La dysplasie bronchopulmonaire (DBP) constitue la principale séquelle respiratoire de la prématurité. Elle est caractérisée par des altérations du développement alvéolaire et est définie cliniquement par la persistance d'une oxygénodépendance à 36 semaines d'âge corrigé. Malgré l'amélioration constante des soins en néonatologie, la DBP reste relativement fréquente chez les prématurés de moins de 1000g, et aucun traitement préventif ou curatif véritablement efficace n'existe à l'heure actuelle. Une susceptibilité génétique à la DBP a été démontrée il y quelques années. L'identification de gènes de susceptibilité permettrait non seulement de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie, mais également de dégager de nouvelles pistes thérapeutiques. Les études disponibles sont basées sur une approche gène candidat, le plus souvent sur un nombre limité de sujets, et aucune d'entre elles n'a pu être répliquée dans d'autres populations. Nous avons donc décidé de réaliser une étude d'association pan-génomique à la recherche de gènes de susceptiblité à la DBP.Cette étude multicentrique a permis la constitution prospective d'une base de données cliniques et biologiques et d'une banque d'ADN de nouveau-nés prématurés de moins de 28 SA. L'étape de screening pan-génomique a été réalisée par une stratégie de DNA pooling dans deux populations ethniques différentes, et la validation par génotypage individuel dans deux populations de réplication. Les gènes sélectionnés ont ensuite été étudiés au cours du développement pulmonaire chez le rat.L'ensemble de la démarche pan-génomique a permis d'identifier un gène majeur, commun à l'ensemble des populations étudiées: SPOCK2. Notre étude a également permis d'identifier MMP16 comme gène de susceptibilité à partir des premiers résultats du DNA pooling dans la population caucasienne. L'étude de ces deux gènes au cours du développement pulmonaire chez le rat nous oriente fortement vers un rôle au cours du développement alvéolaire, avec un pic d'expression au cours de l'alvéolisation et une altération de cette expression dans le modèle hyperoxie. De plus, SPOCK2 et MMP16 appartiennent à une voie de signalisation commune, ce point renforçant fortement la crédibilité du rôle de ces gènes dans la susceptibilité à la DBP. Le rôle exact de ces gènes dans l'alvéolisation et la DBP reste à déterminer ainsi que les conséquences fonctionnelles potentielles des polymorphismes identifiés. Parallèlement, la collecte de nouveaux échantillons d'ADN chez des anciens prématurés ainsi que la collaboration avec des équipes étrangères permettra de poursuivre les études d'association dans des populations de plus en plus importantes / RationaleBronchopulmonary dysplasia is the most common chronic respiratory disease in prematureinfants. Genetic factors might contribute to bronchopulmonary dysplasia susceptibility.ObjectivesTo identify genetic variants involved in bronchopulmonary dysplasia through a genome-wideassociation study.MethodsWe prospectively evaluated 418 premature neonates (gestational age below 28 weeks), ofwhom 22% developed bronchopulmonary dysplasia. Two discovery series were created, usinga DNA pooling strategy in neonates from Caucasian and African ancestry. Polymorphismsassociated with the disease were confirmed in an independent replication population. Geneswere then explored by fine mapping and associations were replicated in an external Finnishpopulation of 213 neonates. Validated genes expression patterns were studied in rat lung,following air or hyperoxia exposure.Measurements and Main ResultsSPOCK2 gene was identified by both discovery series. The most significant polymorphism(rs1245560, p=1.66x10-7) was confirmed by individual genotyping, and in the replicationpopulation (p=0.002). Fine mapping confirmed the association of rs1245560 withbronchopulmonary dysplasia in both Caucasian and African populations with adjusted oddsratios of 2.96 (95% CI [1.37-6.40]) and 4.87 [1.88-12.63] respectively. In Caucasian neonates,rs1049269 was also associated with the disease (OR=3.21 [1.51-6.82]). These associationswere replicated in the Finnish population. In newborn rat lungs, SPOCK2 mRNA levelsmarkedly increased during the alveolar stage of lung development. After rat exposure tohyperoxia, SPOCK2 expression increased relative to air-exposed controls

Afin de mettre en évidence des signes génétiques et moléculaires d'irréversibilité de lésions prénéoplasiques bronchiques, pouvant améliorer le dépistage, la surveillance et la chimioprévention de patients fumeurs à risque, nous avons démontré la valeur prédictive de l'accumulation d'anomalies moléculaires dans les lésions prénéoplasiques et observé dans ces lésions une compétition sur leurs récepteurs communs les neuropilines 1 et 2 entre la Sémaphorine 3F, perdue précocement et dont le gène est un candidat suppresseur de tumeur proapoptotique, et VEGF, impliqué dans la progression et la migration tumorale, exprimé de façon croissante dans les lésions dysplasiques. Par ailleurs, la télomèrase, enzyme permettant le maintien de la taille des télomères et donc l'acquisition de l'immortalité, est ré exprimée précocement en réponse au raccourcissement télomérique et de façon croissante dans les dysplasies, parallèlement à l'inactivation des verrous du cycle cellulaire p16/Rb et p53.

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Th. Méd.--Nancy 1, 1983. N°: 96.

Le développement du traitement endoscopique des états précancéreux et cancers superficiels de l’œsophage, qui constitue une option alternative à faible risque opératoire au traitement chirurgical, se heurte à la problématique de la cicatrisation œsophagienne. En effet, les résections étendues de la muqueuse œsophagienne se compliquent de sténoses cicatricielles réfractaires. Les voies de prévention de la sténose œsophagienne impliquent la protection de la plaie, l’opposition aux mécanismes de l’inflammation et de la fibrose, la promotion de la réparation épithéliale, ou encore l’application d’une contrainte mécanique sur la paroi de l’œsophage au cours de la cicatrisation. Au cours d’un premier travail, nous avons évalué, sur un modèle porcin de sténose œsophagienne post-endoscopique que nous avons développé, l’apport de la membrane amniotique humaine (MAH) en tant qu’agent protecteur, mais aussi anti-fibrosant, régénératif, appliqué au moyen de prothèses œsophagiennes. Nous avons mis en évidence un effet de la MAH à J14 en termes de taux de sténose, cependant transitoire en raison du manque de stabilité des prothèses œsophagiennes et de la dégradation de la MAH dans l’œsophage. Au cours d’un second travail, nous avons évalué sur le même modèle l’apport d’une poudre hémostatique minérale appliquée de façon itérative sur la zone de résection au cours de la première semaine. Ce traitement a permis d’améliorer significativement les paramètres histologiques (épaisseur du tissu de granulation, de la fibrose, longueur du néoépithélium) et biologiques (taux sérique de TGF-β) de la cicatrisation œsophagienne, cependant sans traduction sur le taux de sténose œsophagienne à J14. Au cours d’un troisième travail, nous avons évalué une matrice protéique formée d’un peptide autoassemblé (SAP) pour la couverture de la plaie œsophagienne, toujours dans le même modèle. Ce traitement a permis de diviser par deux le taux de sténose à J14, sans cependant que les résultats soient durables, 100% des animaux ayant développé des sténoses à J28. Au cours d’un quatrième travail, nous avons évalué chez 40 patients la faisabilité et les performances de la réalisation en un seul temps endoscopique d’une résection endoscopique par mucosectomie d’une lésion suspecte d’adénocarcinome, et de l’ablation par radiofréquence de l’œsophage de Barrett résiduel. Nous avons observé une bonne efficacité de cette approche, permettant une procédure en un seul temps endoscopique chez près de la moitié des patients, et des taux d’éradication de la néoplasie et de la métaplasie intestinale de 95% après 19 mois de suivi. Cependant, cette approche était limitée par un taux de sténose de 33%. Au cours d’un cinquième travail, nous avons étudié rétrospectivement chez 35 patients les résultats de la dissection sous-muqueuse œsophagienne (ESD) dans le traitement de l’adénocarcinome œsophagien. Les résultats, avec un taux de résection R0 de 72% se réduisant à 66% de résection curative en tenant compte des facteurs histopronostiques défavorables, suggèrent qu’une amélioration de l’endoscopie diagnostique était nécessaire afin de mieux sélectionner les patients pouvant bénéficier de ce traitement. Le taux de sténoses cicatricielles de 6% était en revanche modéré dans cette série d’exérèses généralement non circulaires laissant souvent en place une muqueuse dysplasique. L’ensemble de ces résultats suggère que la problématique de la sténose cicatricielle reste majeure dans la résection endoscopique des cancers superficiels de l’œsophage. Les approches protectrices de prévention de la sténose sont limitées par le manque de stabilité des produits employés sur la plaie œsophagienne. Des travaux mécanistiques sont nécessaires, afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques spécifiques de la fibrose œsophagienne. / No abstract

Tumoren der Mundhöhle und der Lippen sind laut Angaben der Internationalen Agen-tur für Krebsforschung (IARC) ursächlich für jährlich circa 150.000 Sterbefälle welt-weit. Über 90 % der Tumoren sind orale Plattenepithelkarzinome. Diese entstehen zum Großteil aus oralen potentiell malignen Veränderungen, wie Leukoplakien, Erythroplakien und dem oralen Lichen planus. Eine frühe Diagnostik der malignen Transformation dieser Vorläuferläsionen bietet eine gute Möglichkeit die Erkrankung besser zu behandeln und die Mortalität zu senken. Ziel dieser Arbeit ist es, das VELscope®-Gerät, das basierend auf Autofluoreszenz zur vereinfachten und frühen Diagnostik entwickelt wurde, im Rahmen einer klini-schen Anwendung in einer unselektierten Patientenpopulation ohne Risikofaktoren zu beurteilen. Zudem soll beurteilt werden, inwieweit das Gerät geeignet ist, um einem allgemein tätigen Zahnarzt als Hilfsmittel zur Entscheidungsfindung bei verdächtigen Schleimhautläsionen zu dienen und inwieweit dafür eine Einteilung des Fluoreszenzverlustes in verschiedene Stufen von Vorteil sein kann. Es wurden dazu 483 Patienten mittels VELscope®-Gerät untersucht. Die Ergebnisse für die Diagnostik von Mundhöhlenkarzinomen liegen bei einer Sensitivität von 100 % (95 % KI: 29,24 % - 100 %) und einer Spezifität von 52 % (95 % KI: 47,92 % - 57,04 %). Bei einer abgestuften Einschätzung werden geringgradige Fluoreszenzverluste als negatives Ergebnis gewertet. Dabei sinkt die Sensitivität auf 66,7 % (95 % KI: 9,43 – 99,16 %) und die Spezifität steigt auf 70,6 % (95 % KI: 66,33 % - 73,67 %). Durch die geringe Spezifität und die bei Abstufung eingeschränkte Sensitivität sind die Autofluoreszenz und deren Quantifizierung vorerst nicht für den Gebrauch beim allgemein tätigen Zahnarzt zu empfehlen.

La Dysplasie Epithéliale Intestinale (DEI) est une maladie intestinale rare chez l'homme qui a récemment été liée à des mutations des gènes EPCAM et SPINT2. Peu de données sont disponibles pour ces deux gènes, principalement étudiés comme marqueurs du cancer. Le but de ma Thèse était d'identifier les défauts cellulaires induits par l'inactivation de ces gènes et de comprendre les fonctions d’EpCAM et de Spint2dans les entérocytes. Matériel et méthode : Nous avons utilisé comme modèle des cultures cellulaires de cellules Caco2‐BBe stablement inactivées pour EpCAM ou pour Spint2, en utilisant la stratégie shRNA, en comparaison avec les biopsies intestinales de patients DEI, mutés pour l'un ou l'autre gène. J'ai analysé par microscopie électronique,microscopie confocale ou vidéo microscopie, différents marqueurs, et étudié ces cellules sur des modèles 3Dtrès novateurs développés dans notre laboratoire.Résultats: Notre étude a mis en évidence que EpCAM est un acteur clé dans le maintien de l'organisation entérocytaire apico‐basale. Son inactivation conduit à une hyperactivation majeure de l'actomyosine focalisée sur les sommets tricellulaires, entraînant une profonde perturbation de l'organisation cellulaire globale. Les inhibiteurs de la myosine II restaurent l'organisation cellulaire normale. L'étude de Spint2 vient de commencer,mais il semble que l'inactivation de Spint2 conduit à la perturbation de l'adhésion cellulaire en relation avec desdéfauts dans la fin de la division cellulaire à l'étape de la cytocinèse. Cette hypothèse nécessite des analyses complémentaires afin de confirmer ces résultats, les compléter et préciser le mécanisme impliqué.Conclusion: Au cours de ma thèse, j'ai dévoilé de nouvelles fonctions d'EpCAM, et en soupçonne d'autres pour Spint2. Nos résultats devraient aider la recherche de traitements pour ces malades. Les données devraient non seulement servir la cause de la DEI mais également aider les biologistes cellulaires de l'intestin et la recherche sur le cancer. / Congenital Tufting Enteropathy is a rare human intestinal disease that has recently been ascribed tomutations in EPCAM and SPINT2. Few data were available for both, mainly studied as cancer markers. Thepurpose of my thesis was to identify cell defects induced by the inactivation of these genes and to understand EpCAM and Spint2 functions in enterocytes. Materiel & Method : The model used was cell culture of Caco2‐BBe cells stably inactivated for EpCAM or for Spint2 using shRNA strategy, in comparison with intestinal biopsies from patients mutated for either one or theother gene. I analysed by electron microscopy, confocal, or video microscopy different markers. Moreover, Istudied the cells on very novative 3D patterns developped in the laboratory. Results : My studies highlighted that EpCAM is a key player in maintenance of enterocyte apico‐basalorganization. Its inactivation leads to major actomyosin hyperactivation focused in tricellular vertices resulting in tremendous perturbation of the global cell organization. Inhibitors of myosin‐II rescued the normal cellorganization. The Spint2 study has just started, but it seems that Spint2 inactivation leads to cell adhesionperturabtion in relationship with defects in finishing cell division at the cytokinesis step. This hypothesis needs further analyses to be confirmed and to precise the involved mechanism. Conclusion : During my thesis I unraveled new functions of EpCAM, suspected others for Spint2, and have progressed in the seeking of treatments. The data should not only serve the cause of CTE, but also should help members of intestinal biology and cancer research.

Introduction : l'analyse histopathologique des pièces d'annexectomie prophylactique(pBSO) pour risque génétique (mutations BRCA) a pu révéler des anomalies cytologiques etarchitecturales interprétées comme potentiellement pré-cancéreuses et dénommées " dysplasieovarienne et tubaire ". Nous proposons d'étudier les aspects morphologiques,immunohistochimiques et moléculaires des dysplasies tubo-ovariennes.Matériels & Méthodes : l'analyse morphologique a été réalisée dans un premier grouped'annexectomies après stimulation de l'ovulation (protocole de Fécondation in vitro).L'évaluation morphologique et immunohistochimique (expression de Ki67, p53, Bcl2, PAX2et ALDH1) a par la suite concerné 111pBSO, 42 annexectomies exposées au Tamoxifène et116 témoins non cancéreux et spontanément fertiles (nBSO). Les analyses ont été réaliséespar deux pathologistes en aveugle. Les cellules épithéliales d'intérêt ovariennes et tubairesprovenant du groupe pBSO ont été microdisséquées par laser ; l'ADN extrait a été étudié parhybridation génomique comparative (CGH array). La longueur des télomères a été évaluéepar PCR quantitative en temps réel.Résultats : les scores moyens de dysplasie ovarienne et tubaire étaient significativement plusélevés dans les groupes stimulation de l'ovulation et génétique par rapport aux témoins. Seulle score de dysplasie tubaire était supérieur aux témoins pour le groupe Tamoxifène. Onretrouvait une surexpression de ALDH1 dans les groupes pBSO et tBSO alors que Ki67, p53,bcl2 et PAX2 étaient faiblement exprimés dans les groupes pBSO et tBSO. D'ailleurs,l'expression d'ALDH1 était faible dans l'épithélium non dysplasique, forte dans la dysplasieet constamment faible dans les carcinomes occultes. De subtiles altérations génomiques et desraccourcissements télomériques ont été mis en évidence au niveau des dysplasies génétiques.Conclusions : les scores élevés de dysplasie, la forte expression d'ALDH1 et les altérationsmoléculaires provenant du groupe à risque génétique pourraient supporter le conceptd'instabilité génétique. La dysplasie tubo-ovarienne pourrait être une étape importante etprécoce de la carcinogenèse ovarienne. Nos résultats suggèrent également qu'un certainnombre de cancers de l'ovaire pourrait avoir pour origine la trompe de Fallope. Le marqueurde cellules souches ALDH1 pourrait constituer une cible dans la prévention et le diagnosticprécoce des cancers de l'ovaire.

Mon travail de thèse porte sur les épilepsies focales avec ou sans malformations cérébrales de type dysplasie corticale focale. Il s'articule autour de (1) une étude fonctionnelle et génétique sur tissu cérébral postopératoire humain et (2) la caractérisation d'un nouveau modèle génétique chez l'animal. Tout d'abord, des mutations germinales hétérozygotes perte de fonction ont été identifiées dans DEPDC5, NPRL2 et NPRL3 qui codent pour le complexe GATOR1, un inhibiteur du complexe 1 de mTOR (mTORC1). Par la suite, des mutations somatiques cérébrales gain de fonction ont été identifiées dans MTOR. Nous avons émis l'hypothèse que ces mutations entrainent une hyperactivité de mTORC1, responsable des malformations cérébrales et de l'épilepsie des patients. J'ai observé une hyperactivité de mTORC1 dans les cellules cytomégaliques obtenues à partir de tissu cérébral post-opératoire de patients porteurs de mutations dans les gènes de GATOR1 ou MTOR. En parallèle, la caractérisation du premier modèle KO de Depdc5 a montré que les rats Depdc5+/- présentent des anomalies corticales rappelant celles des patients : délamination des couches corticales et cellules cytomégaliques avec une hyperactivité de mTORC1. Ce phénotype est prévenu par l'injection de rapamycine, un inhibiteur spécifique de mTORC1. Une susceptibilité accrue aux crises épileptiques induites par le pentylènetétrazole ainsi qu'un défaut des propriétés neuronales passives et actives ont été rapportés chez les rats Depdc5+/-. En conclusion, mes travaux de thèse ont contribué à mettre en évidence l'implication de la voie GATOR1-mTORC1 dans les épilepsies et dysplasies corticales focales. / In my PhD thesis work, I investigated focal epilepsies with and without brain malformations such as focal cortical dysplasia. I focused on two complementary aspects: (1) genetics and functional studies on human tissue samples and (2) characterization of a novel genetic animal model. First, germline heterozygous loss-of-function mutations were identified in DEPDC5, NPRL2 and NPRL3 genes that encode proteins which together form the GATOR1 complex, a repressor of the mTOR complex 1 (mTORC1). Additionally, brain somatic gain-of- function mutations were identified in MTOR gene that encodes mTOR itself. Both types of mutations are thought to lead to mTORC1 hyperactivity, and cause brain malformation and epilepsy in patients. To test this hypothesis, mTORC1 activity was monitored on post-operative brain tissue from patients carrying GATOR1 or mTOR genes mutations. Cytomegalic cells with mTORC1 hyperactivity were observed. Besides, the characterization of the first Depdc5 KO model revealed that Depdc5+/- rats present cortical structural abnormalities reminiscent of patient histopathology hallmarks: cortical layer dyslamination and cytomegalic cells with increased mTORC1 activity. This phenotype was prevented by rapamycin injection, a specific mTORC1 inhibitor. An increased susceptibility to pentylenetetrazol-induced epileptic seizures, as well as impaired passive and active neuronal properties were observed in Depdc5+/- rats compared to Depdc5+/+ rats. In conclusion, my PhD work largely contributed to emphasize the prominent role of the GATOR1-mTORC1 pathway in focal cortical dysplasia and epilepsies.

Les papillomavirus humains (VPHs) sont reconnus comme les agents étiologiques du cancer du col de l’utérus. Notre étude a pour but de décrire le polymorphisme de la région régulatrice virale (LCR) et du gène E6 du VPH52 chez 216 femmes canadiennes avec différents grades de lésion du col et d’établir s’il existe une association entre les variantes décrites et la présence de lésions intraépithéliales de haut-grade (CIN2,3) du col de l’utérus ou de cancer invasif. L’âge (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005) fut significativement associé à la présence de cancer invasif. Une variante de la région régulatrice virale, MTL-52-LCR-02, présentant une substitution nucléotidique au niveau du nucléotide 7436, fut aussi associée à la présence de cancer du col de l’utérus (p=0.015). Dans une analyse multivariée, après ajustement pour l’âge, l’ethnicité et le site de recrutement, une délétion au niveau du nucléotide 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9) ainsi qu’une substitution au niveau du nucléotide 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.1-61.0) du LCR, et la variante K93R de la protéine E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) furent associées de façon significative avec la présence de CIN2,3. Ainsi, le polymorphisme du LCR et du gène E6 du VPH52 est associé avec la présence de CIN2,3 et probablement avec celle d’un cancer invasif. / Human papillomaviruses (HPVs) are the main etiological agents of cervical cancer. Our study aims to describe HPV52 polymorphism in the long control region (LCR) and in the E6 gene, and to investigate the association between LCR and E6 polymorphism and high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2,3) or invasive cervical cancer in 216 canadian women with various grades of cervical disease. Age was significantly associated with cervical cancer (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005). The MTL-52-LCR-02 variant, with a nucleotide substitution in the LCR at position 7436, was also associated with cervical cancer. MTL-52-LCR-02 has been identified in 28.6% of women with cervical cancer and in 0.0% of women without cervical cancer or CIN2,3 (p=0.015). In a multivariate analysis, after adjusting for age, ethnicity, detection of HPV16 or 18, and study site, a deletion at nucleotide position 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9), a variation at nucleotide position 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.-61.0) in the LCR and the K93R variant of the protein E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) were associated with CIN2,3. This study confirms that HPV52 polymorphism in the LCR and in the E6 gene is associated with risk of development of CIN2,3 and possibly invasive cancer of the uterine cervix.