Le but de ce projet de thèse a été d’établir une nouvelle méthodologie permettant d’immobiliser des espèces paramagnétiques sur des silices mésoporeuses afin d’optimiser le processus de polarisation dynamique nucléaire. Pour ce faire, différentes matrices polarisantes, nommées HYPSO pour « HYbrid Polarizing SOlids », ont été préparées par un procédé sol-gel. Ces solides sont hautement poreux et des espèces paramagnétiques y sont liées de manière covalente. Un des avantages notable de cette méthode consiste à s’affranchir « d’agent glaçant » en raison d’une répartition homogène et aléatoire des radicaux à la surface des matériaux. Deux types de matrices polarisantes, HYPSO 2 et HYPSO 3 ont révélé des polarisations distinctes : P(1H)= 50% et P(1H)= 63%. Cette différence a été expliquée par l’influence de la matrice de silice qui offre de meilleures performances lorsque sa porosité est interconnectée dans les 3 dimensions de l’espace. Suite à ces résultats, de nouveaux matériaux (HYPSO 5) ont été préparés. L’influence de la taille des pores ainsi que celle des grains de silice sur la polarisation ont été étudiées. Des performances remarquables : P(1H)= 99% (± 5%) et P(13C)= 51 % ont été enregistrées, témoignant ainsi de l’efficacité de cette nouvelle méthode. De plus, les premières images IRM utilisant les HYPSO 5 en tant que matrices polarisantes ont été obtenues après hyperpolarisation d’une solution d’acétate de sodium de référence. Enfin, nous nous sommes intéressés à une nouvelle formulation basée sur des xérogels de silice. Des résultats préliminaires ont montré de bonnes polarisations avec la capacité d’utiliser un même monolithe pour polariser différents liquides / The goal of this PhD project was to develop a new methodology allowing to immobilize paramagnetic species on mesoporous silica in order to optimize the dynamic nuclear polarization process. For this purpose, different polarizing matrices, denoted as HYPSO for “HYbrid Polarizing SOlids”, were prepared through a sol-gel process. These solids are highly porous and paramagnetic species are covalently attached onto the surface. One of the noticeable benefit of this method lies in the possibility to remove the “glass forming agent” because of a homogeneous and random repartition of the radicals onto the surface of these materials. Two types of polarizing matrices, HYPSO 2 and HYPSO 3 gave distinct polarizations: P(1H)= 50% and P(1H)= 63%. This difference was explained by the influence of the silica matrix which provides better performances when its porosity is interconnected in the 3 dimensions of the space. Following these results, new materials (HYPSO 5) were prepared. The influence of the pore sizes as well as those of the silica grains on the polarization were studied. Remarkable performances: P(1H)= 99% (± 5%) et P(13C)= 51 % were recorded, thereby demonstrating the efficiency of this new method. Moreover, the first MRI pictures using HYPSO 5 as polarizing matrices were obtained after hyperpolarization of a sodium acetate solution. Finally, we were interested to a new formulation based on silica xerogels. Preliminaries results showed good polarizations and the ability to use only one monolith to polarize different liquids

La détermination structurale supramoléculaire de solides organiques est d'une importance capitale pour la compréhension de leurs propriétés et de leur fonction. Des informations structurales à l’échelle atomique peuvent en principe être obtenues pour des composés en phase solide par la spectroscopie RMN (résonance magnétique nucléaire) combinée à la rotation de l’échantillon à l’angle magique (MAS). Cette technique est cependant confrontée à de fortes limitations de sensibilité, notamment en raison de la faible abondance isotopique naturelle (AN) d’isotopes clés, comme le carbone-13 et l’azote-15 (respectivement 1,1% et 0,37%).Une amplification de la sensibilité de plusieurs ordres de grandeur peut être obtenue avec la polarisation nucléaire dynamique (DNP), technique basée sur le transfert de polarisation des spins électroniques aux spins nucléaires. Les progrès récents dans la mise en œuvre pratique de la DNP ouvrent de nouvelles voies passionnantes, explorées dans cette thèse, pour la détermination de la structure des solides organiques.La première étape d’une étude structurale par RMN consiste en l'attribution spectrale des résonances. Malgré la faible AN des isotopes 13C et 15N, nous montrons dans ce travail que l’attribution complète de ces résonances pour un assemblage à base d’un dérivé de Guanosine est possible, grâce à l’utilisation d’expérience de corrélation multidimensionnelle 13C-13C et, pour la première fois, de spectre de corrélation 13C-15N.L'accent est alors mis sur l'obtention d'information structurale sous la forme de distances carbone-carbone et carbone-azote à partir d’expériences de transfert d’aimantation (expériences dites de « recouplage dipolaire »). Plusieurs stratégies sont discutées pour l’obtention de courbes de transfert d’aimantation sur des échantillons en AN. La dilution naturelle des isotopes 13C et 15N présente ici un avantage décisif pour ces mesures en réduisant de manière importante la troncature dipolaire, ce qui permet un transfert de polarisation sur de longues distances sans perturbation engendrée par la présence d’un troisième spin. Il en découle une description simplifiée de la dynamique de spin qui peut ainsi être facilement reproduite par des simulations numériques. Cette approche est démontrée expérimentalement sur des nanotubes du peptide diphénylalanine cyclique auto-assemblé (cyclo-FF). Les courbes de transfert d’aimantation 13C-13C et 13C-15N obtenues sont effectivement sensibles à de longues distances allant jusqu'à ~ 7 Å, et sont en excellent accord avec les simulations basées sur la structure cristalline du cyclo-FF. De plus, chaque courbe de transfert d’aimantation est constituée d’une superposition de contributions multiples intra et intermoléculaires, et contiennent donc une information structurale très riche.Il est ensuite montré que le contenu élevé de l'information contenu dans ces courbes de transfert d’aimantation et leur description théorique simple permettent de déterminer à la fois la structure moléculaire et la structure supramoléculaire du cyclo-FF. Ceci est réalisé à l'aide d'un code de calcul dédié qui crée de manière systématique des modèles structuraux par translation/rotation moléculaire et différentes symétries possible de la maille cristalline. Ces modèles sont ensuite classés en fonction de leur accord avec les données expérimentales.La thèse conclut en présentant des améliorations méthodologiques pour la séquence d'impulsions de recouplage dipolaire homonucléaire SR26. Cette séquence est particulièrement puissante pour une utilisation sur des échantillons en AN. Ces améliorations permettent une augmentation de l'efficacité du recouplage et l'acquisition de spectres de corrélation 2D avec de larges fenêtres spectrales.En résumé, cette thèse démontre que l'utilisation d'échantillons organiques en AN présente d’importants avantages pour leur étude structurale par RMN en phase solide qui devient possible avec la technique de DNP sous MAS. / Supramolecular structure determination of organic solids is of utter importance for understanding their properties and function. Structural insights at the atomic level can be provided by magic-angle spinning (MAS) solid-state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. However, this technique faces strong limitations in sensitivity due to the low natural isotopic abundance (NA) of the key nuclei 13C and 15N (1.1 % and 0.37 %, respectively). Sensitivity enhancement by several orders of magnitude can be achieved with dynamic nuclear polarization (DNP) which is based on polarization transfer from electron to nuclear spins. The recent progress in the practical implementation of DNP opens up new and exciting possibilities for structure determination of organic solids which are explored in this thesis.The first step for structural studies with NMR is resonance assignment. The complete assignment of 13C and 15N resonances at NA is demonstrated here to be feasible based on DNP-enhanced 13C-13C and, for the first time, 13C-15N correlation spectra.The focus is then laid on obtaining structural information in the form of carbon-carbon and carbon-nitrogen distances from the buildup of polarization in dipolar recoupling experiments. Several strategies are discussed for recording such polarization buildup curves at NA. A decisive advantage of these measurements is that dipolar truncation is reduced to a great extent in samples at NA, enabling undisturbed polarization transfer over long distances and a simple description of the spin dynamics by numerical simulations. This is demonstrated experimentally on the self-assembled cyclic diphenylalanine peptide (cyclo-FF). The 13C-13C and 13C-15N buildup curves obtained are indeed sensitive to long distances (up to ~ 7 Å) and are in excellent agreement with the crystal structure of cyclo-FF. Moreover, each buildup curve represents a superposition of multiple intra- and intermolecular distance contributions and can therefore provide a wealth of structural information.It is subsequently shown that the high information content and the simple theoretical description of such polarization buildup curves enables determination of both the molecular and the supramolecular structure of cyclo-FF. This is achieved with the help of a dedicated computational code which creates structural models based on a systematic grid-search and ranks them according to their agreement with the experimental data.The thesis concludes by presenting improvements for the homonuclear dipolar recoupling pulse sequence SR26 which is a powerful sequence for use in NA samples. These improvements enable increased recoupling efficiency and the acquisition of 2D correlation spectra with large spectral widths.Overall, this thesis demonstrates that clear advantages lie in the use of NA samples for structural studies of organic solids, and that MAS-DNP enables structure determination which is mainly based on distance information from NMR data.

In der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) treten drei Effekte auf, die paramagnetische und diamagnetische Moleküle in isotroper Lösung unterscheiden: residuale dipolare Kopplung (RDC), Pseudokontaktverschiebung (PCS) und paramagnetische Relaxationsverstärkung (PRE). Alle drei Effekte sind abhängig von intermolekularen Winkeln und Abständen und können daher Informationen über die Struktur und Dynamik des Moleküls liefern. Um diese Informationen zu erhalten, muss das Molekül paramagnetische Eigenschaften aufweisen. Eine der heutzutage gebräuchlichen Methoden verwendet kleine molekulare Tags, die paramagnetische Metallionen koordinieren. Die meisten dieser Tags binden über eine Disulfidbrücke an Cysteine an der Proteinoberfläche. Um diese Methode für DNA anzuwenden werden daher neue Taggingstrategien benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine modifizierte Nukleobase synthetisiert, mit der ein Schwefelatom in die DNA eingebracht werden kann. Diese Methode erlaubt es, jeden Tag an die DNA zu binden, der als Verbindungsmethode eine Disulfidbrücke nutzt. Mit der Nukleobase wird eine Kohlenstoff-Dreifachbindung in die DNA eingefügt und mit Hilfe einer dipolaren Cycloaddition wird die freie Thiolgruppe eingebracht. Die modifizierte Nukleobase wurde erfolgreich an einem selbstkomplementären DNA-Strang (24 Nukleobasen) getestet. Die Nukleobase wurde während der Synthese der DNA eingefügt und der mit Lutetium, Terbium oder Thulium vorbeladene Cys-Ph-TAHA Tag wurde über eine Disulfidbrücke an die DNA gebunden. Die Beladung des Tags und die Taggingreaktion verliefen hierbei quantitativ. Nach diesem Erfolg war es ein Hauptaspekt dieser Arbeit, eine verlässliche und reproduzierbare Aufreinigungs- und Probenvorbereitungsmethode zu entwickeln. Diesem Punkt kommt besondere Bedeutung zu, da das Phosphatrückgrat der DNA, im Gegensatz zu Proteinen, Metallionen koordinieren kann. Im Theorieteil dieser Arbeit ist eine komplette Herleitung der drei Hauptmerkmale paramagnetischer NMR gegeben. Diese Herleitung beginnt bei Grundbegriffen des Magnetismus und neben den Gleichungen für RDCs, PCSs und PREs werden Ausdrücke für den dipolaren Hamiltonoperator, Kreuzrelaxationsraten, kreuzkorrelierte Relaxationsraten, durch Alignment induzierte RDCs, Korrelationsfunktionen und spektrale Dichten gegeben. Das zweite Thema dieser Arbeit basiert auf einem weiteren paramagnetischen Effekt. Um der reduzierten Empfindlichkeit der Kernspinresonanzspektroskopie verglichen mit anderen Spektroskopiemethoden entgegenzuwirken, wurden viele Methoden entwickelt, die auf eine Erhöhung der Polarisierung der Atomkerne zielen, d.h. um sogenannte hyperpolarisierte Kerne zu erzeugen. Eine dieser Methoden, die photochemisch erzeugte dynamische Kernpolarisierung (photo CIDNP), basiert auf kurzlebigen Radikalen, die durch direkte Laserbestrahlung der Probe im Magneten erzeugt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein photo CIDNP Aufbau entworfen, gebaut und getestet. Die ersten Experimente und Resultate mit Triethylendiamin, L-Tyrosin und 3-Fluor-L-tyrosin zeigen die Vorteile und Grenzen dieser Methode auf. Für 3-Fluor-L-tyrosin wurde eine komplette Analyse des Relaxationsverhaltens, einschließlich der Kreuzrelaxation und der kreuzkorrelierten Relaxation, durchgeführt.

Ce travail expose deux stratégies pour le développement de nouveaux agents de contraste pour le diagnostic par IRM rehaussée par l’effet Overhauser.Le premier thème de ce travail est consacré au développement d’une sonde radicalaire, de type nitroxyde, capable de modifier sa signature RPE (Résonance Paramagnétique Electronique) en fonction d’une activité enzymatique. Cette modification, due à un changement conformationnel, a permis une irradiation microonde sélective de la sonde libérée par protéolyse. Cette particularité a pu être appliquée à l’IRM rehaussée par l’effet Overhauser et une amélioration du contraste de l’image de 1200% in vitro a été observée après hydrolyse enzymatique. Du fait de contraintes techniques, une amélioration du contraste de 600% a été obtenue in vivo alors que de nos jours,les agents de contraste les plus courants en clinique, basés sur des complexes de GdIII, améliorent le contraste de l’image d’environ 50 %. Le second thème aborde la synthèse et l’étude physico-chimique d’alcoxyamines, précurseurs de nitroxydes, pour le diagnostic par IRM rehaussée par l’effet Overhauser. Le point clé de cette approche repose sur l’activation de ces molécules afin de libérer rapidement le nitroxyde in situ. Les résultats de monoactivation chimique étant encourageants, la double activation chimique de ces nouvelles alcoxyamines a permis d’abaisser drastiquement le temps de demi-vie de l’une d’entre elles pour obtenir des valeurs compatibles avec des applications en diagnostic. Un pseudo-peptide sélectif de la chymotrypsine a également été greffé,ce qui a permis d’aboutir à une alcoxyamine modèle qui permettra de valider le concept de diagnostic recherché. / This work promotes two strategies for the development of new contrast agents for the diagnosis by Overhauser enhanced MRI. Two approaches have therefore been addressed.The first approach is devoted to the development of a nitroxide-type spin label, which is capable to change its EPR (Electron Paramagnetic Resonance) signature upon a non-radical enzymatic activity. This modification, due to a conformational change, allowed us to perform a selective microwave irradiation of the probe released by proteolysis. This feature was applied to Overhauser enhanced MRI and of the image after enzymatic hydrolysis of 1200% in vitro has been obtained. Due to technical hindrances, a contrast enhancement of 600% has been obtained in vivo, while nowadays, the most common clinical contrast agent, based on GdIII complex, improve image contrast around a value of 50%.The second topic deals with the synthesies and the physico-chemical study of alkoxyamines, as nitroxide precursors, for the diagnosis by MRI enhanced by the Overhauser effect. The key point of this approach is based on the activation of these molecules to quickly release the nitroxide in situ. Encouraged by the results of chemical monoactivation, we performed the double chemical activation of these new alkoxyamines to drastically reduce the half-life time of one of them to obtain values compatible with diagnostic applications. A selective pseudo-peptide of chymotrypsin has also been grafted, which allowed us to achieve an alkoxyamine model that will validate our concept of diagnosis.

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The first part of this dissertation (Chapters 1 to 4) describes the use of magnetic resonance techniques for polymeric material characterizations in solutions, with emphasis on methods utilizing magnetic field gradients - magnetic resonance imaging (MRI) and pulsed-field-gradient (PFG) NMR. The second part (Chapter 5) presents enhancements to dynamic nuclear polarization, an intensity enhancement approach for magnetic resonance techniques. In Chapter 2, I illustrate a characterization method to quantify free polymer chain content in a polymer/DNA complex (polyplex) formulation via one-dimensional proton NMR experiments. This assessment of free polymer quantity has critical impacts on in vivo gene transfection efficiency, cellular uptake, as well as toxicity of polycationic gene delivery vectors. Specifically, I investigated the complexation properties of three different polymeric "theranostic" agents, which combine an imaging functionality on the polymer as well as a DNA/RNA complexation component. These agents are under development to allow real time clinical monitoring of drug delivery and efficacy using MRI. Our NMR method provides simple and quantitative assessment of free and DNA-complexed polymers, including the actual polymer amine to DNA phosphate molar ratio (N/P ratio) within polyplexes. The NMR results are in close agreement with the stoichiometric number of polymer/DNA binding obtained by isothermal titration calorimetry. The noninvasive nature of this method allows broad application to a range of polyelectrolyte coacervates, for understanding and optimizing polyelectrolyte complex formation. Chapter 3 demonstrates a time-resolved MRI approach for measuring diffusion of drug-delivery polymeric nanoparticles on mm to cm scales as well as monitoring nanoparticle concentration distribution in bulk biological hydrogels. Our results show that as the particle size and surface charge become larger, collagen gel at tumor relevant concentration (1.0 wt.%) presents a more significant impediment to the diffusive transport of negatively charged nanoparticles. These results agree well with those obtained by fluorescence spectroscopies (neutral or slightly positively charged diffusing particles) as well as the proposed electrostatic bandpass theory of tumor interstitium (negatively charged particles). This study provides fundamental information for the design of polymeric theranostic vectors and carries implications that would benefit the understanding of nanoparticle transport in solid tumors. Furthermore, this work takes a significant step toward developing quantitative and real time in vivo monitoring of clinical drug delivery using MRI. Chapter 4 addresses the application of PFG-NMR for the determination of weight-average molar mass (Mw) for polyanions that have anti-HIV activity through the measurement of polymer diffusion coefficients in solutions. The effective characterization of molecular weights of polyelectrolytes has been a general and growing problem for the polymer industry, with no clear solutions in sight. In this study, we obtained the molar masses (Mw) for two series of sulfonated copolymers using sodium polystyrene sulfonate samples as molecular weight standards. PFG-NMR has notable advantages over conventional techniques for the characterization of charged polymers and shows great promise for becoming an effective alternative to chromatography methods. Chapter 5 is devoted to experimental and theoretical studies of liquid state dynamic nuclear polarization (DNP) via the Overhauser effect. Based on the adventurous work done by previous Dorn group members, we show that for 1H-nuclide-containing systems, the dipolar DNP enhancement can be significantly improved by decreasing the correlation time of the interaction by utilizing a supercritical fluid (SF CO2) which allows for greater dipolar enhancements at higher magnetic fields. For molecules containing the ubiquitous 13C nuclide, we show that previously unreported sp hybridized (H-C) alkyne systems represented by the phenylacetylene-nitroxide system exhibit very large scalar-dominated enhancements. Furthermore, we show for a wide range of molecular systems that the Fermi contact interaction can be computationally predicted via electron-nuclear hyperfine coupling and correlated with experimental 13C DNP enhancements. For biomedical applications, the enhancement of metabolites in SF CO2 followed by rapid dissolution in water or biological fluids is an attractive approach for future hyperpolarized NMR and MRI applications. Moreover, with the aid of density functional theory calculations, solution state DNP provides a unique approach for studying intermolecular weak bonding interaction of solutes in normal liquids and SF fluids. / Ph. D.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est désormais devenue une technique spectroscopique incontournable à de nombreux domaines de la science et de la médecine. Cependant, elle est limitée par une faible sensibilité en raison d'une polarisation nucléaire insuffisante, définie par la différence des populations entre les niveaux d'énergie impliqués, ce qui résulte à des temps expérimentaux assez longs. Cet inconvénient peut être compensé en transférant l’énorme polarisation des électrons non appariés aux spins nucléaires à l'aide d'une irradiation par micro-ondes à basse température - une méthode connue sous le nom de polarisation nucléaire dynamique (DNP). Sami Jannin et ses collègues ont récemment combiné la méthode de polarisation croisée (CP) avec la DNP, à des températures très basses, afin de polariser plus rapidement les noyaux de faible γ en transférant la polarisation des électrons aux protons et ensuite aux noyaux de faible γ, comme le carbone-13. Cette thèse démontre que l'efficacité de cette méthode peut être améliorée en arrêtant l'irradiation par micro-ondes pendant quelques centaines de millisecondes avant la CP. En effectuant ces expériences, la polarisation du carbone-13 de l'acétate de sodium [1-¹³C] peut monter jusqu'à 64% avec une constante de temps d'accumulation de polarisation très courte de 160 s. L'échantillon hyperpolarisé peut ensuite être rapidement dissous pour obtenir un signal RMN amplifié à l'état liquide et à la température ambiante. Cette méthode a été développée par Ardenkjaer-Larsen et ses collègues en 2003 et est connue sous le nom de polarisation nucléaire dynamique par dissolution (D-DNP). Elle peut fournir une amplification du signal d'un facteur jusqu'à quatre ordres de grandeur. La combinaison de la D-DNP avec les techniques de CP peut être utilisée pour créer des états de longue durée de vie (LLS) dans des molécules deutériées comme l'éthanol-d6 et le DMSO-d6. Ces états peuvent avoir des durées de vie beaucoup plus longues que l'aimantation conventionnelle de Zeeman. Ces états peuvent être détectés indirectement via des multiplets asymétriques dans les spectres RMN du carbone-13 en solution, à température ambiante après dissolution, via les couplages scalaires entre le carbone-13 et les noyaux du deutérium. Ces LLS résultent du déséquilibre des populations entre les représentations irréductibles des groupes de symétrie des molécules deutériées étudiées. Dans cette thèse, nous avons étudié les LLS dans les groupes CD₂ et CD₃. Les durées de vie de ces LLS peuvent dépasser les temps de relaxation T₁(²H) des noyaux de deutérium par un facteur jusqu'à 20 (dépendant de la dynamique moléculaire) et peuvent être observées par la décroissance de l'asymétrie du multiplet du carbone-13. Ces observations peuvent élargir les applications de la DNP en ajoutant le noyau de ²H à la liste des observables possibles / Nowadays, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) has become an inevitable spectroscopic technique that can be applied in many fields of science and medicine. However it is limited by low sensitivity due to the low nuclear polarization, defined by the difference of populations between the energy levels involved, thus leading to long experimental times. This drawback can be overcome by using the huge polarization of unpaired electrons compared to nuclear spins and its transfer to nuclear spins at low temperatures (using microwave irradiation) to achieve a large nuclear magnetization - a method know as dynamic nuclear polarization (DNP). Sami Jannin and co-workers have recently combined the cross-polarization (CP) method with DNP at very low temperatures to polarize low γ nuclei faster by transferring the electron polarization to protons and then to low γ nuclei like ¹³C. This thesis demonstrates that the efficiency of the CP method can be improved by switching the microwave irradiation off for a few hundred milliseconds prior to CP. By performing these microwave gating experiments, ¹³C polarizations for sodium [1-¹³C]acetate as high as 64% could be achieved with a polarization build-up time constant as short as 160 s. The hyperpolarized sample can subsequently be rapidly dissolved to achieve NMR signal enhancement in the liquid state at ambient temperature. This method has been developed by Ardenkjaer-Larsen and co-workers in 2003 and became known as dissolution-dynamic nuclear polarization (D-DNP). It can provide signal enhancements by a factor of up to four orders of magnitude in liquid state at room temperature. Combining D-DNP with CP techniques from ¹H to ¹³C can be used to create to create long-lived states (LLS) in deuterated molecules like ethanol-d₆ and DMSO-d₆, which can have much longer life times than conventional Zeeman magnetization. These LLS can be detected indirectly via the asymmetric multiplets in ¹³C NMR spectra in solution state at room temperature after dissolution due to scalar couplings between ¹³C and ²H. These LLS result from population imbalances between spin manifolds of distinct irreducible representations of the relevant symmetry groups of the investigated deuterated moities. In this thesis we have investigated LLS in CD₂ and CD₃ groups. Lifetimes of these LLS can exceed the spin-lattice relaxation times T₁(²H) of deuterium nuclei by a factor up to 20 (depending on the underlying molecular dynamics) and can be obtained by monitoring the decay of the asymmetry of the ¹³C multiplet. These observations can expend the scope of DNP by adding ²H nucleus to the list of possible observables.

Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

L'une des voies principales du métabolisme cellulaire est la voie des Pentoses Phosphates (PPP). Cette voie métabolique est composée de deux cascades enzymatiques, une voie oxydative et une voie non oxydative. La voie oxydative de la PPP produit un cofacteur, le NADPH, qui est responsable du processus de détoxification de la cellule par son activité réductrice et un précurseur de diverses biosynthèses comme la lipogenèse. Un dysfonctionnement des trois enzymes qui composent cette étape de la PPP peut engendrer la mort cellulaire. Grâce à une nouvelle technique, la Polarisation Dynamique Nucléaire suivie par Dissolution (D-DNP), qui permet d’obtenir un gain de sensibilité par un facteur > 10 000, la quantification des paramètres cinétique dans les conditions physiologiques in cell est possible.Dans ce travail de thèse, nous utilisons un nouveau modèle de quantification des paramètres cinétiques qui offre la possibilité d’étudier une cascade enzymatique composée de 3 enzymes par D-DNP. Grâce à ces expériences, la sélectivité de la première enzyme de la voie oxydative, la G6PD, pour l’un des deux anomères de glucose-6-phosphate, ainsi que le rôle antioxydant de la deuxième enzyme de la PPP, la 6PGL, ont été observés. Pour réaliser ces études, une méthode de synthèse et de purification des différents substrats de chaque enzyme a été développée. Le tout premier inhibiteur de la 6PGL a été testé. Des études préliminaires réalisées sur des Trypanosoma brucei, parasite responsable de la maladie du sommeil, indiquent que la pénétration du glucose dans les cellules est l'étape cinétiquement limitante pour sa conversion enzymatique. / The Pentose Phosphate Pathway (PPP) is one of the main pathways of cellular metabolism. This metabolic pathway is composed of two enzymatic cascades: one is an oxidative pathway, and the other is non-oxidative. The oxidative branch of PPP produces a cofactor, NADPH, which is responsible for the detoxification process of the cell due to its reducing activity, and is also a precursor of various biosynthesis such as lipogenesis. A dysfunction of one of the three enzymes that make up this step of PPP can lead to cell death. Thanks to a new method, Dissolution Dynamic Nuclear Polarization (D-DNP), which features a sensitivity gain by a factor 10,000 compared to standard liquid-state NMR, the quantification of kinetic parameters under physiological conditions, in cell, becomes possible.In this thesis, we add to the scientific library a new model of quantification of kinetic parameters, and the possibility of studying an enzymatic cascade composed of 3 enzymes by D-DNP measurements. Based on these experiments, the selectivity of the first enzyme in the oxidative pathway, G6PD, for one of the two glucose-6-phosphate anomers, was confirmed. The antioxidant role of the second PPP enzyme, 6PGL, was equally studied. To carry out these studies, a method of synthesis and purification of the different substrates of each enzyme has been developed. The very first inhibitor of 6PGL has also been tested. Preliminary experiments on Trypanosoma brucei, a parasite responsible for sleeping sickness, indicate that glucose penetration inside cells is the limiting kinetic step for its conversion.

Les protéines membranaires en hélices alpha forment le tiers des protéines codées par notre génome. D’autres protéines membranaires sont formées typiquement de feuillets bêta. Leur fonction varie de la formation de pores, la transmission de signaux à l’activité antibiotique. Elles sont aussi capables de transporter de larges cargos comme les protéines ou les acides nucléiques au travers de la membrane. Récemment, les peptides ont émergé comme un moyen prometteur pour le transport de médicaments vers leurs cibles.Les protéines membranaires peuvent être synthétisées chimiquement ou exprimées et marquées isotopiquement dans les bactéries, isolées, purifiées et reconstituées dans les bicouches lipidiques hydratées. Elles présentent une variété de configurations en interagissant avec ces bicouches lipidiques. Ceci dépend de la composition et de l’épaisseur de ces bicouches. L’orientation des bicouches lipidiques est maintenue mécaniquement en les disposant entre des plaques de verre. La RMN du solide des échantillons orientés est un des moyens possibles pour accéder à la topologie des peptides associés à des membranes phospholipidiques. Les échantillons sont difficiles à exprimer dans les bactéries en grande quantités et possède une solubilité réduite en dehors des membranes. En outre leur taille est trop importante pour la RMN du liquide et il est difficile de les cristalliser. Un des inconvénients majeur de la spectroscopie RMN est sa faible sensibilité. Cela résulte du faible moment magnétique nucléaire qui résulte en un décalage Zeeman faible et donc une polarisation réduite. Par ailleurs, l’intensité du signal RMN dépend de plusieurs facteurs comme la quantité d’échantillon la polarisation et le champ magnétique B0. Et le temps d’acquisition de certaines expériences peut être très long. Le but de ce projet est d’obtenir plus de signal des protéines membranaires. Dès lors, nous avons développé une cryosonde DNP (dynamic nuclear polarization) / RMN du solide. La DNP est une technique ingénieuse qui est utilisée pour le transfert de polarisation des noyaux hautement polarisés à des noyaux moins polarisés par irradiation microonde. Les microondes vont exister sélectivement les électrons qui transfèreront leur polarisation à l’ensemble des protons voisins, le signal proton peut ainsi être augmenté de 660 fois.Pour cela la cryosonde DNP RMN du solide qui opère à 100 K et 9,4 T a été utilisée. Une sonde est la pièce mécanique qui maintient l’échantillon dans le centre magnétique de l’aimant du spectromètre. C’est une antenne modulable qui irradie et détecte des champs radiofréquence. La pièce centrale de la sonde est une bobine solénoïdale ou une bobine en forme de selle enveloppant l’échantillon. La faisabilité de ces expériences DNP a été validée sur les échantillons orientés en rotation à l’angle magique. Ces expériences ont été menées sur des échantillons enroulés dans un rotor. Même si leur orientation par rapport au champ magnétique B0 est perdue, une valeur d’augmentation de 17 a été obtenue.[...] / Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]