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Estudo de Biomarcadores em humanos para fluorose ósseaAdriano, Maria Soraya Pereira Franco 01 April 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-04-01 / Skeletal fluorosis is a chronic metabolic disorder caused by chronic ingestion or inhalation of
high concentrations of fluoride. The main consequences are bone alterations and deformities
leading to disability. It is a disease of difficult diagnosis because of its pre-clinical signs
resembling other bone diseases. In this sense, this epidemiological, observational, transversal
and descriptive study aimed at mapping clinical, radiological and molecular biomarkers of
exposure. Initially the sample consisted of 103 individuals of both sexes and varied ages. From
the total, 45 individuals were analyzed for the identification of the radiological biomarker and
25 individuals were monitored for the biochemical and proteomic markers. For the analysis of
fluoride intake in the region, drinking water was collected and the biomarkers were evaluated.
As for identification of the samples regarding fluoride exposure: 25 hours urine analysis was
performed through the direct method using TISAB II and III on an specific electrode and for
the fluoride dosage on fingernail and hair the analysis was done though the indirect method
(HMDS). The radiographs were carried out on a Kodak K 9000 C 3d apparatus (by the same
operator) with exposure of 16 S, 10 Ma, 60-70 kvp and the maximum skin intake (DEP) of 5
mgy. The volunteers underwent digital panoramic radiographs under same circumstances. For
biochemical parameters it was performed a complete blood count, hormonal dosage, calcium
and enzymes dosage (creatinine and alkaline phosphatase). For the proteomic identification it
was performed a mass spectrophotometry (MALDI-TOF). Data were analyzed on the statistical
package for social sciences (SPSS), version 18, using p<0.05. The results pointed out that 46%
of the drinking water from São João do Peixe River presented [F] above the ideal value for
human consumption of 0.7mg/L and 84% showed values above 1.5mg/L, being indicative of
fluorosis in the region. The average age of the volunteers was 50 years, with the prevalence of
women, and they showed a time of exposure around 40 years. Regarding the symptomatology
85 individuals reported pain, of which 77% (chi-squared) presented symptoms on more than 3
regions. However, the lumbar region was the indicative variable of presence of bone fluorosis
(linear regression, p < 0.005). As for the radiological biomarker, it was verified that the most
discriminatory bone conditions were osteopenia, ossification of soft tissues, bone deformit ies,
jaw density, and thin cortical of jaw and jaw. There was evaluation divergence between
orthodontists and radiologist. Panoramic radiographs proved to be an auxiliaar method of
diagnosis and can only be an indicative of bone changes related to skeletal fluorosis, it cannot
be discriminatory in cases of grades I and II skeletal fluorosis. The biochemical variables
showed that the average volume of urine excreted was 890 ml in 24 hours, whose concentration
contained an average of 3.9 mgF/liter (0.2-3.2 VR), presenting a high fluoride excretion. The
average fluoride concentration on fingernails was 14.2 being the highest level ever recorded,
probably due to the diffusion capture of F by the HMDS. Serum calcium had an average of 9.0
mg/dl (8.9 -10, 3VR); phosphorus, 3.8 mg/dl (2.4-4.7 VR); alkaline phosphatase, 288 IU/litre
(32-91 VR); Alkaline phosphatase bone specific, 96 ug/litre (4.5-16.9 VR); Osteocalcin, 309
ng/ml (11-50 VR); and PTH, 203 pg/ml (10-65 VR). Electrolytes, glucose, albumin, urea and
creatinine were with 70% normal, as well as platelet count. Among the sick and non-patient
studied groups, there were no differences between the groups, according to the Mann-Whitney
test, p < 0.05. For proteomics analysis, there was a large quantity of proteins in the serum, being
the affected volunteers more altered when compared to the other group. Few proteins were
found on the saliva. Data indicate that mass spectrophotometry is capable of detecting
differential proteins so it can be useful for fluoride biomarkers identification as well as it can
help understand the skeletal fluorosis mechanism. / A fluorose ó ssea é uma doença metabólica crônica, causada pela alta concentração do flúor
ingerido ou inalado. Tem como principal consequência alterações e deformidades ó sseas
levando a incapacidade. Mordidade de difíc il diagnó stico, devido aos sinais pré- clínicos
assemelhar-se a de outras doenç as ó sseas, gerando problemas para a realizaç ão do diagnó stico.
Neste sentido, este estudo epidemiológico, observacional, transversal e descritivo teve como
objetivo mapear biomarcadores de exposiç ão, clínicos, radiológicos e moleculares para fluorose
ó ssea . A amostra constitui inicialmente de 103 indivíduos de ambos os sexos e variadas faixas
etárias. Sendo 45 analisados quanto a identificaç ão do biomarcador radiológico e 25
monitorados quanto ao marcador bioquímico e proteô mico. Para investigaç ão das
concentraç ões de ingestão de flúor na região foi realizada a coleta de água para consumo e para
identificaç ão das amostras quanto a exposiç ão ao fluoreto foram avaliados os biomarcadores:
urina (25 horas) ambos realizado através do método direto com TISAB II e III respectivamente
e a dosagem da unha e cabelo, pelo meio indireto por difusão com hexametildisiloxano
(HMDS). As radiografias foram realizadas em aparelho Kodak K 9000 C 3D (pelo mesmo
operador) com exposiç ão de 16 s, 10 mA, 60- 70 Kvp e dose de entrada de pele (DEP) máxima
de 5 mGy. Os indivíduos foram submetidos a radiografias panorâ micas (digital) em aparelhos
de RX do mesmo modelo e em condiç ões similares. Para os parâ metros bioquímicos foram
realizados hemograma completo, dosagem hormonal, dosagem de cá lcio e enzimologia
(creatina e fosfatase alcalina). Para identificaç ão de proteomas utilizou-se espectometria de
massa (MALDI- TOF). Os dados foram avaliados por meio do Programa Statistical Package
for Social Sciences (SPSS) versão 18, com p<0,005. Os resultados apontaram que 46% da água
presente em poç os artesianos em São João do Rio do Peixe-PB, apresentam [F] acima do valor
ideal de 0,7mg/L para ingestão de água para consumo humano e 84% aponta valores acima
de1,5mg/L, sendo indicativo de fluorose na região. A média de idade foi de 50 anos, com
predomínio de mulheres, a amostra apresentou um tempo de exposiç ão em torno de 40 anos.
Quanto a sintomatologia 85 relataram dor, destes 77% (qui-quadrado), apresentam mais de 3
regiões acometidas. Porém a região lombar foi a variável indicativa de presenç a de fluorose
ó ssea (regressão linerar, p<0,005). No que concerne o biomarcador radiológico, verifica-se que
as condiç ões ó sseas mais discriminantes: osteopenia, ossificaç ão dos tecidos moles,
deformidades ó sseas, densidade da maxila, e cortical fina de maxila e mandíbula. Houve
divergê ncia na avaliaç ão entre ortodontistas e radiologias. A radiografia panorâ mica se mostrou
como um recurso auxiliar e apenas indicativa de alteraç ões ó sseas relacionadas com a fluorose
ó ssea, não podendo ser discriminató ria nos casos de fluorose ó ssea de graus I e II. Quanto as
biomarcadores de exposiç ão foi evidenciado. As variáveis bioquímicas que o volume médio
excretado foi de 890 ml em 24 h, cuja concentraç ão continha uma média de 3,9 mg / litro F
(0,2-3,2 VR), constatando uma excreç ão elevada. A concentraç ão média da unha encontrado
foi de 14,2 sendo o mais elevado nível de concentraç ão já registrada, provavelmente devido à
captura de difusão de F pelo HMDS.Cá lcio sérico teve uma média de 9,0 mg / dl (8,9-10,3VR);
fó sforo, 3,8 mg / dl (2,4-4,7 VR); fosfatase alcalina, 288 UI / litro (32-91 VR); específica do
osso da fosfatase alcalina, 96 ug / litro (4,5-16,9 VR); osteocalcina, 309 ng /ml (11-50 VR); e
PTH, 203 pg/ml (10-65 VR). Eletró litos, glicose, albumina, uré ia e creatina estavam com 70%
normais, assim como contagem de plaquetas. Entre os grupos estudados doentes e não doentes,
não houve diferenç as entre os grupos, segundo o teste de Mann-Whitney, p<0,05. Para aná lise
proteô mica, verificou-se a presenç a de uma grande quantidade de proteínas no soro, estando os
doentes mais alterado quando comparado com o outro grupo. A saliva poucas proteínas foram
encontradas. Os dados indicam que a espectometria de massa é capaz de detectar proteínas
diferecialmente expressa. Podendo ser útil para identificaç ão de biomarcadores para F, além de
ajudar no avanç o do mecanismo envolvido da fluorose ó ssea.
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Efeitos in vitro de soro de pacientes com nefrite lúpica ativa em células de linhagem osteoblástica humana hFOB 1.19 / The in vitro effects of the serum of patients with active lupus nephritis on the human osteoblast-like cell model hFOB 1.19Lima, Ana Paula Calheiros de 07 December 2018 (has links)
INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro
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Efeitos in vitro de soro de pacientes com nefrite lúpica ativa em células de linhagem osteoblástica humana hFOB 1.19 / The in vitro effects of the serum of patients with active lupus nephritis on the human osteoblast-like cell model hFOB 1.19Ana Paula Calheiros de Lima 07 December 2018 (has links)
INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro
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