Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-19Bitstream added on 2014-06-13T19:05:20Z : No. of bitstreams: 1 rinaldo_d_dr_araiq.pdf: 1188120 bytes, checksum: 1e4f3603501a8b454e918390b4c81bce (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho abordou a determinação quali e quantitativa de enantiômeros de catequinas em extratos e infusões das folhas de espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae), tais como: B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia e B. verbascifolia. O trabalho descreve a determinação rápida e eficiente de catequina, ent- catequina, epicatequina e ent-epicatequina por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos e dicrísmo circular, usando coluna de fase estaconária quiral. O método possui alta seletividade e permite identificar inequivocadamente diastereômeros de catequinas em matrizes complexas como extratos vegetais, com limites de detecção (0,42 a 0,77 μg mL-1 ) e quantificação (1,27 a 2,32 μg mL-1 ) satisfatórios para as condições analisadas, e valores de precisão (0,3 to 4,8%) e exatidão (70,0 a 110,2%) recomendados pela ANVISA. Com exceção da espécie B. intermedia, quatro espécies do gênero apresentaram em seus extratos e infusões os diastereômeros catequina, epicatequina e ent-epicatequina. Experimentos para avaliar a epimerização da catequina indicaram que a incomum ent-epicatequina não é um artefato, podendo ser um produto do metabolismo de espécies do gênero Byrsonima. Enantiômeros da catequina apresentam diferentes atividades farmacológicas, o que pode causar a ocorrência de efeitos colaterais diversos, danosos à saúde humana. Portanto, esses resultados podem alertar quanto ao consumo indiscriminado de plantas medicinais pela população e contribuir para criação de políticas mais rigorosas no controle de qualidade de fitoterápicos no Brasil / This work deals with the qualitative and quantitative determination of catechin and epicatechin enantiomers both in extracts and infusions from the leaves of the Byrsonima (Malpighiaceae) species (B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia and B. verbascifolia). This work describes a simple and reliable analytical high performance liquid chromatographic (HPLC) method coupled with photodiode array detector and circular dichroism for simultaneous determination of catechin, ent-catechin, epicatechin and ent-epicatechin. The direct separation was obtained in normal phase by HPLC using chiral stationary phase. The method has high selectivity. Regardless of variations in retention time, it was possible to identify unequivocally the enantiomers of catechin and epicatechin in complex matrices like plant extracts with satisfactory limit of detection (0.42 to 0.77 μg mL-1 ) and limite of quantification (1.27 to 2.32 μg mL-1 ). Under the conditions used, precision values were 0.3 to 4.8%, whereas accuracy values were 75.0 to 110.2%, recommended by ANVISA. Aside from B. intermedia specie, the other four Byrsonima species presented catechin, epicatechin and ent-epicatechin diastereomers both in methanolic extract and infusions. Experiments were carried out for verification the possibility of catechin epimerization. It was observed that the unusual ent- epicatechin was not an artifact, but product of Byrsonima species metabolism. Enantiomers of catechin present dissimilar pharmacological activities, which may cause the occurrence of various side effects, harmful to human health. Therefore, these results may warn about the indiscriminate use of medicinal plants by the population and contribute to the quality control of Brazilian herbal medicines

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-15Bitstream added on 2014-06-13T20:26:06Z : No. of bitstreams: 1 batistajunior_jm_dr_araiq.pdf: 3011383 bytes, checksum: fd591b605558cb4d50f706b29ede19f2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos fitoquímicos visando o isolamento de benzopiranos quirais foram realizados em Peperomia obtusifolia e Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Da espécie P. obtusifolia foram isolados dois cromanos racêmicos, a peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1- benzopirano carboxílico, bem como oito ésteres isoméricos deste último com os monoterpenos borneol e fenchol, inéditos na literatura. P. gaudichaudianum forneceu o cromeno ácido gaudichaudiânico, também como racemato. As misturas estereoisoméricas foram resolvidas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência quiral e os estereoisômeros purificados tiveram sua configuração absoluta determinada por comparação dos espectros experimentais de dicroísmo circular vibracional e eletrônico com aqueles preditos por cálculos mecânico-quânticos ab initio. Peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)- 2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1-benzopirano carboxílico foram assinalados como (+)-R, enquanto o ácido gaudichaudiânico foi assinalado como (+)-S. Os ésteres de cromano com borneol foram assinalados como (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S e (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, enquanto os ésteres com fenchol foram assinalados como (−)- 2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Com a configuração absoluta assegurada, foi possível a verificação do potencial tripanocida seletivo e sinérgico para os enantiômeros do ácido gaudichaudiânico e inibidor de HIV-1 protease seletivo para o (−)-(S)-ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4- metil-1,3-pentadienil)... / Phytochemical investigations focused on chiral benzopyrans were carried out on Peperomia obtusifolia and Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Two racemic chromanes, peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2- butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid, as well as eight novel isomeric esters of the latter with the monoterpenes borneol and fenchol, were isolated from P. obtusifolia. P. gaudichaudianum afforded the racemic chromene gaudichaudianic acid. All stereoisomeric mixtures were resolved using chiral high performance liquid chromatography and the purified compounds had their absolute configuration determined by comparison of experimental vibrational and electronic circular dichroism spectra with those calculated using ab initio quantummechanical methods. Peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3- methyl-2-butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid were assigned as (+)-R, whereas gaudichaudianic acid was assigned as (+)-S. The borneol chromane esters were assigned as (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S and (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, while the fenchol esters were assigned as (−)-2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Once the absolute configuration had been established it was possible to identify a selective and synergistic trypanocidal activity for the enantiomers of gaudichaudianic acid as well as a selective HIV-1 protease inhibitory potential for (−)-(S)-3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-2-(4- methyl-1,3-pentadienyl)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:13Z : No. of bitstreams: 1 000846885.pdf: 505151 bytes, checksum: ad11474b84c8cf10e34014ace8c2c242 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peptdeos antimicrobianos possuem em geral cadeias curtas, carga líquida positiva devido ao excesso dos res duos b asicos e são ricos em amino acidos hidrof obicos. Possuem um grande potencial farmacológico, com atividade antimicrobiana modulada por interações eletrost aticas e hidrof obicas. Neste trabalho utilizou-se o pept deo sintético L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2), que devido aos res duos de acido asp artico e lisinas constituintes de sua cadeia, possui carga liquida +3, em pH neutro. Foram analisadas as insuficiências do pH e da carga de ves culas aniônicas na adsorçãao do pept deo. Este estudo utilizou medidas de potencial eletrocin etico de ves culas e experimentos de titulação monitorados por dicro smo circular (CD). A adsorção do L1A a LUVs de POPC e misturas POPC/POPG em diferentes proporções de POPG, foi medida nos pHs 4, 7 e 10. Os espectros de dicro smo circular dos peptídeos, na presença de vesícula, apresentaram caracter sticas de estruturas helicoidais, enquanto apresentaram estruturas desordenadas em tampão. As frações de hélices obtidas são maiores quando o pept deo adsorve em ves culas com maiores quantidades de POPG, indicando forte contribuição eletrost atica. As constantes aparentes de adsorção dos pept deos as membranas modelo foram calculadas atrav es da elipticidade de CD normalizada em 222 nm, obtidas por titulações de pept deo com ves culas. A a - nidade do pept deo a ves culas aniônicas e signi cativamente maior do que a ves culas zwitteriônicas, o que refor ca a import ancia das interçõeoes eletrost aticas no processo de adsorção do pept deo na bicamada. O efeito conjunto de carga das ves culas e de pH resultaram em signi cativa regulação de carga do pept deo resultando em valores de carga efetiva alta em pH 4,0 devido a protonação dos res duos de asp artico. Em pH 10,0 a pequena carga efetiva calculada deve-se as desprotona ações do N-terminal e das lisinas... / Antimicrobial peptides have in general short chains, positive net charge due to the excess of basic residues and are rich in hydrophobic amino acids. They have pharmacological potential as antimicrobial agents and their activity is modulated by electrostatic and hydrophobic interactions. In this work, we used the synthetic peptide L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2) that due to its acid and basic residues have an net charge +3, at neutral pH. The e ects of the pH and of the charges of anionic vesicles on the adsorption of L1A were analized. This study used measurement of electrokinetic potential of vesicles and titration experiments monitored by circular dichroism spectroscopy (CD). Adsorption of L1A to POPC and POPC/POPG LUVs in di erent POPG contents were assessed in the pH 4.0, 7.0 and 10.0. Circular dichroism spectra of the peptides in the presence of vesicles showed to features of helical structures; while random coil structures were observed at bu er for all the used pHs. The helical content was evaluated and showed to increase when the peptide adsorbs into vesicles with increasing amounts of POPG, indicating that there is a strong electrostatic contribution. Partition coe cients were calculated through the normalized CD ellipticities at 222 nm and showed that the a nity of the peptide for anionic model membranes is e ectively higher than those found for zwitterionic ones. It reinforces the importance of the electrostatic contribution to the process of peptide-lipid interaction. The coupled e ect of the vesicle charge and pH lead to signi cant charge regulation of the peptide resulting in high values of e ective charge at pH 4.0 due to the deprotonation of aspartic acid residues. At pH 10.0 the estimated e ective charge is small as a consequence of the deprotonation of both N-terminus and the lysines. The electrostatic and interfatial free energies seems to be additive only at pH 4.0, especially for the bilayers with higher content...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-24Bitstream added on 2015-03-03T12:07:18Z : No. of bitstreams: 1 000806896_20161029.pdf: 604503 bytes, checksum: 09b8247bf974f840e6a01780c107b6bb (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-31T10:32:33Z: 000806896_20161029.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-31T10:33:09Z : No. of bitstreams: 1 000806896.pdf: 21070065 bytes, checksum: 3cf0584410dc2cae4f214389ef036569 (MD5) / Levando em consideração a diversidade química das estirilpironas isoladas de Cryptocarya mandioccana, este trabalho teve por objetivo estudar o mecanismo de fragmentação de 6 dessas substâncias por ESI-MS/MS e por GC-EI-MS e também determinar a configuração absoluta dos centros metínicos hidroxilados e do centro C6 do anel pirônico. Foram isoladas seis estirilpironas polihidroxiladas: desacetilcriptocarialactona (1), criptomoscatona D1 (2), criptomoscatona E2 (3), criptomoscatona E1 (4), criptomoscatona E3 (5) e criptomoscatona F1 (6). As análises por ESI-MS/MS e os cálculos teóricos indicaram que em fase gasosa os sítios de protonação e cationização das estirilpironas ocorrem no oxigênio carbonílico, similarmente aos anéis lactônicos descritos na literatura. O mecanismo de fragmentação proposto para as estirilpironas cationizadas com Na+ é comum a todas, apresentando perda neutra de C10H12O [M+Na?148]+ e as substâncias tri-hidroxildas sofreram uma segunda fragmentação com perda neutra de acetaldeído [M+Na?148?44]+. Nos espectros de massas de íons totais não é observado o íon referente às moléculas protonadas [M+H]+, mas sim o íon [M+H?H2O]+ referente à perda de água, portanto uma dissociação na fonte. Assim como para a espécie cationizada, este íon foi submetido à CID e no espectro MS/MS é observado novas eliminações de água referentes as perdas das demais hidroxilas, íons [M+H?nH2O]+, e posteriormente abertura do anel pirônico e eliminação de mais uma molécula de água, seguida de CO [M+H?nH2O?CO]+. A derivação das estirilpironas com MSTFA permitiu analisá-las por CG-MS, porém em quase todos os casos não foi possível detectar o íon molecular. O pico base sempre é referente ao cátion de TMS (m/z 73), comum para substâncias derivadas com este reagente, enquanto que os outros íons fragmentos são resultantes da clivagem homolítica... / Taking into account the chemical diversity of styrylpyrones isolated from Cryptocarya mandioccana, this work aimed to study the mechanism of fragmentation of six compounds belonging to this class by means of ESI-MS/MS and GC-EI-MS analysis and also to assign the absolute configuration of hydroxylated methinic centers and that at C6 in the pyrone ring. Six styrylpyrones poli-hydroxilated: desacetilcryptocaryalactone (1), cryptomoscatone D1 (2), cryptomoscatone E2 (3), cryptomoscatone E1 (4), cryptomoscatone E3 (5), e cryptomoscatone F1 (6) were isolated. Analysis by ESI-MS/MS and data from theoretical calculations in gas phase suggest the carbonyl oxygen as protonation and cationization site of the styrylpyrones, which is in accordance to data reported for the lactone rings. The fragmentation mechanism proposed for cationized styrylpyrones with Na+ is common to compounds 1-6, with loss of neutral C10H12O [M+Na?148]+. Tri-hydroxylated substances showed a second fragmentation with loss of an acetaldehyde unit [M+Na??148?44]+. Although it was not possible to observe the protonated molecule ions [M+H]+ in the MS total ion spectrum, the ion [M+H?H2O]+ referring to water loss was observed, which indicates in-source dissociation. As for the cationized species, this ion was subjected to CID process and the MS/MS spectrum showed an additional water loss related to a second hydroxyl group, ions [M+H?nH2O]+. It was then followed by pyrone ring-opening and eliminations of a water molecule and CO [M+H?nH2O?CO]+. Derivatization of the styrylpyrones with MSTFA was conducted to allow the analysis by GC-MS. On the mass spectra, in almost all cases, it was not possible to detect the molecular ion, and the base peak was always related to cation TMS (m/z 73). This ion is common for substances derived with this reagent, while the others ions are fragments resulting from the homolytic ? cleavage with...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-05-13Bitstream added on 2014-06-13T19:08:28Z : No. of bitstreams: 1 ramosjunior_jeb_me_sjrp.pdf: 562249 bytes, checksum: 74be57a0079398982f07da1128698e36 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Not available.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-31Bitstream added on 2014-06-13T18:49:58Z : No. of bitstreams: 1 leite_nb_me_sjrp.pdf: 1707233 bytes, checksum: a9b663e6312a6e9e7f0d5b241ce03ac1 (MD5) / Peptídeos bioativos são de elevado interesse como substitutos de antibióticos convencionais já que alguns destes apresentam atividade antimicrobiana. Eles são predominantemente catiônicos e tem sido mostrado que sua atividade antimicrobiana é modulada por interações eletrostáticas, hidrofóbicas e por características elásticas das membranas, seu alvo. Neste trabalho analisou-se a importância da carga elétrica líquida (Q) e hidrofobicidade na interação de quatro peptídeos com membranas modelo de caráter aniônico e zwitteriônico utilizando medidas de potencial eletrocinético, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Estes peptídeos denominados mastoparanos apresentam carga liquida de +1 a +4, devido à presença de resíduos ácidos e básicos, foram extraídos do veneno de vespas, três dos quais de espécie nativa da bodiversidade nacional, mostraram intensa atividade antimicrobiana. Nos peptídeos com Q = +1 e +2 predomina o caráter hidrofóbico enquanto nos demais o caráter hidrofílico; o peptídeo com Q = +4 tem sua estrutura resolvida por NMR e devido à alta homologia entre essa seqüência e dos demais se supõe que eles também sejam anfipáticos. A atividade lítica é caracterizada por uma razão [P]/[L] crítica entre as concentrações totais de peptídeo e lipídeo, acima da qual ocorre um processo cooperativo de liberação de corante do interior das vesículas. A razão crítica, a eficiência do vazamento e a cooperatividade mostraram ser dependentes na densidade superficial de carga da vesícula e da carga liquida do peptídeo. Observaram-se razões [P]/[L] críticas da ordem de sub-micromolar tanto em vesícula zwitteriônica quanto em vesícula aniônica. As curvas dose-resposta tornaram-se menos cooperativas com o aumento da carga líquida dos peptídeos, mostrando que a razão crítica aumenta com a carga. Os espectros... / Bioactive peptides are of high interest as substitutes of conventional antibiotics since some of them present antimicrobial action. They are predominantly cationic and it has been shown that their antimicrobial activity is modulated by electrostatic interactions, hydrophobic contributions and the elastic features of the membranes they target. In this work we analyzed the importance of charge and hidrofobicity to the interaction of four peptides with anionic and zwitterionic model membranes using electrokinetics potential, circular dicrohism and fluorescence spectrsocopy. These peptides named mastoparans, have exhibit a net charge ranging from +1 to +4 due to the presence of acidic and basic residues, and three of them, extracted from the venom of wasps native of the brazilian biodiversity showed intense antibacterial activity. The peptides with Q= +1 and +2, are hydrophobic and the other two are hydrophilic. Lytic activity of peptides, accessed by the release of fluorescent dye entrapped in lipid vesicles, showed sigmoid dose-response curves either in zwitterionic or in anionic vesicles with sub-micromolar threshold ratios. The lytic activity was characterized by a threshold [P]/[L] value, above which cooperative dye release takes place. The threshold ratio, the leakage efficiency and cooperativity were found to be dependent on the vesicle surface charge density and on the peptide net charge. Roughly the threshold ratios increase with the peptide net charge and as the net charge increases the dose response curves become less cooperative. Circular dichroism spectra of the peptides in vesicles exhibit two negative dichroic bands at 222 and 208 nm characteristic of helical structure, while they were observed to be random coil in buffer. At peptide and lipid concentrations near the threshold ratio the CD spectra have the... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:14:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarceloAnselmoOseasda_M.pdf: 1369513 bytes, checksum: 35e33836144e52420b1164f512aa97e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Nesta dissertação foi estudado o comportamento de partição da albumina, proteína presente em elevada concentração no plasma sangüíneo e que interfere na determinação em diversas técnicas analíticas. No estudo efetuado foram avaliados diferentes sistemas aquosos de duas fases, explorando um fenômeno denominado ponto nuvem. Tais sistemas empregam surfactantes, sob condições experimentais específicas, obtendo-se a formação de duas fases imiscíveis: uma rica e outra pobre em tensoativo. Observou-se que devido às características hidrofílicas da albumina, bem como à dimensão dos agregados formados, sua extração para fase rica em tensoativo apresenta valores de coeficiente de partição que não ultrapassam 0,66 o que representa uma eficiência de extração de ca.40%. A extração da proteína apresentou-se viável mediante a utilização de uma mistura composta por um tensoativo não-iônico (Triton® X-114), que possibilita a separação de fases em temperatura biocompatível, na presença de outro tensoativo iônico (dodecil sulfato de sódio - SDS), que atua favorecendo as interações eletrostáticas entre os agregados e as moléculas protéicas, desde que se trabalhe em meio com pH abaixo de 5,0. Análises de dicroísmo circular complementaram o estudo e fornecerem evidências de que a aplicação do sistema baseado na mistura composta por Triton® X-114 e SDS causava desnaturação parcial da proteína, o que não inviabilizou sua aplicação para extração da mesma em uma amostra real. A eficiência deste sistema foi, então, avaliada para a remoção de albumina em plasma sangüíneo. Um coeficiente de partição de 1,1 foi obtido, indicando que ca.51% das proteínas encontravam-se na fase rica em tensoativo. As amostras submetidas ao procedimento de extração também foram avaliadas frente à técnica de eletroforese em gel, sendo que a fase pobre em sufactante apresentou um perfil eletroforético mais detalhado quando comparada a uma amostra que não foi submetida ao procedimento proposto. Já na fase rica em surfactante, foi observada a presença majoritária de albumina e, em menor concentração, outras proteínas de grande abundância no plasma tais como imunoglobulina G e transferrina. Por fim, o método apresentou desempenho semelhante ao de sistemas disponíveis comercialmente para remoção de albumina, tal como o sistema da Millipore®, apresentado neste trabalho / Abstract: In this work the partition behavior of albumin was studied, which is found at high concentrations in blood plasma, which interferes in many analytical techniques determinations. The present study evaluated different aqueous two-phase systems, exploiting a phenomenon called of cloud point. These systems employ surfactants under specific experimental conditions, enabling formation of two immiscible phases: one rich and another poor in surfactant. Due to the hydrophilic characteristcs of albumin, as well as its aggregate dimensions, its extration to the surfactant rich phase presented partition coefficients lower than 0.66, representing and extraction efficiency of ca. 40%. Protein extraction was feasible by applying a mixture comprised of a nonionic surfactant (Triton® X-114), which allowed the phase separation at biocompatible temperatures, and an ionic one (sodium dodecylsufate - SDS), wich promotes eletrostatic interactions between aggregates and protein molecules, since the extraction procedure is carried out at pH 5.0. Circular dichroism analysis complemented the study and it showed that a system based on a Triton® X-114 and SDS mixture causes partial protein denaturation, but its application for a real sample is feasible. The efficiency of this was evaluated for albumin removal from blood plasma. A partition coefficient of 1.1 was obtained, indicating that ca. 51% of proteins were contained in the surfactant rich phase. Albumin depleted samples were submitted to gel eletrophoresis and the surfactant poor phase presented a more detailed gel electrophoresis profile, when compared with a crude sample. The surfactant rich phase reveled that albumin is the predominant protein present, but it is possible to find other highly concentrated plasmatic proteins including immunoglobulin G and transferrin. Finally, the method presented similar performance when compared with commercially available systems for albumin removal, such as the Millipore® system, wich was also evaluated in this work / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Foram examinadas as propriedades conformacionais de um peptídeo (YRWPFGNHL-NH2) presente na primeira alça extra-celular do receptor AT1 do hormônio angiotensina II. Espectros de dicroísmo circular (CD) e fluorescência foram obtidos em solução aquosa (em função do pH e da temperatura), na presença de um solvente indutor de estrutura secundária (trifluoroetanol, TFE), e na presença de micelas carregadas negativamente (dodecil sulfato de sódio, SDS) ou zwitteriônicas (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propano sulfonato, HPS e lisofosfatidilcolina, liso-PC), e de bicamadas contendo um fosfolipídio zwitteriônico (1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina, POPC) ou uma mistura de POPC e um fosfolipídio carregado negativamente (ácido l-palmitoil-2-oleoil fosfatídico, POPA). O estudo por calorimetria de titulação permitiu analisar a termodinâmica da ligação. Espectros de CD indicaram uma estrutura flexível em solução aquosa, modulada pelo pH e pela temperatura. Na presença de TFE, de micelas, e de vesículas de POPC:POPA o peptídeo adquire estrutura secundária, sugerindo a presença de uma dobra beta. Espectros de fluorescência intrínseca (W3) mostraram um deslocamento do comprimento de onda máximo de emissão (λmax) para o azul na presença de micelas e de vesículas de POPC:POPA. Observou-se também um aumento da intensidade de fluorescência, exceto no caso de SDS. Esses resultados indicaram que o peptídeo interagiu com os agregados. Não se observou alteração da fluorescência na presença de POPC. Medidas de anisotropia de fluorescência mostraram que, quando ligado, o peptídeo toma-se mais imobilizado. Estudos de supressão de fluorescência empregando agentes supressores aquossolúveis e de membrana sugeriram que o W3 localiza-se próximo à interface bicamada-água. Os resultados mostraram que o peptídeo se liga a micelas zwitteriônicas e negativas, enquanto que, no caso de bicamadas (mais empacotadas), a ligação depende da presença de cargas negativas. Experimentos de calorimetria mostraram que o ΔH de ligação do peptídeo a vesículas é negativo, compatível com a ocorrência de interações eletrostáticas. Foram observadas diferenças qualitativas e quantitativas na ligação do peptídeo às micelas de HPS e liso-PC. A fim de examinar se essas diferenças eram devidas ao empacotamento molecular, foram obtidos espectros de ressonância paramagnética eletrônica de marcadores de spin intercalados nos dois sistemas. Diferenças foram observadas principalmente na região da cabeça polar, as quais poderiam ser responsáveis pela diferença de comportamento do peptídeo em ambos os agregados. Os resultados obtidos para a primeira alça extra-celular do receptor AT1 indicam que a sua conformação pode ser modulada pelo pH e pela polaridade do ambiente, que ela pode interagir com a membrana através de interações hidrofóbicas e eletrostáticas, e ainda que essa interação depende do grau de empacotamento da fase lipídica. Esses resultados estão de acordo com a visão de que domínios extra-membranares de GPCRs situam-se na interface membrana-água. As alterações conformacionais induzidas pelo meio, bem como pela interação entre domínios extra-membranares de GPCRs e a fase lipídica ou pela ligação do agonista, poderiam ter um papel no mecanismo molecular de transdução de sinal. / In this work the conformational properties of a peptide (YRWPFGNHL-NH2) whose sequence is present in the first extra-cellular loop of the angiotensin II AT1 receptor were examined. Circular dichroism (CD) and fluorescence spectra were obtained in aqueous solution (as a function of pH and temperature), in the presence of a secondary structure inducing solvent (trifluoroethanol, TFE), and in the presence of negatively charged (sodium dodecyl sulfate, SDS) or zwitterionic (N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate, HPS and lysophosphatidylcholine, liso-PC) micelles, and of bilayers containing a zwitterionic phospholipid (l-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine, POPC) or a mixture of POPC and a negatively charged phospholipid (l-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid, POPA). Studies of titration calorimetry allowed the analysis of the binding thermodynamics. CD spectra indicated a flexible structure in aqueous solution, which was modulated by pH and temperature. In the presence of TFE, micelles and of POPC:POPA vesicles, the peptide acquired secondary structure, which is suggestive of a β turn. The intrinsic fluorescence spectra (W3) showed a blue-shift of the maximum emission wavelenght (λmax) in the presence of micelles and of POPC:POPA vesicles. An increase in fluorescence intensity was also observed, except in the case of SDS. These results indicated that the peptide interacted with the aggregates. No fluorescence changes were observed in the presence of POPC. Fluorescence anisotropy measurements showed that, when bound to the aggregates, the peptide becomes more immobilized. Fluorescence quenching studies using water soluble and membrane-bound quenchers suggested that W3 is located close to the water-bilayer interface. The results showed that the peptide binds to negativelly charged and zwitterionic micelles, while in the case of bilayers (which are more tightly packed) the binding depends on the presence of negative charges. Titration calorimetry showed that ΔH of peptide binding to the vesicles is negative, which is compatible with the ocurrence of eletrostatic interactions. Qualitative and quantitative differences in binding of the peptide to HPS and liso-PC micelles were observed. In order to examine whether these differences were due to molecular packing, electron paramagnetic resonance spectra of spin labels intercalated in both systems were obtained. Differences were observed, mainly in the polar head group region, that could be responsible for the different behaviour displayed by the peptide in both aggregates. The results obtained for the first extra-cellular loop of the AT1 receptor indicated that its conformation can be modulated by pH and by the polarity of the medium, and that it can interact with the membrane through hydrophobic and electrostatic interactions, and also that this interaction depends on the molecular packing of the lipid phase. These results are in aggrement with the idea that the GPCRs extra-membrane domains are located at the water-membrane interface. Conformational changes induced by the medium, as well as by the interaction between extra-cellular segments and the membrane or by ligand binding, could play a role in the molecular mechanism of signal transduction.

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as \"amarelinho\". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.

Neste trabalho, descrevemos um espectrômetro ótico para medidas de Dicroismo Circular Magnético (DCM), utilizado nas seguintes experiências: 1) Medidas de tempo de relaxação spin-rede (T1) para centros F em NaCl, NaBr, CsBr e CsCl, a temperatura de 1,8&#176K em campos magnéticos até 17000Gs. Verificamos a validade da teoria da referência (8) para explicar as diferenças observadas, no comportamento de \'T IND.1\', para halogenetos com diferentes íons alcalinos, bem como diferentes estruturas. Comprovamos que a interação hiperfina ainda continua a ser o mecanismo mais importante para esses centros. Verificamos também que, para temperaturas entre 6&#176K e l5&#176K, os valores de experimentais para T1, em KBr, concordam razoavelmente com a teoria da referência (21). Esta terapia é uma extensão daquela da referência (8). 2) Espectros de DCM para KCl: Co++ e CaF2: Co++ foram obtidos para campos magnéticos ate 56KGs e temperaturas entre 1,8&#176K e 4,2 &#176K. Os resultados obtidos mostraram ser concordantes com a hipótese dos centros Co++ ocuparem sítios intersticiais na rede de KCl. / In this work we describe a Magnetic Circular Dicroism Spectrometer wich was used in the following experiments: 1) We measured the spin-lattice relaxation time (T1) for F centers in NaCl, NaBr, CsBr and CsCl, at 1,8&#176K in magnetic fields up to 15000Gs. We verified the suitability of the theory of ref.(O8) to explain the differences observed for halides of differents alkali ions as well as for different structures. This proves that the hyperfine interaction is the most important mechanism for this kind of centers. We also verified that, for temperatures between 6&#176K and l5&#176K, T1, the T1 experimental values fits the theory of ref.(21) reasonably well ,for F centers in KBr. This theory is an extension of that of ref.(8). 2) We obtained the MCD spectra for KCl: Co++ and CaF2: Co++ in different magnetic fields up to 56KGs, and in temperature range between 1,8 &#176K and 4,2&#176K. Our results are consistent with the assumption that Co++ centers are intersticial in KCl lattice.