ef75 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho descreve a sintese, a relacao estrutura-funcao, a interacao com membranas e a atividade biologica de um peptideo proveniente da regiao amino-terminal da proteina Esticolisina II (St II). Esta proteina e uma citolisina pertencente a familia das actinoporinas, obtida da anemona marinha Stichodactyla heliantus. Estudos estruturais e biologicos da proteina nativa indicam que a regiao amino-terminal da St II participa do processo de formacao de poros em membranas. Deste modo, visando compreender o comportamento e a importancia dessa regiao para a atividade biologica da St II, 3 analogos contendo os 30 primeiros residuos que compoem a extremidade amino-terminal da St II foram sintetizados e analisados. Os peptideos foram obtidos mediante sintese em fase solida modificando-se um residuo de leucina ou isoleucina por triptofano nas posicoes 2, 7 ou 24. Os estudos conformacionais foram realizados atraves das tecnicas de fluorescencia e dicroismo circular. Para avaliar o comportamento estrutural dos peptideos em solucao, foram realizados estudos de variacao de pH, forca ionica e titulacao com um agente indutor de estrutura, o trifluoroetanol (TFE). Na interacao com mimeticos de membranas, os peptideos foram titulados por tres tipos de detergentes: dodecil-sulfato de sodio (SDS), HPS (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano-sulfonato) e LPC (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3- fosfocolina). Complementando o estudo acima, tambem foram realizados experimentos utilizando acrilamida como agente supressor de fluorescencia. Os resultados obtidos demonstram que a estrategia de sintese de peptideos em fase solida atraves do protocolo Fmoc/tBu, utilizada na sintese dos peptideos deste trabalho, foi viavel. O processo de purificacao dos peptideos atraves de HPLC tambem se mostrou eficiente e viabilizou a obtencao do material com alto indice de pureza. / In this study, we describe the synthesis, the relation function-structure, the interaction with membranes and the biological activity of the N-terminus region of the protein Sticholysin II (St II). This protein is a citolisin, which belongs to the family of the actinoporins, purified from the sea anemone Stichodactyla heliantus. According to biological and structural studies of the native protein, the N-terminus region of St II is involved on the pore formation process in membranes. In order to elucidate the function and the importance of this region to the biological activity of St II, three analogs containing the first 30 residues of the N-terminus region of St II were synthesized and analyzed. The peptides were obtained by solid phase synthesis and altered through the substitution of a leucine or isoleucine for a tryptophan on the positions 2, 7 and 24. Circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence studies have been carried out to investigate conformational properties of the peptides. In order to evaluate the structural modification on aqueous solution, studies were performed in order to evaluate the pH, ionic strength and addition of the secondary structural-inducing solvent TFE. The interaction studies with micelles were performed using three different surfactants: sodium dodecil-sulfate (SDS), N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammoniumpropanesulfonate (HPS) and lysophosphatidylcholine (LPC), and using acrylamide as a fluorescence suppression agent. We have demonstrated that on solid phase peptides synthesis using the Fmoc/tBu strategy is a success. The purification process of peptides through HPLC, has also revealed to be efficient, once the material was obtained with high purity level above 95%. The experiments of hemolytic activity showed that the three peptides have activities in æM concentration, this results reinforce the idea that the 30 residues of the N-terminus region have an important role on pore formation in membranes.

Neste trabalho, utilizando técnicas magneto-ópticas, estudamos tempos de relaxação spin-rede (T1) do estado fundamental de centros \'F\' e, cristais de halogenetos alcalinos (KCl-KBr). Descrevemos um sistema semi-automático para medidas ópticas de T1, capaz de medir tempos de relação curtos (~1mS), baseado na medida do Dicroísmo Circular magnético (DCM) que apresentam aqueles sais quando portadores de centros paramagnéticos. Obtivemos a dependência de T1 com o campo magnético H (até 65 Kgauss), bem como os espectros de DCM para diferentes concentrações nas matrizes mistas. Uma teoria desenvolvida por Panepucci e Mollenauer (1) para matrizes puras, foi adaptadas para explicar a relaxação spin-rede nos cristais mistos. Os resultados obtidos para o processo direto (T~2.0 K), confrontados com auqela teoria, mostram que o mecanismo de relaxação dominante até 25 KGauss continua sendo a modulação por fônons da interação hiperfins entre o elétron \'F\' e os núcleos vizinhos. / Using magneto-optic techniques we have studied the ground state spin- lattice relaxation times (T1) of \'F\' centers in mixed Alkali Halide cristals (KCl-KBr). We describe a computer assisted system to optically measure short relaxation times (~1mS). The technique is based on the measurement of the Magnetic Circular Dicroism (MCD) presented by F centers. We obtained the T1 magnetic field dependency at 2 K up to 65 kGauss), as well as the MCD spectra for different relative concentration at the mixed matrices. The theory developed by Panepucci and Mollenauer for F centers spin-lattice relaxation in pure matrices was modified to explain the behavior of T1 in mixed cristais. The Direct Process results (T~2.0 K) compared against that theory shows that the main relaxation mecanism, Up to 25 kGauss, continues to be phonon modulation of the hyperfine interaction between \'F\' electrons and surrounding nuclei.

Resumo: Peptídeos bioativos são de elevado interesse como substitutos de antibióticos convencionais já que alguns destes apresentam atividade antimicrobiana. Eles são predominantemente catiônicos e tem sido mostrado que sua atividade antimicrobiana é modulada por interações eletrostáticas, hidrofóbicas e por características elásticas das membranas, seu alvo. Neste trabalho analisou-se a importância da carga elétrica líquida (Q) e hidrofobicidade na interação de quatro peptídeos com membranas modelo de caráter aniônico e zwitteriônico utilizando medidas de potencial eletrocinético, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Estes peptídeos denominados mastoparanos apresentam carga liquida de +1 a +4, devido à presença de resíduos ácidos e básicos, foram extraídos do veneno de vespas, três dos quais de espécie nativa da bodiversidade nacional, mostraram intensa atividade antimicrobiana. Nos peptídeos com Q = +1 e +2 predomina o caráter hidrofóbico enquanto nos demais o caráter hidrofílico; o peptídeo com Q = +4 tem sua estrutura resolvida por NMR e devido à alta homologia entre essa seqüência e dos demais se supõe que eles também sejam anfipáticos. A atividade lítica é caracterizada por uma razão [P]/[L] crítica entre as concentrações totais de peptídeo e lipídeo, acima da qual ocorre um processo cooperativo de liberação de corante do interior das vesículas. A razão crítica, a eficiência do vazamento e a cooperatividade mostraram ser dependentes na densidade superficial de carga da vesícula e da carga liquida do peptídeo. Observaram-se razões [P]/[L] críticas da ordem de sub-micromolar tanto em vesícula zwitteriônica quanto em vesícula aniônica. As curvas dose-resposta tornaram-se menos cooperativas com o aumento da carga líquida dos peptídeos, mostrando que a razão crítica aumenta com a carga. Os espectros... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bioactive peptides are of high interest as substitutes of conventional antibiotics since some of them present antimicrobial action. They are predominantly cationic and it has been shown that their antimicrobial activity is modulated by electrostatic interactions, hydrophobic contributions and the elastic features of the membranes they target. In this work we analyzed the importance of charge and hidrofobicity to the interaction of four peptides with anionic and zwitterionic model membranes using electrokinetics potential, circular dicrohism and fluorescence spectrsocopy. These peptides named mastoparans, have exhibit a net charge ranging from +1 to +4 due to the presence of acidic and basic residues, and three of them, extracted from the venom of wasps native of the brazilian biodiversity showed intense antibacterial activity. The peptides with Q= +1 and +2, are hydrophobic and the other two are hydrophilic. Lytic activity of peptides, accessed by the release of fluorescent dye entrapped in lipid vesicles, showed sigmoid dose-response curves either in zwitterionic or in anionic vesicles with sub-micromolar threshold ratios. The lytic activity was characterized by a threshold [P]/[L] value, above which cooperative dye release takes place. The threshold ratio, the leakage efficiency and cooperativity were found to be dependent on the vesicle surface charge density and on the peptide net charge. Roughly the threshold ratios increase with the peptide net charge and as the net charge increases the dose response curves become less cooperative. Circular dichroism spectra of the peptides in vesicles exhibit two negative dichroic bands at 222 and 208 nm characteristic of helical structure, while they were observed to be random coil in buffer. At peptide and lipid concentrations near the threshold ratio the CD spectra have the... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: João Ruggiero Neto / Coorientador: Márcia Perez dos Santos Cabrera / Banca: Antônio José da Costa Filho / Banca: Karin do Amaral Riske / Mestre