A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.

No sistema cardiovascular, modificações de pressão e shear stress devido ao fluxo sanguíneo influenciam a morfologia e a patofisiologia dos vasos sanguíneos e do coração. Neste trabalho, estudamos o papel de duas moléculas transmembrânicas do Sistema Renina-Angiotensina: a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) e o Receptor de Angiotensina do tipo I (AT1) como mecanosensoras e mecanotransdutoras dessas forças físicas. A ECA foi por muito tempo conhecida somente por sua ação em converter Angiotensina I em Angiotensina II e por inativar a Bradicinina. Recentemente foi demonstrado que a ECA, além dos efeitos enzimáticos já conhecidos, pode ter sua cauda citoplasmática fosforilada e desencadear vias de sinalização intracelular. Observamos que o shear stress, mas não o estiramento, induziu a diminuição da fosforilação da porção citoplasmática da ECA após 5 minutos de estímulo e se mantém até 18 horas. Demonstramos também que a porção extracelular da ECA tem papel fundamental como mecanosensora e que a via intracelular da JNK participa da mecanotransdução em resposta ao shear stress. Além disto, demonstramos que a diminuição da fosforilação da ECA está associada na diminuição da sua expressão pelo shear stress. O receptor AT1 é a principal molécula efetora das ações da angiotensina II. Recentemente foi demonstrado que esse receptor pode também ser ativado por forças físicas, estiramento celular, independentemente da presença da angiotensina II. No presente estudo, observamos que o receptor AT1 é ativado pelo shear stress e que o Candesartan, mas não o Losartan, é capaz de impedir esta resposta. A via intracelular ativada é dependente de proteína-G e da entrada de cálcio do meio extracelular. Interessantemente, a pré-exposicao dos receptores ao shear stress diminuem a responsividade dos receptores ao peptídeo Angiotensina II porém a Angiotensina II não é capaz de inibir a ativação pelo shear stress.. Em conjunto, demonstramos novos mecanismos de ação da ECA e do AT1 que são duas importantes moléculas do sistema renina angiotensina. A modulação destes componentes por estímulos mecânicos traz novas possibilidades de intervenções farmacologicas sobre esse sistema bem como o melhor entendimento da participação dessas moléculas na fisiopatologia cardiovascular. / Hemodynamic forces such as pressure and shear stress modulate the patophysiolgy of the cardiovascular system. In this study, we investigated two transmembranic key molecules of the renin-angiotensin system (RAS) as mechanosensors and mechanotransducers of physical forces: Angiotensin Converting Enzyme (ACE) and Angiotensin II type 1 Receptor (AT1). ACE is an enzyme that converts angiotensin I in angiotensin II. Recently, it was demonstrated that ACE cytoplasmic tail can be phosphorylated by ACE inhibitors and elicited intracellular cell signaling. Here, we observed that shear stress, but not stretch, decreased ACE cytoplasmic phosphorylation after 5 minutes and maintained up to 18 hours. ACE extracellular portion act as mechanosensor and JNK pathway participate in the mechanotransduction activation. In addition, we also demonstrate that decrease in ACE phosphorylation is involved in ACE expression downregulation by shear stress. AT1 receptor is the main effector molecule of angiotensin II cellular responses. It has recently been shown that AT1 receptor can directly be activated by mechanical stretch stress through an angiotensin-II-independent mechanism. In the present study, we observed that shear stress also activates AT1 receptor which is blocked by Candesartan, but not by Losartan. The intracellular pathway activated by shear stress involves both G-protein and extracellular calcium. Interestingly, preconditioning of AT1 receptor by shear stress impairs its responsiveness to angiotensin II while the pretreatment with angiotensin II still allow AT1 responsiveness to shear stress. Altogether, we demonstrated that ACE and AT1 receptor activates intracellular signal in response to mechanical force. This new concept for the RAS, the modulation of these molecules by mechanical forces gives new insigh into the discovery for pharmacological interventions to the RAS

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20983号 / 医博第4329号 / 新制||医||1027(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 竹内 理, 教授 杉田 昌彦, 教授 湊谷 謙司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição seletiva de células pancreáticas produtoras de insulina. Existem diversas formas de tratamento do DM1, tais como administração de insulina, imunossupressores, transplantes de pâncreas ou de ilhotas pancreáticas, porém todos se mostram ineficientes em algum aspecto. Recentemente, uma nova classe de medicamentos, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (iDPP-4), demonstrou eficiência terapêutica e segurança no tratamento de pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 devido ao aumento do hormônio peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1, do inglês glucagon-like peptide-1). Além disso, o uso de inibidores de DPP-4 em modelos experimentais de DM1 demonstrou proteção das células pancreáticas contra apoptose, estimulação de neogênese de ilhotas pancreáticas e melhora do controle homeostático da glicose. Esse presente projeto teve como objetivo avaliar o perfil imunológico e endocrinológico da administração do inibidor de DPP-4 (MK0431) em DM1 experimental quimicamente induzido por estreptozotocina em camundongos C57Bl/6. Os animais diabéticos foram tratados com ração controle ou ração contendo inibidor de DPP-4 (4g MK0431/Kg de ração) ad libitum durante 30 e 90 dias. Durante o tratamento os animais tiveram glicemia, peso e teste de tolerância oral à glicose avaliados. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados e o sangue, baço, timo, linfonodos pancreáticos e pâncreas foram coletados. Após 30 dias de tratamento com inibidor, foi observado um aumento do hormônio GLP-1 no soro, além de um padrão imunológico favorável. Dentre os mecanismos imunológicos, foi possível observar um aumento de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) no baço e uma diminuição da citocina IFN- no homogenato pancreático. Após 90 dias de tratamento com inibidor, também foi detectado um aumento de insulina e GLP-1 séricos e uma diminuição nos níveis glicêmicos dos animais tratados. Observou-se uma redução no padrão inflamatório no microambiente pancreático, caracterizado pela diminuição das citocinas TNF- e IFN- no homogenato pancreático e por uma redução da freqüência de macrófagos CD11b+ nos linfonodos pancreáticos. Os resultados obtidos neste projeto contribuíram para validar a eficácia terapêutica da administração de inibidor de DPP-4 no tratamento do DM1 experimental, bem como os mecanismos imunológicos e endocrinológicos envolvidos. Sem a ocorrência de efeitos tóxicos relevantes, o uso de inibidores de DPP-4 pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM1 em humanos, que constitui uma doença crônica associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento de alto custo. / Davanso, M.R. Immunoendocrinological analyses after administration of dipeptidyl-peptidase-4 inhibitor on experimental type 1 diabetes. 2012. 105p. Thesis (Masters Degree) School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Type 1 Diabetes Mellitus (DM1) is an autoimmune disease characterized by the selective destruction of the insulin-producing pancreatic cells. Several forms of treatment for DM1 are current known such as insulin administration, immunosuppressors, pancreas or pancreatic islets transplantation, however, they all are inefficient in some aspect. Recently, a new class of drugs, the dipeptidyl-peptidase-4 inhibitors (iDPP-4) showed therapeutic efficacy and safety in the treatment with type 2 diabetes mellitus patients due to an increase in the glucagon-like peptide-1 (GLP-1). In addition, the use of DPP-4 inhibitors in experimental models of DM1 has demonstrated a protection of pancreatic cells against apoptosis, stimulation of pancreatic islets neogenesis and improvement in the glucose homeostatic control. This project evaluated the immunological and endocrinological profile of the DPP-4 (MK0431) inhibitor administration in experimental chemically induced DM1 by streptozotocin in C57BI/6 mice. The diabetic animals were treated with either a normal chow diet or diet containing DPP-4 inhibitor (4g MK0431/Kg of diet) ad libitum during 30 and 90 days. During the treatment the animals were evaluated regarding glycemia, weight, and oral glucose tolerance test. At the end of the treatment, the animals were killed and the blood, spleen, thymus, pancreatic lymph nodes and pancreas were collected. After 30 days of treatment with inhibitor, it was observed an increase in the hormone GLP-1 in the serum, besides a favorable immunological pattern. Among the immunologic mechanisms, it was possible to observe an increase in the regulator T cells (CD4+CD25+Foxp3+) of the spleen and a decrease in the cytokine IFN- in the pancreatic homogenate. After 90 days of treatment with inhibitor, it was also noticed an increase in the insulin and serum GLP-1 levels as well as a decrease in the glycemic levels in the treated animals. It was observed a reduction in the inflammatory pattern in the pancreatic microenvironment characterized by a decrease in the cytokines TNF- and IFN- in the pancreatic homogenate and by a reduction in the frequency of CD11b+ macrophages in the pancreatic lymph nodes. The results obtained in this project contributed to validate the therapeutic efficacy of the DPP-4 inhibitor administration in the treatment of experimental DM1, as well as the immunological and endocrinological mechanisms involved. Without the occurrence of relevant toxic effects, the use of DPP-4 inhibitors may become a therapeutic alternative for the treatment of DM1 in humans, which constitutes a chronic disease associated to low life quality and need for high cost treatment.

Mit der vorliegenden Habilitationsschrift habe ich den Versuch unternommen, die beiden Themenkomplexe meiner bisherigen wissenschaftlichen Tätigkeit als Beispiele für die Rolle von Modellen in der klinischen Forschung zu verwenden. Den Ansto§ dazu gaben Diskrepanzen, die mir in der Auseinandersetzung mit eigenen Ergebnissen und Beobachtungen im Umfeld dieser Themenkomplexe aufgefallen sind: der Rolle kontaminierender Tumorzellen in der Hochdosistherapie maligner Tumoren einerseits und dem Enzym Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) andererseits. Die beobachteten Diskrepanzen sind Ausdruck konkurrierender pathophysiologischer oder therapeutischer Modelle, und die Präferenz eines bestimmten Modells scheint nicht rein rational erklärbar. Welche Faktoren tragen jedoch zur Entscheidung für oder gegen ein bestimmtes Modell bei? Ich möchte den Umgang mit wissenschaftlichen Modellen anhand der genannten Themenkomplexe aus meiner Sicht erörtern. Anschlie§end soll ein Entwurf skizziert werden, in dem die der Entscheidung für oder gegen ein therapeutisches Modell zugrundeliegende Motivationslage besser verständlich wird und die Intentionalität klinischer Forschung auf den Patienten hin berücksichtigt. / In the thesis presented here, I have taken the challenge to use the topics of my scientific work to discuss the role that models appear to exert in clinical science. This decision arose from discrepancies that became evident in the comparative assessment of my own studies in relation with the surrounding scientific context: the role of tumor cells contaminating peripheral blood or progenitor cell harvests as part of a high-dose chemotherapy regimen on the one hand, and the enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) on the other. The observed discrepancies appear to result from competing pathophysiological or therapeutic models, and the preference or rejection of one model apparently cannot be explained solely by rational factors. I will discuss the application of models in the context of the topics which my scientific work has been focusing on, and I will develop a draft proposal which will render the individual motivational status underlying the decision in favor of or against a distinct model easier to understand, with attention to the intentionality of clinical research towards the patient.

A enzima cruzaína é um alvo validado e promissor para a descoberta de agentes tripanossomicidas. A validação desta enzima estimulou o desenvolvimento de vários inibidores ao longo dos últimos vinte anos. A descoberta de novos compostos, provenientes de classes químicas distintas, mais seguros e eficazes representa uma importante contribuição para o desenvolvimento da quimioterapia da doença de Chagas. Dentre essas classes, encontram-se as dipeptidil-nitrilas, que apresentam alta potência contra a cruzaína e são conhecidamente inibidores covalente-reversíveis. Estudos de afinidade através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) são fundamentais na compreensão de sistemas bioquímicos e viabilizam a determinação dos parâmetros termodinâmicos. A ITC possibilita determinar com precisão e acurácia os valores de Kd(1/Ka), ΔH,ΔG,ΔS e ΔCp e com esses parâmetros pode-se traçar facilmente o perfil termodinâmico dos ligantes. No presente trabalho, a enzima selvagem cruzaína bem como sua forma mutante C25S foram preparadas e, pela primeira vez, foi realizado o estudo de afinidade através da ITC para 16 dipeptidil-nitrilas usadas como inibidores da cruzaína. O perfil termodinâmico (TP) foi obtido e observado como entálpico-dirigido com compensação entrópica desfavorável. A fatoração da energia livre ( ΔG) de interação foi usada para avaliar os efeitos causados pelas substituições em P1, P2 e P3 na energética, sugerindo uma correlação direta entre a afinidade e a otimização entálpica/entrópica. As substituições avaliadas promoveram um aumento de 10 a 20 vezes na afinidade da cruzaína pelo inibidor. Estudos em diferentes tampões foram realizados para a determinação da influência do efeito de ionização na afinidade. Foi determinado o valor de ΔCp do complexo cruzaína-Neq0409 e a relação de ΔHITC com ΔHvH. O Neq0569 foi testado contra a proteína mutante C25A, tendo sido observada inversão da assinatura que passou a ser entropicamente dirigida. Além disso, uma redução de 176 vezes na afinidade foi observada, demonstrando a importância da ligação covalente-reversível para o aumento da afinidade. / The enzyme cruzain is a validated and promising target for the discovery of trypanocidal agents. The validation of this enzyme has stimulated the development of several inhibitors over the past twenty years. The discovery of new compounds from different chemical classes, which are safer and more effective is an important contribution to the development of chemotherapy of Chagas disease. Among known classes are the dipeptidyl nitriles that exhibit high cruzain affinity and are known to be covalent-reversible inhibitors. Molecular optimization requires a rigorous assessment of physicochemical properties, including the thermodynamic characterization of molecular forces that govern cruzain-inhibitor interactions. Affinity studies through Isothermal Titration Calorimetry (ITC) are fundamental in understanding biochemical systems and enable the determination of thermodynamic parameters. The ITC tool provides the determination of Kd values (1/Ka), ΔH, ΔG, ΔS and ΔCp accurately and precisely. These parameters can easily be used to draw the thermodynamic profile of ligands. In this study, the wild type cruzain enzyme and its mutant form C25S were prepared and, for the first time by the best of our knowledge, the study was conducted by ITC for 16 dipeptidyl nitriles used as inhibitors of cruzain enzyme, which is a hydrolase. The thermodynamic profile (TP) was obtained and observed to be enthalpy-driven with unfavorable entropic compensation. The free energy factorization (ΔG) interaction was used to evaluate the effects caused by substitutions in P1, P2 and P3 in energy, thereby suggesting a direct correlation between the affinity and the enthalpy/entropy optimization. Substitutions made possible to observe an increase of 10 to 20 times higher than the affinity for previous cruzain inhibitors. Studies on different buffers were performed to determine the influence of ionizing effect on affinity. The ΔCp value was determined for cruzain-Neq0409 complex and its ΔHITC relationship with ΔHvH was also evaluated. Neq0569 was tested against the mutant protein C25A, having been observed reversal of the signature which became entropy driven. Furthermore, a reduction of 176-fold in the affinity was observed, demonstrating the importance of covalent-reversible binding to increase affinity.

<p align=\"justify\">A necessidade urgente de descoberta de terapias mais seguras e eficazes para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses tem motivado a pesquisa por novos inibidores das enzimas cruzaína e CPB, as principais cisteíno proteases do T. cruzie e Leishmania spp., respectivamente. Uma série de 52 compostos nitrílicos que atuam como inibidores covalente-reversíveis de cisteíno proteases foi sintetizada no grupo NEQUIMED/IQSC/USP e avaliada quanto a sua atividade inibitória contra as enzimas cruzaína, CPB de Leishmania mexicana e catepsina L de humanos. Utilizando planejamento molecular baseado em hipótese, mapeamos as relações estrutura-atividade (SARs) desses inibidores através de variações nas posições P1, P2, P3 e P1\' do esqueleto dipeptidil nitrílico. A substituição do grupo eletrofílico (warhead) aminonitrila em P1 pelo grupo azanitrila melhorou a afinidade em duas ordens de magnitude para todos os alvos avaliados. Um dos mais potentes inibidores, o análogo azanitrila Neq0690 mostrou uma cinética de ligação lenta com valores de pKi de 8,8, 9,3 e 9,7 para cruzaína, catepsina L e LmCPB, respectivamente. A substituição bioisostérica da ligação amida entre as posições P2-P3 pelo grupo trifluoroetilamina resultou na síntese do Neq0659, um potente inibidor com um perfil de ação seletivo para as proteases de parasitos. A substituição do grupo metileno em P1 pelo ciclopropano aumentou a afinidade para todas as enzimas. Contudo, uma inibição seletiva da cruzaína e LmCPB foi associada à presença do grupo (R)-benzila como substituinte da posição P1 dos derivados CF3 substituídos. Embora os compostos substituídos com leucina, tirosina, triptofano e 3-cloro fenilalanina como substituintes da posição P2 foram relativamente bem tolerados pela cruzaína e catepsina L, uma restrita especificidade foi verificada para LmCPB com pequenos ganhos de afinidade para os inibidores que possuíam os grupos leucina e metil benzoato como substituintes dessa posição. Com relação à posição P3, a inserção do grupo 3-terc-butilpirazol e 3-bromo piridina aumentou a afinidade para todos os alvos avaliados enquanto que um ganho seletivo para a LmCPB foi observado para os compostos que possuíam o grupo bifenila nessa posição. Além disso, duas novas estruturas cristalográficas da LmCPB complexada com o Neq0690 e metil metanotiossulfonato (MMTS) foram determinadas com resoluções de 1,3 Å e 1,5 Å, respectivamente. As estruturas dos co-complexos revelaram os modos de interação (MoB) desses ligantes, bem como as principais características do processo de reconhecimento bimolecular. Isso permitirá o uso de estratégias de planejamento baseado na estrutura do alvo com translação natural para a pesquisa por novos inibidores de cisteíno proteases, com amplo espectro de ação na quimioterapia de doenças a elas relacionadas. / <p align=\"justify\">The urgent need for the discovery of safer and more effective therapies for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis has motivated the search for new inhibitors of the enzymes cruzain and CPB, the major T. cruzi and Leishmania spp. cysteine proteases, respectively. A series of 52 nitrile-containing compounds acting as covalent-reversible inhibitors of cysteine proteases was synthesized at the NEQUIMED/IQSC/USP Medicinal Chemistry Group and evaluated for their inhibitory activity against the enzymes cruzain, Leishmania mexicana CPB and cathepsin L from humans. Using hypothesis-driven molecular design, we mapped the structure-activity relationships (SARs) of these inhibitors through variations in the P1, P2, P3 and P1\' positions of the dipeptidyl nitrile scaffold. The substitution of the aminonitrile by the azanitrile group improved the affinity by two orders of magnitude for all the evaluated targets. One of the most potent inhibitors, the azanitrile analogue dubbed Neq0690 showed a slow-binding kinetics with pKi values of 8.8, 9.3 and 9.7 for cruzain, cathepsin L and LmCPB, respectively. Bioisosteric substitution of the amide moiety between the P2-P3 positions by the trifluoroethylamine group resulted in the synthesis of Neq0659, a potent inhibitor with a selective action profile for parasite proteases. Substitution of the methylene group at P1 by cyclopropane increased the affinity for all enzymes. However, selective inhibition of cruzain and LmCPB was associated with the presence of the (R)-benzyl group as substituent of the P1 position of the substituted CF3 derivatives. Although leucine, tyrosine, tryptophan and 3-chloro phenylalanine substituted compounds as substituents of the P2 position were relatively well tolerated by cruzain and cathepsin L, a restricted specificity was verified for LmCPB with small affinity gains for the inhibitors possessing the leucine and methyl benzoate as substituents of that position. Regarding the P3 position, the insertion of the 3-tert-butylpyrazole and 3-bromo pyridine groups increased the affinity for all evaluated targets whereas a selective gain for LmCPB was observed for the compounds having the biphenyl moiety at that position. In addition, it is noteworthy that two new crystallographic structures of LmCPB complexed with Neq0690 and methyl methanethiosulfonate (MMTS) were determined with resolutions of 1.3 Å and 1.5 Å, respectively. The structures of the co-complexes revealed the modes of binding (MoB) of these ligands, as well as the main characteristics of the bimolecular recognition process. This will allow the natural translational target structure strategies for the search for new inhibitors of cysteine proteases with broad spectrum of action in the chemotherapy of related diseases.

Introdução/Objetivo: Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a atividade e/ou expressão da dipeptidil peptidase IV (DPPIV), uma enzima que inativa peptídeos com ações cardioreno protetoras, como o peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídeo natriurético cerebral (BNP), estaria associada a um pior prognóstico na insuficiência cardíaca (HF). Métodos: Injúria do miocárdio foi realizada através da ablação do ventrículo esquerdo (VE) por radiofrequência em ratos Wistar machos (200-250 g). Os ratos foram divididos em três grupos: Sham, HF e HF + inibidor de DPPIV (sitagliptina 200mg/kg/b.i.d). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas durante 3 dias para avaliação da função renal. Atividade e expressão da DPPIV no plasma e coração foram medidas por espectrofotometria e por immunoblotting, respectivamente. Para a avaliação da função cardíaca um cateter de pressão-volume foi posicionado dentro da cavidade do VE. A análise histológica foi realizada para os parâmetros morfométricos. A atividade da DPPIV no plasma também foi medida em pacientes com HF (n = 190). Resultados: A atividade DPPIV e sua abundância estavam aumentadas em animais com HF em comparação com Sham. Além disso, a atividade de DPPIV no plasma se correlacionou positivamente com o volume diastólico final (R = 0,517; p < 0,001) e o peso do pulmão/peso corporal (R = 0,492; p < 0,01). Uma correlação negativa entre a atividade DPPIV plasmática e a fração de ejeção também foi observada (R = 0,602; p < 0,001). Curiosamente, os animais HF também exibiram um aumento da expressão/atividade de DPPIV no tecido cardíaco, especialmente em células endoteliais. Seis semanas de tratamento com o inibidor de DPPIV sitagliptina atenuou a disfunção cardíaca, fibrose intersticial, congestão pulmonar e infiltração de macrófagos. O tratamento com sitagliptina também elevou os níveis plasmáticos de GLP-1 ativo, e aumentou a ativação de vias de sinalização cardioprotetoras como PKA e Akt; e reduziu os níveis de apoptose e marcadores pró-inflamatórios em comparação com ratos não tratados. Ratos com HF apresentaram maiores níveis circulantes de BNP, contudo a atividade da PKG renal foi mais baixa nesses animais em comparação com o grupo tratado com sitagliptina, sugerindo uma diminuição da razão BNP ativo/total. A função renal não diferiu entre os grupos, mas o ritmo de filtração glomerular estava ligeiramente aumentado no grupo tratado em comparação com os animais HF. Pacientes com HF apresentaram uma maior atividade plasmática da DPPIV e correlações foram encontradas com a com a fração de ejeção (R = -0,20; p = 0,009) e a quimiocina Ccl2 (R² =0,30; p < 0.01). Conclusões: Em conjunto, nossos resultados demonstram que a atividade plasmática da DPPIV se correlaciona com um pior prognóstico em pacientes e animais com HF e que a DPPIV possui um papel importante na fisiopatologia desta doença / Aim: The present study aimed to test the hypothesis that the activity and/or expression of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), an enzyme that inactivates cardiorenal protective peptides including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and brain natriuretic peptide (BNP), would be associated with poorer outcomes in heart failure (HF). Methods: Experimental HF was induced in male Wistar rats (200-250 g) by left ventricular (LV) myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Rats were divided in three groups: Sham, HF and HF+DPPIV inhibitor (sitagliptin 200mg/kg/b.i.d). Six weeks after surgery, animals were individually housed in metabolic cages during 3 days for assessment of renal function. Plasma and heart DPPIV activity/expression were measured spectrophotometrically and by immunoblotting respectively. For evaluation of cardiac function a pressure-volume catheter was positioned into the LV cavity. Histological analysis was performed for morphometric parameters. Plasma DPPIV activity was also measured in patients (n = 190) with heart failure. Results: Plasma DPPIV activity and abundance were increased in animals with HF compared to Sham. Additionally, plasma DPPIV activity positively correlated with ventricular end diastolic volume (R² =0.517; p < 0.001) and lung/body weight (R² =0.492; p < 0.01). A negative correlation between plasma DPPIV activity and ejection fraction was also observed (R² =0.602; p < 0.001). Interestingly, HF animals also exhibited an increase of expression and activity of DPPIV in heart tissue, especially in endothelial cells. Six-week treatment with the DPPIV inhibitor sitagliptin attenuated cardiac dysfunction, mitigated cardiac hypertrophy, interstitial fibrosis, lung congestion and macrophage infiltration. Sitagliptin also raised the plasma levels of active GLP-1, increased activation of cardioprotective signaling pathways including PKA, and Akt; and reduced the levels of apoptosis and pro-inflammatory biomarkers compared to non-treated HF rats. Despite the higher circulating total BNP, renal PKG activity was lower in HF rats compared with sham and sitagliptin-treated rats, suggesting a decrease in active/total BNP ratio. Renal function did not differ between groups, but glomerular filtration rate was modestly, but significantly increased by Sitagliptin compared to HF. Plasma DPPIV activity in patients was also increased compared to healthy subjects and correlations was found with ejection fraction (R² =-0.20; p=0.009) and the chemokine Ccl2 (R² =0.30; p < 0.01). Conclusions: Taken together, our results demonstrate that circulating DPPIV activity correlates with poorer cardiovascular outcomes in human and experimental HF and might play an important role in the pathophysiology of HF.

Abstract Bullous pemphigoid (BP) is the most common autoimmune blistering disease. It mostly affects elderly patients and is characterized by intense pruritus and blistering or bullae. Treatment options include topical and systemic corticosteroids, other immunosuppressive drugs and doxycycline. Disease course may be chronic and relapses are common. The incidence of BP has been reported to have increased in the last few decades, but the reason for this trend is not known. The aim of this thesis was to study the risk factors of BP. Firstly, the influence of the use of dipeptidyl peptidase (DPP-4) inhibitors was analyzed as a risk factor, and then those of other oral diabetes medications. This study also aimed to determine whether drugs used for psychiatric and neurologic conditions are risk factors for BP. Finally, previously diagnosed dermatitis herpetiformis (DH) and celiac disease (CD) were examined as potential risk factors for subsequent BP. For this retrospective, matched case-control study, patient data were obtained from the Finnish Care Register for Health Care database, and data on reimbursed drugs from the Social Insurance Institution of Finland. In the present study, prior use of DPP-4 inhibitors was found to increase the risk of BP twofold and in particular, vildagliptin increased the risk tenfold. The mean time between the initiation of vildagliptin and diagnosis of BP was 449 days. Metformin and other conventional diabetes drugs were not risk factors for BP. Several drugs used for neurological and psychiatric diseases were associated with an elevated risk for BP, but no pharmacological or chemical properties of these drugs emerged as candidates to explain the increased risk. A prior diagnosis of DH increased the risk of BP 22-fold and a diagnosis of CD doubled it. Dapsone had been used in the two years before BP diagnosis by 44% of patients whose BP was preceded by DH. The mean time between the diagnoses of DH and BP was 3.3 years. This study confirms the view that DPP-4 inhibitors increase the risk for BP. No such association was found with other classes of diabetes drugs and therefore their use can be continued following a diagnosis of BP. Doctors treating patients with DH should be aware of the association between DH and BP, and be particularly vigilant if a DH patient’s skin symptoms change or become unresponsive to a gluten-free diet and/or dapsone. / Tiivistelmä Rakkulainen pemfigoidi (pemfigoidi) on yleisin ihon autoimmuunirakkulatauti. Pemfigoidi on pääasiassa ikääntyneiden sairaus, ja sen tyypillisiä oireita ovat kova kutina ja rakkulat iholla. Pemfigoidin hoitoon käytetään paikallisia ja systeemisiä kortikosteroideja, muita immunosuppressiivisia lääkkeitä sekä doksisykliiniä. Taudinkulku on usein krooninen ja uusiutumiset ovat yleisiä. Rakkulaisen pemfigoidin ilmaantuvuuden on raportoitu lisääntyneen, mutta syitä tähän muutokseen ei täysin ymmärretä. Tämän tutkimuksen tavoite oli tutkia pemfigoidin riskitekijöitä Suomessa. Retrospektiivisessä tapaus-verrokkitutkimuksessa käytettiin aineistona Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen hoitoilmoitusrekisteristä poimittuja pemfigoidipotilaita (N=3397) ja verrokkeina ihon tyvisolusyöpäpotilaita (N=12941). Tiedot korvatuista lääkeostoista saatiin Kelan lääkekorvausrekisteristä. Tutkimuksessa todettiin DPP-4:n salpaajien kaksinkertaistavan pemfigoidin riskin ja DPP-4:n salpaaja vildagliptiini lisäsi riskiä jopa kymmenkertaiseksi. Vildagliptiinin aloituksen ja pemfigoidin toteamisen välillä kului keskimäärin 449 vuorokautta. Metformiini ja muut tutkitut suun kautta otettavat diabeteslääkkeet eivät lisänneet pemfigoidin riskiä. Useiden psykiatrisiin ja neurologisiin sairauksiin käytettävien lääkkeiden todettiin lisäävän pemfigoidin riskiä. Pemfigoidin on kuvattu voivan puhjeta ihokeliakian jälkeen, mutta laajempia tutkimuksia näiden sairauksien yhteydestä ei oltu aiemmin tehty. Tämän vuoksi samassa potilasaineistossa tutkittiin ihokeliakiaa ja keliakiaa pemfigoidin riskitekijöinä. Edeltävä ihokeliakia lisäsi pemfigoidin toteamisen riskiä selvästi, jopa 22-kertaiseksi ja keliakia kaksikertaiseksi. Huomattava osa potilaista oli ostanut ihokeliakian hoitoon käytettävää dapsonia edeltävän 2 vuoden aikana ennen pemfigoidin toteamista, mikä voi kertoa ihokeliakian oireiden aktiivisuudesta. Tämä tutkimus vahvistaa näkemystä siitä, että DPP-4:n salpaajat ovat pemfigoidin riskitekijä. Muut tutkitut diabeteslääkkeet eivät lisänneet riskiä ja voidaan ajatella, että ne eivät edelleen hankaloita aiemmin todetun pemfigoidin oireita. Koska ihokeliakian todettiin olevan pemfigoidin riskitekijä, tulee näitä potilaita hoitavan lääkärin muistaa pemfigoidin mahdollisuus, jos ihokeliakian oireet muuttuvat tai hoitovaste menetetään.

Introdução/Objetivo: Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a atividade e/ou expressão da dipeptidil peptidase IV (DPPIV), uma enzima que inativa peptídeos com ações cardioreno protetoras, como o peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídeo natriurético cerebral (BNP), estaria associada a um pior prognóstico na insuficiência cardíaca (HF). Métodos: Injúria do miocárdio foi realizada através da ablação do ventrículo esquerdo (VE) por radiofrequência em ratos Wistar machos (200-250 g). Os ratos foram divididos em três grupos: Sham, HF e HF + inibidor de DPPIV (sitagliptina 200mg/kg/b.i.d). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas durante 3 dias para avaliação da função renal. Atividade e expressão da DPPIV no plasma e coração foram medidas por espectrofotometria e por immunoblotting, respectivamente. Para a avaliação da função cardíaca um cateter de pressão-volume foi posicionado dentro da cavidade do VE. A análise histológica foi realizada para os parâmetros morfométricos. A atividade da DPPIV no plasma também foi medida em pacientes com HF (n = 190). Resultados: A atividade DPPIV e sua abundância estavam aumentadas em animais com HF em comparação com Sham. Além disso, a atividade de DPPIV no plasma se correlacionou positivamente com o volume diastólico final (R = 0,517; p < 0,001) e o peso do pulmão/peso corporal (R = 0,492; p < 0,01). Uma correlação negativa entre a atividade DPPIV plasmática e a fração de ejeção também foi observada (R = 0,602; p < 0,001). Curiosamente, os animais HF também exibiram um aumento da expressão/atividade de DPPIV no tecido cardíaco, especialmente em células endoteliais. Seis semanas de tratamento com o inibidor de DPPIV sitagliptina atenuou a disfunção cardíaca, fibrose intersticial, congestão pulmonar e infiltração de macrófagos. O tratamento com sitagliptina também elevou os níveis plasmáticos de GLP-1 ativo, e aumentou a ativação de vias de sinalização cardioprotetoras como PKA e Akt; e reduziu os níveis de apoptose e marcadores pró-inflamatórios em comparação com ratos não tratados. Ratos com HF apresentaram maiores níveis circulantes de BNP, contudo a atividade da PKG renal foi mais baixa nesses animais em comparação com o grupo tratado com sitagliptina, sugerindo uma diminuição da razão BNP ativo/total. A função renal não diferiu entre os grupos, mas o ritmo de filtração glomerular estava ligeiramente aumentado no grupo tratado em comparação com os animais HF. Pacientes com HF apresentaram uma maior atividade plasmática da DPPIV e correlações foram encontradas com a com a fração de ejeção (R = -0,20; p = 0,009) e a quimiocina Ccl2 (R² =0,30; p < 0.01). Conclusões: Em conjunto, nossos resultados demonstram que a atividade plasmática da DPPIV se correlaciona com um pior prognóstico em pacientes e animais com HF e que a DPPIV possui um papel importante na fisiopatologia desta doença / Aim: The present study aimed to test the hypothesis that the activity and/or expression of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), an enzyme that inactivates cardiorenal protective peptides including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and brain natriuretic peptide (BNP), would be associated with poorer outcomes in heart failure (HF). Methods: Experimental HF was induced in male Wistar rats (200-250 g) by left ventricular (LV) myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Rats were divided in three groups: Sham, HF and HF+DPPIV inhibitor (sitagliptin 200mg/kg/b.i.d). Six weeks after surgery, animals were individually housed in metabolic cages during 3 days for assessment of renal function. Plasma and heart DPPIV activity/expression were measured spectrophotometrically and by immunoblotting respectively. For evaluation of cardiac function a pressure-volume catheter was positioned into the LV cavity. Histological analysis was performed for morphometric parameters. Plasma DPPIV activity was also measured in patients (n = 190) with heart failure. Results: Plasma DPPIV activity and abundance were increased in animals with HF compared to Sham. Additionally, plasma DPPIV activity positively correlated with ventricular end diastolic volume (R² =0.517; p < 0.001) and lung/body weight (R² =0.492; p < 0.01). A negative correlation between plasma DPPIV activity and ejection fraction was also observed (R² =0.602; p < 0.001). Interestingly, HF animals also exhibited an increase of expression and activity of DPPIV in heart tissue, especially in endothelial cells. Six-week treatment with the DPPIV inhibitor sitagliptin attenuated cardiac dysfunction, mitigated cardiac hypertrophy, interstitial fibrosis, lung congestion and macrophage infiltration. Sitagliptin also raised the plasma levels of active GLP-1, increased activation of cardioprotective signaling pathways including PKA, and Akt; and reduced the levels of apoptosis and pro-inflammatory biomarkers compared to non-treated HF rats. Despite the higher circulating total BNP, renal PKG activity was lower in HF rats compared with sham and sitagliptin-treated rats, suggesting a decrease in active/total BNP ratio. Renal function did not differ between groups, but glomerular filtration rate was modestly, but significantly increased by Sitagliptin compared to HF. Plasma DPPIV activity in patients was also increased compared to healthy subjects and correlations was found with ejection fraction (R² =-0.20; p=0.009) and the chemokine Ccl2 (R² =0.30; p < 0.01). Conclusions: Taken together, our results demonstrate that circulating DPPIV activity correlates with poorer cardiovascular outcomes in human and experimental HF and might play an important role in the pathophysiology of HF.