A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.

A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), ΔH,ΔG,ΔS e ΔCp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( ΔG) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de ΔCp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de ΔHITC com ΔHvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), ΔH, ΔG, ΔS and ΔCp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (ΔG) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The ΔCp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its ΔHITC relationship with ΔHvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.

<p align=\"justify\">A necessidade urgente de descoberta de terapias mais seguras e eficazes para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses tem motivado a pesquisa por novos inibidores das enzimas cruzaína e CPB, as principais cisteíno proteases do T. cruzie e Leishmania spp., respectivamente. Uma série de 52 compostos nitrílicos que atuam como inibidores covalente-reversíveis de cisteíno proteases foi sintetizada no grupo NEQUIMED/IQSC/USP e avaliada quanto a sua atividade inibitória contra as enzimas cruzaína, CPB de Leishmania mexicana e catepsina L de humanos. Utilizando planejamento molecular baseado em hipótese, mapeamos as relações estrutura-atividade (SARs) desses inibidores através de variações nas posições P1, P2, P3 e P1\' do esqueleto dipeptidil nitrílico. A substituição do grupo eletrofílico (warhead) aminonitrila em P1 pelo grupo azanitrila melhorou a afinidade em duas ordens de magnitude para todos os alvos avaliados. Um dos mais potentes inibidores, o análogo azanitrila Neq0690 mostrou uma cinética de ligação lenta com valores de pKi de 8,8, 9,3 e 9,7 para cruzaína, catepsina L e LmCPB, respectivamente. A substituição bioisostérica da ligação amida entre as posições P2-P3 pelo grupo trifluoroetilamina resultou na síntese do Neq0659, um potente inibidor com um perfil de ação seletivo para as proteases de parasitos. A substituição do grupo metileno em P1 pelo ciclopropano aumentou a afinidade para todas as enzimas. Contudo, uma inibição seletiva da cruzaína e LmCPB foi associada à presença do grupo (R)-benzila como substituinte da posição P1 dos derivados CF3 substituídos. Embora os compostos substituídos com leucina, tirosina, triptofano e 3-cloro fenilalanina como substituintes da posição P2 foram relativamente bem tolerados pela cruzaína e catepsina L, uma restrita especificidade foi verificada para LmCPB com pequenos ganhos de afinidade para os inibidores que possuíam os grupos leucina e metil benzoato como substituintes dessa posição. Com relação à posição P3, a inserção do grupo 3-terc-butilpirazol e 3-bromo piridina aumentou a afinidade para todos os alvos avaliados enquanto que um ganho seletivo para a LmCPB foi observado para os compostos que possuíam o grupo bifenila nessa posição. Além disso, duas novas estruturas cristalográficas da LmCPB complexada com o Neq0690 e metil metanotiossulfonato (MMTS) foram determinadas com resoluções de 1,3 Å e 1,5 Å, respectivamente. As estruturas dos co-complexos revelaram os modos de interação (MoB) desses ligantes, bem como as principais características do processo de reconhecimento bimolecular. Isso permitirá o uso de estratégias de planejamento baseado na estrutura do alvo com translação natural para a pesquisa por novos inibidores de cisteíno proteases, com amplo espectro de ação na quimioterapia de doenças a elas relacionadas. / <p align=\"justify\">The urgent need for the discovery of safer and more effective therapies for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis has motivated the search for new inhibitors of the enzymes cruzain and CPB, the major T. cruzi and Leishmania spp. cysteine proteases, respectively. A series of 52 nitrile-containing compounds acting as covalent-reversible inhibitors of cysteine proteases was synthesized at the NEQUIMED/IQSC/USP Medicinal Chemistry Group and evaluated for their inhibitory activity against the enzymes cruzain, Leishmania mexicana CPB and cathepsin L from humans. Using hypothesis-driven molecular design, we mapped the structure-activity relationships (SARs) of these inhibitors through variations in the P1, P2, P3 and P1\' positions of the dipeptidyl nitrile scaffold. The substitution of the aminonitrile by the azanitrile group improved the affinity by two orders of magnitude for all the evaluated targets. One of the most potent inhibitors, the azanitrile analogue dubbed Neq0690 showed a slow-binding kinetics with pKi values of 8.8, 9.3 and 9.7 for cruzain, cathepsin L and LmCPB, respectively. Bioisosteric substitution of the amide moiety between the P2-P3 positions by the trifluoroethylamine group resulted in the synthesis of Neq0659, a potent inhibitor with a selective action profile for parasite proteases. Substitution of the methylene group at P1 by cyclopropane increased the affinity for all enzymes. However, selective inhibition of cruzain and LmCPB was associated with the presence of the (R)-benzyl group as substituent of the P1 position of the substituted CF3 derivatives. Although leucine, tyrosine, tryptophan and 3-chloro phenylalanine substituted compounds as substituents of the P2 position were relatively well tolerated by cruzain and cathepsin L, a restricted specificity was verified for LmCPB with small affinity gains for the inhibitors possessing the leucine and methyl benzoate as substituents of that position. Regarding the P3 position, the insertion of the 3-tert-butylpyrazole and 3-bromo pyridine groups increased the affinity for all evaluated targets whereas a selective gain for LmCPB was observed for the compounds having the biphenyl moiety at that position. In addition, it is noteworthy that two new crystallographic structures of LmCPB complexed with Neq0690 and methyl methanethiosulfonate (MMTS) were determined with resolutions of 1.3 Å and 1.5 Å, respectively. The structures of the co-complexes revealed the modes of binding (MoB) of these ligands, as well as the main characteristics of the bimolecular recognition process. This will allow the natural translational target structure strategies for the search for new inhibitors of cysteine proteases with broad spectrum of action in the chemotherapy of related diseases.

Introdução/Objetivo: Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a atividade e/ou expressão da dipeptidil peptidase IV (DPPIV), uma enzima que inativa peptídeos com ações cardioreno protetoras, como o peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídeo natriurético cerebral (BNP), estaria associada a um pior prognóstico na insuficiência cardíaca (HF). Métodos: Injúria do miocárdio foi realizada através da ablação do ventrículo esquerdo (VE) por radiofrequência em ratos Wistar machos (200-250 g). Os ratos foram divididos em três grupos: Sham, HF e HF + inibidor de DPPIV (sitagliptina 200mg/kg/b.i.d). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas durante 3 dias para avaliação da função renal. Atividade e expressão da DPPIV no plasma e coração foram medidas por espectrofotometria e por immunoblotting, respectivamente. Para a avaliação da função cardíaca um cateter de pressão-volume foi posicionado dentro da cavidade do VE. A análise histológica foi realizada para os parâmetros morfométricos. A atividade da DPPIV no plasma também foi medida em pacientes com HF (n = 190). Resultados: A atividade DPPIV e sua abundância estavam aumentadas em animais com HF em comparação com Sham. Além disso, a atividade de DPPIV no plasma se correlacionou positivamente com o volume diastólico final (R = 0,517; p < 0,001) e o peso do pulmão/peso corporal (R = 0,492; p < 0,01). Uma correlação negativa entre a atividade DPPIV plasmática e a fração de ejeção também foi observada (R = 0,602; p < 0,001). Curiosamente, os animais HF também exibiram um aumento da expressão/atividade de DPPIV no tecido cardíaco, especialmente em células endoteliais. Seis semanas de tratamento com o inibidor de DPPIV sitagliptina atenuou a disfunção cardíaca, fibrose intersticial, congestão pulmonar e infiltração de macrófagos. O tratamento com sitagliptina também elevou os níveis plasmáticos de GLP-1 ativo, e aumentou a ativação de vias de sinalização cardioprotetoras como PKA e Akt; e reduziu os níveis de apoptose e marcadores pró-inflamatórios em comparação com ratos não tratados. Ratos com HF apresentaram maiores níveis circulantes de BNP, contudo a atividade da PKG renal foi mais baixa nesses animais em comparação com o grupo tratado com sitagliptina, sugerindo uma diminuição da razão BNP ativo/total. A função renal não diferiu entre os grupos, mas o ritmo de filtração glomerular estava ligeiramente aumentado no grupo tratado em comparação com os animais HF. Pacientes com HF apresentaram uma maior atividade plasmática da DPPIV e correlações foram encontradas com a com a fração de ejeção (R = -0,20; p = 0,009) e a quimiocina Ccl2 (R² =0,30; p < 0.01). Conclusões: Em conjunto, nossos resultados demonstram que a atividade plasmática da DPPIV se correlaciona com um pior prognóstico em pacientes e animais com HF e que a DPPIV possui um papel importante na fisiopatologia desta doença / Aim: The present study aimed to test the hypothesis that the activity and/or expression of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), an enzyme that inactivates cardiorenal protective peptides including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and brain natriuretic peptide (BNP), would be associated with poorer outcomes in heart failure (HF). Methods: Experimental HF was induced in male Wistar rats (200-250 g) by left ventricular (LV) myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Rats were divided in three groups: Sham, HF and HF+DPPIV inhibitor (sitagliptin 200mg/kg/b.i.d). Six weeks after surgery, animals were individually housed in metabolic cages during 3 days for assessment of renal function. Plasma and heart DPPIV activity/expression were measured spectrophotometrically and by immunoblotting respectively. For evaluation of cardiac function a pressure-volume catheter was positioned into the LV cavity. Histological analysis was performed for morphometric parameters. Plasma DPPIV activity was also measured in patients (n = 190) with heart failure. Results: Plasma DPPIV activity and abundance were increased in animals with HF compared to Sham. Additionally, plasma DPPIV activity positively correlated with ventricular end diastolic volume (R² =0.517; p < 0.001) and lung/body weight (R² =0.492; p < 0.01). A negative correlation between plasma DPPIV activity and ejection fraction was also observed (R² =0.602; p < 0.001). Interestingly, HF animals also exhibited an increase of expression and activity of DPPIV in heart tissue, especially in endothelial cells. Six-week treatment with the DPPIV inhibitor sitagliptin attenuated cardiac dysfunction, mitigated cardiac hypertrophy, interstitial fibrosis, lung congestion and macrophage infiltration. Sitagliptin also raised the plasma levels of active GLP-1, increased activation of cardioprotective signaling pathways including PKA, and Akt; and reduced the levels of apoptosis and pro-inflammatory biomarkers compared to non-treated HF rats. Despite the higher circulating total BNP, renal PKG activity was lower in HF rats compared with sham and sitagliptin-treated rats, suggesting a decrease in active/total BNP ratio. Renal function did not differ between groups, but glomerular filtration rate was modestly, but significantly increased by Sitagliptin compared to HF. Plasma DPPIV activity in patients was also increased compared to healthy subjects and correlations was found with ejection fraction (R² =-0.20; p=0.009) and the chemokine Ccl2 (R² =0.30; p < 0.01). Conclusions: Taken together, our results demonstrate that circulating DPPIV activity correlates with poorer cardiovascular outcomes in human and experimental HF and might play an important role in the pathophysiology of HF.

Introdução/Objetivo: Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a atividade e/ou expressão da dipeptidil peptidase IV (DPPIV), uma enzima que inativa peptídeos com ações cardioreno protetoras, como o peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídeo natriurético cerebral (BNP), estaria associada a um pior prognóstico na insuficiência cardíaca (HF). Métodos: Injúria do miocárdio foi realizada através da ablação do ventrículo esquerdo (VE) por radiofrequência em ratos Wistar machos (200-250 g). Os ratos foram divididos em três grupos: Sham, HF e HF + inibidor de DPPIV (sitagliptina 200mg/kg/b.i.d). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas durante 3 dias para avaliação da função renal. Atividade e expressão da DPPIV no plasma e coração foram medidas por espectrofotometria e por immunoblotting, respectivamente. Para a avaliação da função cardíaca um cateter de pressão-volume foi posicionado dentro da cavidade do VE. A análise histológica foi realizada para os parâmetros morfométricos. A atividade da DPPIV no plasma também foi medida em pacientes com HF (n = 190). Resultados: A atividade DPPIV e sua abundância estavam aumentadas em animais com HF em comparação com Sham. Além disso, a atividade de DPPIV no plasma se correlacionou positivamente com o volume diastólico final (R = 0,517; p < 0,001) e o peso do pulmão/peso corporal (R = 0,492; p < 0,01). Uma correlação negativa entre a atividade DPPIV plasmática e a fração de ejeção também foi observada (R = 0,602; p < 0,001). Curiosamente, os animais HF também exibiram um aumento da expressão/atividade de DPPIV no tecido cardíaco, especialmente em células endoteliais. Seis semanas de tratamento com o inibidor de DPPIV sitagliptina atenuou a disfunção cardíaca, fibrose intersticial, congestão pulmonar e infiltração de macrófagos. O tratamento com sitagliptina também elevou os níveis plasmáticos de GLP-1 ativo, e aumentou a ativação de vias de sinalização cardioprotetoras como PKA e Akt; e reduziu os níveis de apoptose e marcadores pró-inflamatórios em comparação com ratos não tratados. Ratos com HF apresentaram maiores níveis circulantes de BNP, contudo a atividade da PKG renal foi mais baixa nesses animais em comparação com o grupo tratado com sitagliptina, sugerindo uma diminuição da razão BNP ativo/total. A função renal não diferiu entre os grupos, mas o ritmo de filtração glomerular estava ligeiramente aumentado no grupo tratado em comparação com os animais HF. Pacientes com HF apresentaram uma maior atividade plasmática da DPPIV e correlações foram encontradas com a com a fração de ejeção (R = -0,20; p = 0,009) e a quimiocina Ccl2 (R² =0,30; p < 0.01). Conclusões: Em conjunto, nossos resultados demonstram que a atividade plasmática da DPPIV se correlaciona com um pior prognóstico em pacientes e animais com HF e que a DPPIV possui um papel importante na fisiopatologia desta doença / Aim: The present study aimed to test the hypothesis that the activity and/or expression of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), an enzyme that inactivates cardiorenal protective peptides including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and brain natriuretic peptide (BNP), would be associated with poorer outcomes in heart failure (HF). Methods: Experimental HF was induced in male Wistar rats (200-250 g) by left ventricular (LV) myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Rats were divided in three groups: Sham, HF and HF+DPPIV inhibitor (sitagliptin 200mg/kg/b.i.d). Six weeks after surgery, animals were individually housed in metabolic cages during 3 days for assessment of renal function. Plasma and heart DPPIV activity/expression were measured spectrophotometrically and by immunoblotting respectively. For evaluation of cardiac function a pressure-volume catheter was positioned into the LV cavity. Histological analysis was performed for morphometric parameters. Plasma DPPIV activity was also measured in patients (n = 190) with heart failure. Results: Plasma DPPIV activity and abundance were increased in animals with HF compared to Sham. Additionally, plasma DPPIV activity positively correlated with ventricular end diastolic volume (R² =0.517; p < 0.001) and lung/body weight (R² =0.492; p < 0.01). A negative correlation between plasma DPPIV activity and ejection fraction was also observed (R² =0.602; p < 0.001). Interestingly, HF animals also exhibited an increase of expression and activity of DPPIV in heart tissue, especially in endothelial cells. Six-week treatment with the DPPIV inhibitor sitagliptin attenuated cardiac dysfunction, mitigated cardiac hypertrophy, interstitial fibrosis, lung congestion and macrophage infiltration. Sitagliptin also raised the plasma levels of active GLP-1, increased activation of cardioprotective signaling pathways including PKA, and Akt; and reduced the levels of apoptosis and pro-inflammatory biomarkers compared to non-treated HF rats. Despite the higher circulating total BNP, renal PKG activity was lower in HF rats compared with sham and sitagliptin-treated rats, suggesting a decrease in active/total BNP ratio. Renal function did not differ between groups, but glomerular filtration rate was modestly, but significantly increased by Sitagliptin compared to HF. Plasma DPPIV activity in patients was also increased compared to healthy subjects and correlations was found with ejection fraction (R² =-0.20; p=0.009) and the chemokine Ccl2 (R² =0.30; p < 0.01). Conclusions: Taken together, our results demonstrate that circulating DPPIV activity correlates with poorer cardiovascular outcomes in human and experimental HF and might play an important role in the pathophysiology of HF.

A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), &Delta;H,&Delta;G,&Delta;S e &Delta;Cp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( &Delta;G) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de &Delta;Cp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de &Delta;HITC com &Delta;HvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), &Delta;H, &Delta;G, &Delta;S and &Delta;Cp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (&Delta;G) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The &Delta;Cp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its &Delta;HITC relationship with &Delta;HvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.