A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.

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No. of bitstreams: 1 TeseCAS.pdf: 3874357 bytes, checksum: 0bd0fdf47146d9a5d45f62a5203ac011 (MD5) Previous issue date: 2016-11-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The present work had as general objective to perform the genomic annotation of Expressed Sequences (ESTs) of Litopenaeus vannamei shrimp, available in the database of Project ShEST and to evaluate the polymorphism of mined SSR and SNP tags. These markers were located in the main chain of protein genes with function related to performance traits and were validated in SPF (Specific Pathogen Free) shrimp families submitted to selection for rapid growth and survival. In addition to the EST-SSR and EST-SNP loci, obtained by Sanger sequencing, Next Generation Sequencing (NGS) analyzes were included in the initial proposal of work with the objective of expanding the set of SNPs available and verifying the differential gene expression. The new assembly of ESTs was performed and produced a set of 2.984 unigenes with protein products for 41% of them, with 1.983 SSRs and 3.472 SNPs being identified. Among the loci with gene product identified, 231 were enzymes with 127 unique EC numbers inserted in 94 KEGG metabolic pathways. Loci validation showed that the loci of the 60S ribosomal (SSR-EST) and crustacyanin (SNP-EST) proteins were polymorphic in the animals sampled from Genearch. Statistical analyzes were conducted to verify the existence of a possible association between the genotypes and the analyzed weight phenotypes, although no association was observed. In addition, cross-species amplification tests were performed on seven species of marine and two freshwater prawns, demonstrating successful transferability for these species. The RNAseq approach was included in the present work with the purpose of increasing the number of SNPs detected in candidate genes with performance-related function and identifying differentially expressed (DE) genes in animals under experimental conditions. A second transcriptome was assembled from the muscle and hepatopancreas tissues of L. vannamei individuals (i) evaluated for rapid growth and survival and (ii) exposed to the White Spot Syndrome Virus (WSSV). A total of 63.105 transcripts were generated, with an average size of 2.511 bp and N50 of 3.464 bp. More than 15.500 SNPs were identified (frequency > 50%). Functional annotation was also performed on the bases of SwissProt, Gene Ontology (GO) and KEGG. Differential gene expression analyzes were performed on the animal samples evaluated for growth and response to WSSV infection. The data generated showed differences in the expression profile between the genes of (i) high and low growth animals, (ii) the hepatopancreas and muscle and (iii) the uninfected (healthy) and infected (ill) animals by WSSV, considering the effect of the tissue. Two-hundred and seven DE genes were identified for growth, 5.816 for hepatopancreas and muscle and 1.017 for ill and healthy animals. / O presente trabalho teve como objetivo geral realizar a anotação genômica de sequências expressas (ESTs) de Litopenaeus vannamei, disponíveis no banco de dados do Projeto ShEST e avaliar o polimorfismo de marcas SSR e SNP mineradas. Esses marcadores estavam localizados na cadeia principal de genes de proteínas com função relacionada a traços de desempenho e foram validados em famílias de camarões SPF (Specific Pathogen Free) submetidas à seleção para rápido crescimento e sobrevivência. Adicionalmente aos locos SSR-EST e SNP-EST, obtidos por sequenciamento Sanger, análises de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) foram incluídas na proposta inicial de trabalho com o objetivo de ampliar o conjunto de SNPs disponíveis e verificar a expressão gênica diferencial. A montagem de novo das ESTs foi realizada e produziu um conjunto de 2.984 unigenes com produtos proteicos para 41% destes, sendo identificados 1.983 SSRs e 3.472 SNPs. Dentre os locos com produto gênico identificado, 231 eram enzimas com 127 EC numbers únicos inseridos em 94 vias metabólicas do KEGG. A validação dos locos SSR-EST e SNP-EST mostrou que os locos das proteínas 60S ribossomal (SSR-EST) e crustacianina (SNP-EST) apresentaram-se polimórficos nos animais amostrados da Genearch. Análises estatísticas foram conduzidas para verificação da existência de uma possível associação entre os genótipos e os fenótipos de peso analisados, embora não tenha sido observada associação. Além disso, testes de amplificação heteróloga foram realizados em sete espécies de camarões marinhos e duas de água doce, demonstrando sucesso na transferabilidade para estas espécies. A abordagem de RNA-seq foi incluída no presente trabalho com o propósito de ampliar o número de SNPs detectados em genes candidatos com função relacionada a traços de desempenho e identificar genes diferentemente expressos (DE) em animais sob condições experimentais. Foi realizada a montagem de novo de um segundo transcriptoma, dos tecidos músculo e hepatopâncreas de indivíduos de L. vannamei (i) avaliados para rápido crescimento e sobrevivência e (ii) expostos ao vírus da Síndrome da Mancha Branca ou White Spot Syndrome Virus (WSSV). Foram gerados 63.105 transcritos, com tamanho médio de 2.511 pb e N50 de 3.464 pb. Foram identificados mais de 15.500 SNPs (frequência > 50%). Também foi realizada a anotação funcional nas bases do SwissProt, Gene Ontology (GO) e KEGG. Análises de expressão diferencial gênica foram realizadas nas amostras dos animais avaliados para crescimento e resposta a infecção pelo WSSV. Os dados gerados demonstraram diferenças no perfil de expressão entre os genes (i) de animais de alto e baixo crescimento, (ii) do hepatopâncreas e músculo e (iii) dos animais não-infectados (saudáveis) e infectados (doentes) pelo WSSV, considerando-se o efeito do tecido. Foram identificados 207 genes DE para crescimento, 5.816 para a comparação entre os tecidos e 1.017 para os animais doentes e saudáveis. / FAPESP: 2012/13069- 6 / FAPESP: 2012/17322-8

A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.

Les effets des transferts radiatifs sur les écoulements de convection naturelle sont étudiés en régimes transitionnel et turbulent. On considère des mélanges air/H2O/CO2 confinés dans des cavités cubiques différentiellement chauffées. Des simulations numériques de référence sont entreprises jusqu'à Ra=3x108 en couplant une méthode spectrale de collocation pour l'écoulement et une méthode de lancer de rayons, associée à un modèle ADF, pour le rayonnement. Pour l'étude du régime turbulent, une modélisation des transferts radiatifs basée sur un filtrage spatial est proposée : les contributions filtrées sont résolues par la méthode de lancer de rayons sur un maillage lâche et les contributions de sous-maille sont résolues de manière analytique dans l'espace de Fourier. Ce modèle est combiné à la simulation numérique directe de l'écoulement à Ra=3x109. Les transferts radiatifs ont pour effet de diminuer la stratification thermique verticale et d’augmenter la circulation générale. Lorsque les six parois de la cavité sont noires et le gaz transparent, deux zones de stratification thermique instable apparaissent en amont des couches limites verticales. Dès Ra=5x106, une instabilité de type Rayleigh-Bénard se développe dans ces zones, induisant des écoulements instationnaires. Lorsque les parois adiabatiques sont parfaitement réfléchissantes, les parois isothermes noires et le gaz rayonnant, des écoulements instationnaires chaotiques sont obtenus à partir de Ra=3x107. Des rouleaux contra-rotatifs à la sortie des couches limites verticales sont observés, ce qui suggère qu'une instabilité de force centrifuge soit responsable de la transition. / Radiative transfer effects on natural convection flows are investigated in transitional and turbulent regimes. Air/H2O/CO2 mixtures contained in cubical differentially heated cavities are considered. Benchmark numerical simulations are carried out up to Ra=3x108 by coupling a spectral collocation method for the flow and a ray tracing method, associated with an ADF model, for radiation. In order to study the turbulent regime, a radiative transfer model based on spatial filtering is proposed: filtered contributions are solved with the ray tracing method on a coarse grid and sub-grid contributions are obtained analytically in Fourier space. This model is combined with the direct numerical simulation of the flow at Ra=3x109. The effects of radiative transfer are a decrease of the vertical thermal stratification and an increase of the flow driven in the cavity. When the six cavity walls are black and the gas is transparent, two unstably stratified zones appear upstream the vertical boundary layers. From Ra=5x106, a Rayleigh-Bénard type instability in these zones triggers the unsteadiness. When the adiabatic walls are perfectly reflecting, the isothermal walls are black and the gas is participating, unsteady chaotic flows are obtained in this case from Ra=3x107. Counter rotating rolls at the exit of the vertical boundary layers are observed, which suggests that transition to unsteadiness is due to centrifugal forces.

A cromodomínio-helicase (CHD) e a SET/TAF-Iβ (chaperona de histonas) são proteínas conhecidas por estarem envolvidas em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica. Em organismos como Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, camundongo e o homem, estas proteínas estão associadas ao controle de vários processos de desenvolvimento. Em Mesocestoides corti, um modelo de parasito cestódeo, sequências relacionadas à CHD e à SET/TAF-Iβ foram identificadas em uma seleção de genes diferencialmente expressos em larvas e vermes estrobilizados. Visando à identificação de marcadores moleculares de processos e estágios de desenvolvimento da Classe Cestoda, os padrões de expressão de ortólogos das proteínas CHD e SET/TAF-Iβ (McCHD e McSET/TAF) em M. corti foram investigados. Inicialmente as sequências codificadoras da McCHD e McSET/TAF foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli para produção de proteínas recombinantes. Análises por imunoblot e imuno-histoquímica foram realizadas utilizando anticorpos gerados contra versões recombinantes das proteínas-alvo do estudo. Foram analisados quatro estágios de desenvolvimento de M. corti: larvas (tetratirídeos, TT), TT após 24h de indução ao processo de estrobilização (o qual confere o desenvolvimento da larva em adulto) (24h-Ind), TT após 72h de indução (72h-PI) e vermes estrobilizados (VE). Em imunoblots, a McCHD apresentou altos níveis de expressão em três estágios de desenvolvimento de M. corti: TT, 72h-PI e VE, sendo detectado um menor nível de expressão no estágio 24h-Ind quando comparado aos demais. Já a McSET/TAF apresentou um aumento gradual no seu nível de expressão após a indução (nos estágios de 24h-Ind, 72h-PI e VE), não sendo detectada em TT. Em secções longitudinais foram observados um maior nível de expressão da McCHD em estágios iniciais de desenvolvimento (TT e 24- Ind) enquanto que McSET/TAF foi observado um maior nível de expressão nos estágios intermediários e no final do desenvolvimento de M. corti. Para ambas as proteínas a localização foi citoplasmática e não houve diferenças de distribuição nos tecidos analisados. Para compreender melhor as diferenças encontradas nos níveis de expressão das proteínas, análises por PCR em tempo real (RT-qPCR) foram realizadas para quantificação dos níveis de transcritos dos genes McCHD e McSET/TAF. Foram encontradas diferenças significativas nos níveis de expressão gênica de McCHD e McSET/TAF somente em dois estágios: o inicial (TT) e o adulto (VE), conforme análises pelo teste de Duncan. Níveis maiores de expressão gênica de ambos os genes foram encontrados no último estágio de desenvolvimento (VE) de M. corti. A caracterização de genes e proteínas envolvidas no processo de estrobilização de platelmintos da classe Cestoda contribuirá para o melhor entendimento de rotas do desenvolvimento de cestódeos, podendo auxiliar também na determinação de novos alvos terapêuticos para o tratamento de cestodíases. / Chromodomain-helicase (CHD) and the SET/TAF-Iβ histone chaperone are proteins known to be implicated in processes of chromatin remodeling and regulation of gene expression associated with the control of developmental processes in different organisms, such as Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, mouse and human. In Mesocestoides corti, a model cestode parasite, CHD and SET/TAF-Iβ related sequences were isolated in a screening for genes differentially expressed in larvae (tetrathyridia) and adult worms. Aiming at identifying molecular markers of processes and stages of development of Class Cestoda, the expression patterns of M. corti CHD and SET/TAF-Iβ orthologous proteins (McCHD and McSET/TAF) were investigated. Initially, the coding sequences of McCHD and McSET/TAF were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production. Analysis by immunoblotting and immunohistochemistry was performed using antibodies raised against recombinant versions of the proteins target the study. We analyzed four developmental stages of M. corti: bona fide tetrathyridia (TT), tetrathyridia 24 h after strobilation induction (24h-Ind), strobilating worms 72 h after induction (72h-PI), and fully strobilated worms (VE). Immunoblots showed high levels of expression McCHD in three developmental stages of M. corti: TT, 72h-PI e VE, and detected a lower level of expression in stage 24-Ind in comparison to others. The McSET/TAF showed a gradual increase in their level of expression after induction (stages of 24h-Ind, 72h- PI e VE) was not detected in TT. In longitudinal sections were observed an increased level of expression of McCHD in early stages of development (TT and 24-Ind) while McSET/TAF there was a higher level of expression in the intermediate and late stages of development of M. corti. Both McCHD and McSET/TAF showed a cytoplasmic location and a uniform pattern of immunostaining, no differences in distribution between the tissues. For a better understanding the differences in levels of protein expression, analysis by real-time PCR (RT-qPCR) was performed to quantify the transcript levels of genes McCHD and McSET/TAF. There were significant differences in levels of gene expression McCHD and McSET/TAF only in two stages: the initial (TT) and adult (VE), as analysis by Duncan test. Higher levels of gene expression of both genes were found in the last stage of development (VE) of M. corti. The characterization of genes and proteins involved in the process of strobilation flatworms of the class Cestoda contribute to a better understanding of the development of cestodes routes and may also assist in the determination of new therapeutic targets for the treatment of cestodiasis.

A diferenciação morfofisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida durante o desenvolvimento larval, que estimula o aumento da produção de Hormônio Juvenil naslarvas que originarão rainhas. Dentre as diversas diferenças morfológicas entre operárias e rainhas encontramse estruturas especializadas para a coleta de pólen e própolis, localizadas na região da tíbia e do basitarso das pernas posteriores de operárias. A diferenciação das pernas tem início entre o quarto e o quinto estágio do desenvolvimento larval. Utilizandose Microscopia Eletrônica de Varredura o presente trabalho relata a presença das cerdas formando as estruturas castaespecíficas na fase de pupa de olho marrom. A partir de estudos de hibridação de microarrays de cDNA com amostras de RNA de A. mellifera de diversas fases do desenvolvimento larval, foram encontrados 91 genes com ortólogos conhecidos em Drosophila, diferencialmente expressos entre rainhas e operárias no período crítico da diferenciação de castas. Destes, cinco estão relacionados com o desenvolvimento de apêndices: ataxin2 (atx2), cryptocephal (crc), dachshund (dac), grunge (gug) e Retinoic and fat acid Binding Protein (RfaBP). O perfil destes genes, e ainda, ultrabithorax (ubx), distalless(dll) e abdominalA (abdA) (estes porsuassuasfunções durante a diferenciação das pernas de insetos) foram analisados por RTPCR em Tempo Real em pernas posteriores de operárias e rainhas desde o quarto estágio larval até o estágio de pupa de olho branco. Apenas ubx e abdA foram encontrados mais expressos em operárias ao final do desenvolvimento larval e início do desenvolvimento pupal. Estudossimilares dos genes abdA, dac, dll e ubx nossegmentos das pernas de pupas de olho branco indicam a tíbia como domínio de expressão de dac. Imunolocalizações utilizando um anticorpo contra um epitopo conservado entre Ubx e AbdA, FP6.87, em pernas posteriores de prépupas de operárias e rainhasrevelam a presença destas proteínas na tíbia apenas de operárias e diferencialmente localizadas no basitarso de operárias e rainhas. Os dados acima apresentados apontam Ubx, um gene Hox, como pontochave na regulação da formação das estruturas castaespecíficas. / Diphenism in the honey bee, Apis mellifera,resultsfromdifferential feeding of female larvae. Among the morphological differences, the hind legs of workers have structures that is used for carrying pollen and propolis, e.g. the corbicula, while the queens hind legslack thisstructures. The corbicula is an expanded region of the tibia deprived of bristles, which has a single bristle in the middle that seems to have a sensorial function. Using scanning electronic microscopy, we found that the leg structures and bristles of the corbicula are already formed in browneyed pupa. Microarray analysis has demonstrated that five of 240 differentiallyexpressed genesin developing castes are potentially related to the caste differences in leg development (ataxin2, cryptocephal, dachshund, grunge and Retinoic and fat acid Binding Protein). Using qPCR, we analyzed the expression of abdominalA, ataxin2, cryptocephal, grunge, Retinoic and fat acid Binding Protein and ultrabithorax genes during hind leg development. cryptocephal, ataxin2, grunge and Retinoic and fat acid Binding Protein genes, which are involved in imaginal disc elongation and bristle formation and are inhibited by juvenile hormone, were not found to be differentially expressed. However, ultrabithorax and abdominalA are over expressed in workersin the early pupalstage. By using immunohistochemistry, Ubx was localized in the tibia and basitarsus of prepupae of workers and in the basitarsus of pre pupae of queens. The pattern of Ubx expression suggests that this Hox gene is a key player in leg structuresformation and caste differentiation in A.mellifera.

In this thesis the effect of normalization methods on the identification of differentially expressed genes is investigated. A zebrafish microarray dataset called Swirl was used in this thesis work. First the Swirl dataset was extracted and visualized to view if the robust spline and print tip loess normalization methods are appropriate to normalize this dataset. The dataset was then normalized with the two normalization methods and the differentially expressed genes were identified with the LimmaGUI program. The results were then evaluated by investigating which genes overlap after applying different normalization methods and which ones are identified uniquely after applying the different methods. The results showed that after the normalization methods were applied the differentially expressed genes that were identified by the LimmaGUI program did differ to some extent but the difference was not considered to be major. Thus the main conclusion is that the choice of normalization method does not have a major effect on the resulting list of differentially expressed genes.

Microarray platforms have been around for many years and while there is a rise of new technologies in laboratories, microarrays are still prevalent. When it comes to the analysis of microarray data to identify differentially expressed (DE) genes, many methods have been proposed and modified for improvement. However, the most popular methods such as Significance Analysis of Microarrays (SAM), samroc, fold change, and rank product are far from perfect. When it comes down to choosing which method is most powerful, it comes down to the characteristics of the sample and distribution of the gene expressions. The most practiced method is usually SAM or samroc but when the data tends to be skewed, the power of these methods decrease. With the concept that the median becomes a better measure of central tendency than the mean when the data is skewed, the tests statistics of the SAM and fold change methods are modified in this thesis. This study shows that the median modified fold change method improves the power for many cases when identifying DE genes if the data follows a lognormal distribution.

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