Les complexes PRC1 et PRC2 contrôlent l’expression génique via l’organisation de la structure de la chromatine. Ce contrôle se fait par l’ajout de la marque H2AK119ub1 par le PRC1 et l’ajout de la marque H3K27me3 par le PRC2. Cette étude s’attache à étudier le rôle de la protéine Pcgf1 (membre du complexe PRC1) et de la protéine Ezh2 (membre du complexe PRC2) lors du développement du poisson-zèbre. Les gènes sont inactivés par TALEN. Le complexe PRC1 est formé par différentes protéines dont les Pcgf. Il existe de nombreux homologues Pcgf qui ont des fonctions distinctes. Cette étude s’intéresse au rôle de la protéine Pcgf1 lors du développement du poisson-zèbre. Les individus pcgf1-/- sont viables et fertiles. Cependant, leur développement précoce est retardé et les adultes montrent des signes de vieillissement accéléré. Ce mutant est le premier modèle de vertébré qui met en évidence le rôle de Pcgf1 dans la prolifération cellulaire lors du développement et son association au vieillissement. La protéine Ezh2 est impliquée dans le devenir cellulaire et la différenciation. Les embryons se développent normalement puis les larves meurent à 12 jours post-fécondation. De façon intéressante, les embryons de poisson-zèbre peuvent gastruler en l’absence d’Ezh2, contrairement au modèle murin. Les organes sont correctement mis en place à 5 jours post-fécondation. Les larves présentent un défaut de maintien de la paroi du bulbe intestinal. La protéine Ezh2 est importante pour le maintien du pancréas exocrine. L’absence d’Ezh2 cause une augmentation importante du nombre de cellules apoptotiques. Ezh2 est essentiel lors de la régénération de la nageoire caudale. / PCR1 and PRC2 are complexes that control gene expression via chromatin structure reorganization. This expression regulation is maintained by adding epigentics marks H2AK119ub1 by the PRC1 and adding of H3K27me3 by the PRC2. The study devotes to study the role of the protein Pcgf1 (part of the PRC1 complex) and of the Ezh2 protein (part of the PRC2 complex) during the zebrafish development. The PRC1 complex is formed by different proteins including Pcgf proteins. There are several Pcgf homologs that have different functions. The study reveals that some Pcgf proteins have a different expression during caudal fin regeneration and development. We are interested in Pcgf1 protein during the zebrafish development. The pcgf1 gene was inactivated by using TALEN. The fish pcgf1-/- are viable and fertile. However, the early development is delayed and adults show signs of accelerated aging. This mutant is the first vertebrate model showing the role of Pcgf1 in cells proliferation during development and aging. Ezh2 protein is involved in cell-fate decisions and differenciation. Inactivation of ezh2 gene by TALEN reveals the essential role of Ezh2 during development. Indeed, at the beginning embryos develop normally then larvae die at 12 days post-fertilization. Interestingly, zebrafish embryo can gastrulate without Ezh2. This contradicts with observations in mouse model. The organs are properly formed at 5 days postfertilization. Larvae show defects in the intestinal bulb wall. Ezh2 is important for exocrine pancreas maintenance. The absence of Ezh2 causes an increase in apoptic cells. Ezh2 is essential during caudale fin regeneration.

Les cellules dendritiques (DC) sont une charnière entre immunité innée et adaptative. Les DC du sous-type CD8a+ excellent à la présentation croisée d’antigènes exogènes pour activer les lymphocytes T (LT) CD8+. Mon projet de thèse consistait à analyser la contribution de gènes sélectivement exprimés par les DC CD8a+ à leur spécialisation fonctionnelle. Nous avons d’abord analysé le rôle du récepteur de chimiokine XCR1 que les DC CD8a;+ expriment spécifiquement. XCR1 reconnait XCL1, une chimiokine qui a un pouvoir attractant sur les DC CD8a+ in vitro, et qui est exprimée par les cellules NK, les lymphocytes innés de type 1 et les LT CD8+ activés. Nous avons montré que XCR1 était indispensable à l’hôte pour résister à une infection par le cytomégalovirus murin, en permettant l’activation optimale des cellules NK. L’axe XCL1-XCR1 est donc un moyen privilégié de communication entre les cellules NK et les DC CD8a+. Ensuite, nous avons utilisé un modèle murin ciblant spécifiquement les DC CD8a+ pour montrer leur rôle majeur dans la réactivation des LT CD8+ mémoires au cours d’infections secondaires. Enfin, nous avons tenté d’analyser si une autre molécule préférentiellement exprimée par les DC CD8a+, la GTPase Rab7b, était impliquée dans la présentation croisée des antigènes. Dans d’autres cellules, Rab7b interviendrait dans l’échange de matériel entre le réseau trans-Golgien et les endosomes tardifs. Dans les DC CD8a+, cette activité pourrait favoriser le trafic intracellulaire des antigènes vers les endosomes où s’effectue la présentation croisée. Mon travail de thèse a permis de mieux comprendre comment les DC CD8a+ activent les lymphocytes effecteurs innés et adaptatifs. / Dendritic cells (DC) link innate and adaptive immunity. The CD8α+ DC subtype is particularly efficient in activating CD8+ T cells through cross-presentation of exogenous antigens. The aim of my PhD project was to analyze the role of genes specifically expressed by CD8a+ DC in the functional specialization of these cells. First we investigated the role of the chemokine receptor XCR1 in the biology of CD8a+ DC. In mice, XCR1 is a powerful chemo-attractive molecule for CD8a+ DC in vitro. It recognizes XCL1, a chemokine expressed by NK cells, type 1 innate lymphoid cells, and activated CD8+ T cells. We have shown that XCR1 is crucial for the resistance to murine cytomegalovirus (MCMV) infection, allowing optimal activation of NK cells. Thus, the XCL1-XCR1 axis is a privileged way of communication between NK cells and CD8a+ DC. We then used a mouse model which specifically targets CD8a+ DC, to show their major role in the reactivation of memory CD8+ T cells upon diverse secondary infections. Finally, we tried to investigate the potential role in antigen cross-presentation of another molecule selectively expressed by CD8a+ DC, the Rab7b GTPase. ,. Indeed, in another cell type, Rab7b could be involve in material exchange between the trans-golgi network and late endosomes. In CD8a+ DC, this process could favor the intracellular trafficking of endocytosed antigens towards the endosomes where cross-presentation occurs. In summary, my PhD work advanced our understanding of how CD8a+ DC activate innate and adaptive effector lymphocytes

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) jouent un rôle central dans un processus complexe d'interaction entre les tumeurs et le stroma et favorisent la croissance tumorale. Des preuves émergentes suggèrent que ces fibroblastes sont impliqués dans l'altération de la réponse immune anti-tumorale. Cependant, les mécanismes immuno-modulateurs sous-jacents dépendants de ces fibroblastes ne sont encore que très partiellement définis. Au cours de ma thèse, j’ai mis en évidence que les fibroblastes associés au mélanome diminuent la susceptibilité des cellules tumorales de mélanome à la lyse induite par les cellules Natural killer (NK) par un mécanisme dépendant de la sécrétion de métalloprotéinases matricielles (MMPs) actives. Cette sécrétion de MMPs réduit l'expression de deux ligands du récepteur activateur NKG2D, MICA/B, à la surface des cellules tumorales et diminue par conséquent l'activité cytotoxique des cellules NK dépendante de NKG2D contre les cellules tumorales de mélanome. D’autre part, grâce à une approche génomique globale, mon travail a montré que l’hypoxie au sein du stroma tumoral pourrait augmenter les capacités immuno-modulatrices des CAFs en modifiant l’expression d’un ensemble de gènes qui codent pour des protéines immunosuppressives. L’ensemble de ces résultats démontrent donc que les CAFs sont des déterminants essentiels modifiant la susceptibilité des cellules tumorales aux cellules tueuses mais qu’il existerait également un dialogue entre le microenvironnement hypoxique et les CAFs leur permettant d’augmenter leur potentiel immunosuppresseur. / Cancer-associated fibroblasts (CAF) play a central role in a complex process of interaction between tumors and stroma and promote tumor growth. Emerging evidence suggest that these fibroblasts are involved in the alteration of the anti-tumor immune response. However, the underlying immunomodulatory mechanisms dependent on these fibroblasts are still only partially defined. During my thesis, I demonstrated that melanoma-associated fibroblasts decrease the susceptibility of melanoma tumor cells to Natural killer (NK) cell lysis through a mechanism dependent on the secretion of active matrix metalloproteinases (MMPs). This secretion of MMPs reduces the expression of the two NKG2D ligands, MICA/B at the surface of the tumor cells and consequently decreases the NKG2D-dependent cytotoxic activity of NK cells against melanoma tumor cells. On the other hand, using a global genomic approach, my results suggested that hypoxia within the tumor stroma could increase the immunomodulatory capacities of CAFs by modifying the expression of a set of genes that encode for immunosuppressive proteins. Together, our results show that CAFs are essential determinants modifying the susceptibility of tumor cells to killer cells but that there is also a crosstalk between the hypoxic microenvironment and the CAFs allowing them to increase their immunosuppressive potential.

Les cellules T CD8+ jouent un rôle primordial dans le contrôle des infections virales en limitant la dissémination des cellules infectées. Lors de l’infection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spécifiques ne se différencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectées par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de proliférer ou de produire l’ IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et l’engagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces déficits fonctionnels des cellules T . Le rôle de PD-1 dans la régulation d'évènements transcriptionnels contrôlant la différentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste à démontrer. Id2 joue un rôle central dans la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons émis l’hypothèse que le défaut de maturation observé chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spécifiques (CD8+PD-1hi) au cours de l’infection chronique par le virus HIV pouvait être lié à la diminution d’expression du régulateur Id2. Nous avons ainsi démontré que l'engagement de PD-1 contribuait à une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir l’expression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines à chaine gamma joue un rôle clef dans la survie et l’homéostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons démontré que l’IL-15 était unique grâce à ses capacités de stimulation de l’expression d’Id2 et ses propriétés favorisant la survie ainsi que la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. l’IL-15 induit la prolifération de toutes les populations de cellules T mémoires provenant de donneurs sains. L’addition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur différenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par l’IL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur différenciation. Un test de cytotoxicitié par cytométrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spécifiques par l’IL-15 favorisait l’expression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spécifiques. En conclusion, nous avons pour la première fois dans cette thèse défini les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l’expression du régulateur transcriptionnel Id2 par l’IL-15. Nous avons également révélé comment l’engagement de PD-1 conduisait a une altération de l’expression et de la fonction d’Id2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spécifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que l’IL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer à une meilleure stimulation des réponses immunes favorisant ainsi la réactivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectées de manière latente. / CD8+ T cells play a fundamental role in controlling viral replication and dissemination by killing virus-infected cells. However during chronic HIV infection HIV-specific CD8+ T cells fail to differentiate to functional cytotoxic effector cells and develop functional defects such as loss of IL-2 secretion, decreased proliferation and express high levels of PD-1. Persistent expression of PD-1 and triggering by its ligand results in immune dysfunction; it is not known how PD-1 signaling influences transcriptional events involved in T cell differentiation and effector function. We found that the transcriptional regulator Id2 was downregulated in PD-1hi HIV-specific CD8+ T cells when compared to PD-1low CMV-specific CD8+ T cells from the same HIV-infected donors. Since Id2 has been shown to play a central role during differentiation of effector CD8+T cells, we hypothesized that skewed maturation of the PD-1hi HIV-specific CD8+ T during chronic HIV infection could result from decreased levels of Id2. We found that signals transduction pathways downstream of PD-1 ligation inhibited the expression of Id2; transfection of PD-1hi effector cells from HIV infected individuals with a Tat-Id2 construct could reverse an apoptotic fate associated with the exhausted phenotype. Finally, overexpression of Id2 restored expression of Granzyme-B and Bcl-2 and led to a decreased expression of the T cell maturation marker CD27. Although the extrinsic signals and costimulation needed to activate cell proliferation and effector function are well known, signal-transduction pathways that regulate differentiation of memory cells to effector cells are beginning to be understood. Thechain family of cytokines is essential for the survival and homeostasis of T cells; they have pleiotropic effects on the differentiation of effector and memory virus-specific CD8+ T cells. IL-15 was unique among gamma-chain cytokines in upregulating the expression of Id2 and promoting the survival and differentiation of effector memory CD8+ T cells. IL-15 induced proliferation of all memory subsets from healthy subjects but only induced differentiation, Granzyme-B production, and cytotoxic effector function in CD8+ Ttm and Tem cells. Stimulation of Tcm with IL-15 failed to induce their differentiation; this was associated with their decreased ex vivo levels of IL-15R when compared to Tem and Ttm subsets. Finally, we developed a single cell flow-cytometry cytotoxicity assay, and found that stimulation of CD8+T cells from HIV chronically infected subjects with peptide plus IL-15 induced the differentiation of tetramer+ CD8+ Ttm cells and restored Id2 expression and their cytotoxic activity . Overall, we illustrate in this thesis, for the first time, the molecular mechanisms of effector T cell differentiation mediated by IL-15 and its downstream transcriptional regulator Id2; we reveal how PD-1 engagement leads to alteration of the Id2 pathway leading to decreased effector function of the HIV-specific CD8+ T cells. Immunotherapy with agents such as IL-15 or PD-1 blocking antibody that increase levels of Id2 expression , in combination with HAART, should trigger the functional re-activation of HIV-specific CD8+ T cells and the killing of latently HIV-infected CD4+ T cells.

Les thérapies anti-tumorales se sont considérablement améliorées au cours de la dernière décennie. Toutefois, les traitements utilisés actuellement rencontrent d'importantes limitations, notamment dans le cas de cancers métastatiques, révélant l'urgence de développer de nouvelles approches. Ainsi, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules T représente une approche innovante particulièrement prometteuse. Son principe s'appuie sur l'injection de cellules T autologues spécifiques d'antigènes tumoraux, préalablement manipulées et amplifiées ex vivo, chez des patients rendus lymphopéniques par chimiothérapie et/ou radiothérapie. Toutefois, même si l'état lymphopénique est induit par ces 2 protocoles de conditionnements, leurs effets sur l'environnement de l'hôte ainsi que sur le devenir des cellules T greffées étaient, jusqu'à nos travaux, mal connus. Par le biais de modèles murins, nous avons pu démontrer que le devenir des cellules T diffère après transfert dans des souris irradiées ou traitées par chimiothérapie (Bu/Cy). Ainsi, après transfert dans des animaux irradiés, on observe une prolifération préférentielle des cellules T CD8, dépendante de l'IL-7, est observée alors qu'un transfert chez des souris traitées Bu/Cy se traduit par une prolifération rapide, indépendante de l'IL-7, des cellules T CD4. De plus, ces comportements sont associés à d'importantes modifications de l'environnement généré chez l'hôte. Plus spécifiquement, nous avons démontré, dans les organes lymphoïdes secondaires, que la localisation et la représentation des différentes sous-populations de cellules dendritiques présentes étaient différentiellement modulées par le type de conditionnement utilisé. Par ailleurs, l'élimination spécifique des cellules CD11c+ chez des souris traitées Bu/Cy était accompagnée d'une inhibition importante de la prolifération rapide des cellules T CD4 greffées. L'ensemble de nos travaux montrent que les traitements lymphopéniques génèrent des environnements distincts capables de moduler le devenir des cellules T greffées.Durant ma thèse, nous avons également abordé de façon originale un aspect novateur de l'environnement en étudiant le rôle potentiel des nutriments comme régulateurs métaboliques des fonctions effectrices des cellules T. La glutamine est l'acide aminé le plus abondant du plasma, pouvant contribuer aux besoins bionénergétiques et biosynthétiques des cellules T en prolifération. Nous avons démontré dans nos travaux qu'une carence en glutamine lors de l'activation de cellules T CD4 par leur TCR entrainait un délai dans l'activation de la voie mTOR, une réduction de la production intracellulaire d'ATP aux temps précoces et se traduisait par une diminution de la prolifération. De plus, ces conditions étaient associées à une augmentation de la conversion de cellules CD4 T naïves, via TGFβ, en cellules régulatrices Foxp3+ , y compris en condition de polarization Th1. Par contre, la carence en glutamine n'a pas inhibé la différenciation Th2. Les cellules T Foxp3+ ainsi générées en condition limitante de glutamine présentaient in vivo des fonctions suppressives aussi efficaces que celles des cellules régulatrices nTregs. En effet, elles ont la capacité de bloquer l'induction de la colite provoquée par la greffe de cellules T effectrices dans des souris Rag2-/- . Nos travaux démontrent ainsi que l'environnement métabolique peut être un régulateur clé de la différenciation des cellules T CD4. L'ensemble de mes travaux de thèse ont mis en évidence de nouveaux paramètres capables de potentiellement modifier la survie et la réactivité des cellules T greffées. / Anti-tumor therapies have improved significantly over the decade. However, the currently used treatments have important limitations, notably for metastatic cancers, and the development of new approaches is therefore a high priority. Adoptive T cell therapy (ACT) represents an innovative strategy that has shown much promise. This therapy is based on the infusion of tumor-specific T cells, which have been manipulated and expanded ex vivo, into patients who have been rendered lymphopenic by chemotherapy and/or irradiation. It is interesting to note that while lymphodepletion is attained by the vast majority of conditioning regimens, the effects of these protocols on the host environment and potentially, on the destiny of adoptively-transferred T cells had not been elucidated prior to the studies which we initiated. Using a murine model, we found that the fate of adoptively-transferred T cells differs markedly in mice rendered lymphopenic by sub-lethal irradiation as compared to a busulfan/cyclophosphamide (Bu/Cy) chemotherapy regimen. Irradiation-mediated lymphopenia resulted in a skewed IL-7-dependent proliferation of donor CD8+ T cells, whereas Bu/Cy treatment led to an increased IL-7-independent, rapid CD4+ T cell proliferation. These alterations in T cell proliferation were associated with striking changes in the host microenvironment. More specifically, we demonstrated that the proportion and localization of different dendritic cell (DC) subsets in lymphoid organs were differentially affected by the type of conditioning. Furthermore, we found that these DC controlled the rapid donor CD4+ T cell division detected in Bu/Cy-treated mice as depletion of CD11c+ DC inhibited this proliferation. Altogether, our studies demonstrate that lymphopenic regimens generate distinct host environments which modulate the fate of adoptively-transferred T cells. Durind my PhD, we also investigated an original and novel aspect of the microenvironement by studying the potential role of nutrients as metabolic regulators of T cell effector function. Glutamine is the most abundant amino acid in the plasma and contributes to the bioenergetic and biosynthetic requirements of proliferating T cells. Here, we demonstrated that activation of CD4+ T cells under glutamine-deprived conditions results in a delayed mTOR activation with reduced early ATP production and decreased proliferation. Moreover, these conditions resulted in the conversion of naïve CD4+ T cells into Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). This de novo Treg differentiation occurred even under Th1-polarizing conditions and was TGFβ-dependent. Interestingly, glutamine deprivation did not inhibit Th2 differentiation. Importantly, these converted Foxp3+ T cells showed enhanced in vivo persistence and were highly suppressive, completely protecting Rag-deficient mice from the development of autoimmune inflammatory bowel disease as efficiently as natural-occuring Tregs. Thus, our data reveal the external metabolic environment to be a key regulator of a CD4 T lymphocyte's differentiation. Altogether, the data generated during my PhD provide new insights into the identification of parameters that can potentially alter the survival and reactivity of adoptively-transferred T cells.

Les nématodes à galles (RKN), Meloidogyne spp. sont des petits vers parasites qui infectent les racines des plantes où ils induisent la formation de sites nourriciers. Les RKN sont des endoparasites à large gamme d'hôtes, englobant les principales espèces de plantes cultivées. Meloidogyne javanica, M. graminicola et M. incognita sont les principales espèces parasitant le riz (Oryza sativa). Le succès infectieux des RKN repose sur la production de protéines effecteurs de virulence, secrétées dans leurs glandes oesophagiennes et libérées dans les cellules de la plante hôte par leur stylet. La caractéristique principale des RKN est leur capacité à déréguler des cellules du parenchyme vasculaire pour induire la formation de cellules géantes multinucléées, à haute activité métabolique. Les processus moléculaires sous-jacents restent encore mal connus, alors que l’identification d’effecteurs de virulence et de leurs cibles végétales pourrait fournir de nouvelles perspectives pour le contrôle des RKN. Ainsi, les objectifs de cette étude étaient (1) d’évaluer le rôle de protéines de Meloidogyne sécrétées (MSP) au cours des interactions riz - RKN et (2) d'identifier des cibles des MSP parmi les principales protéines Hub d’Arabidopsis thaliana impliquées dans l'immunité des plantes, afin d'évaluer la fonction putative des MSP dans les cellules hôtes. Pour la première partie de notre étude, nous avons sélectionné trois MSP exprimées dans les glandes oesophagiennes et possiblement sécrétées. L’analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR a montré que MSP2 est fortement exprimé dans les premiers stades du cycle du nématode, tandis que MSP18 et MSP19 sont activés au cours du parasitisme dans les racines du riz. Les essais de localisation subcellulaire dans les cellules d'oignon ont identifié le noyau (pour MSP2) et le cytoplasme (pour MSP7 et MSP18) comme compartiments cellulaires ciblés par les protéines du nématode. Des plants de riz (O. sativa Nipponbare) transgéniques ont été produits pour évaluer le rôle des MSP au cours des interactions riz-RKN. Des lignées de riz surexprimant MSP18 ont permis un taux de reproduction plus élevé de M. javanica et M. graminicola. Au contraire, des retards de développement et de reproduction de M. javanica ont été observés sur des lignées de riz exprimant des micro-RNAs capables de supprimer l’expression des gènes MSP2 ou MSP19. Ces données ont montré que MSP2, MSP18 et MSP19 peuvent être des gènes importants pour le parasitisme ou le développement du nématode. Les tests d'expression transitoire dans le tabac (Nicotiana benthamiana) ont montré que MSP18 peut interférer avec la mort cellulaire programmée déclenchée par INF1, ce qui suggère que MSP18 pourrait supprimer les voies de défense des plantes pour faciliter l’infection. Dans une deuxième partie de ce travail, des analyses systématiques en double-hybride chez la levure ont été menées pour vérifier les interactions protéine-protéine entre 6 MSP et 18 protéines Hub d’A. thaliana. Chez la levure, la protéine du nématode MSP400 interagit avec trois protéines Hub, l’Anaphase-Promoting-complex 8 (At-APC8) et les facteurs de transcription At-TCP14 et At-TCP15. L'interaction physique de MSP400 avec At-APC8, un régulateur clé du cycle cellulaire de la plante, a été confirmée in planta par complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC). Ces résultats démontrent pour la première fois qu'un effecteur de nématode est capable d'interagir directement avec une protéine régulatrice du cycle cellulaire chez la plante, révélant un nouveau mécanisme utilisé par les RKN pour commander la machinerie du cycle de la cellule hôte et induire ainsi la formation du site d'alimentation. Les données obtenues dans cette étude élargissent considérablement notre connaissance des acteurs moléculaires qui contribuent à la pathogénicité des nématodes, mettant en évidence les différents mécanismes exploités par les RKN pour promouvoir la sensibilité des plantes. / Root-knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp. are small parasitic worms that infect plant roots where they induce the formation of highly specialized nutrient feeding sites. RKN are endoparasites with a wide host range encompassing major plant crops, impairing effective specific control. Meloidogyne javanica, M. graminicola, and M. incognita are the principal RKN species responsible for rice (Oryza sativa) production losses. Successful plant infection is likely achieved by nematode effector proteins produced in their esophageal gland cells and released into the host plant cells through their stylet. In particular, one of the striking features of RKN is their ability to deregulate vascular parenchyma cells to induce the formation of multinucleated giant cells with a high metabolic activity in the roots. The molecular processes underlying plant-RKN interactions still remain poorly understood. Identification of nematode virulence effectors and their plant targets may provide new insights for developing control strategies towards RKN. Thus, the aims of this study were to (1) assess the role of Meloidogyne secreted proteins (MSP) in rice – RKN interactions and (2) identify MSP targets among the major Arabidopsis thaliana Hub proteins involved in plant immunity, to assess the putative MSP function into host cells. For the first part of our study, we selected three Meloidogyne-genus specific proteins expressed in esophageal glands and predicted to be secreted. Gene expression analysis by RT-qPCR showed that MSP2 is highly expressed in the early stages of the nematode cycle, while MSP18 and MSP19 are up-regulated during parasitism in rice roots. Subcellular localization assays in onion cells identified the nucleus (for MSP2) and cytoplasm (for MSP7 and MSP18) as the main cellular compartments targeted by nematode proteins. Transgenic rice (O. sativa Nipponbare) plants expressing the MSP cDNAs or artificial micro-RNAs (amiRNAs) able to silence MSP genes were used to assess the role of MSPs during rice-RKN interactions. Homozygous transgenic lines were inoculated with pre-parasitic juveniles (J2) and (i) the number and developmental stage of nematodes present in roots after 21 days, (ii) the number of egg masses laid after 28 days and, (iii) the number of next-generation hatched J2 after 45 days were assessed. Rice lines overexpressing MSP18 allowed a higher reproduction rate of M. javanica and M. graminicola. On the contrary, impaired M. javanica development and reproduction was observed in rice lines expressing amiRNAs against MSP2 or MSP19 genes. These data showed that MSP2, MSP18, and MSP19 genes might be important genes for nematode parasitism or development. Transient expression assays in tobacco (Nicotiana benthamiana) revealed that MSP18 interfered with the INF1-triggered programmed cell death, suggesting that MSP18 could suppress the plant defense pathways to facilitate nematode parasitism. In the second part of this work, systematic yeast-two-hybrid paired assays were conducted to check for protein-protein interactions between 6 MSP and 18 A. thaliana Hub proteins. In yeast, the nematode MSP400 protein interacts with three Hub proteins, the Anaphase-Promoting-Complex 8 (At-APC8) and the transcription factors At-TCP14 and At-TCP15. Physical interaction of MSP400 with At-APC8, a key plant cell cycle regulator, was confirmed in planta by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays. These results demonstrated for the first time that a plant parasitic nematode effector is able to directly interact with a cell cycle regulatory protein, revealing a novel mechanism utilized by RKN to control the host cell cycle machinery and thereby induce feeding site formation. The data obtained in this study significantly broaden our knowledge of the molecular players contributing to nematode pathogenicity, highlighting the different mechanisms exploited by RKN to promote plant susceptibility.

Salmonella est un pathogène intracellulaire dont la virulence dépend de la fonction de deux systèmes de sécrétion du type trois (T3SS). Les T3SSs sont responsables pour la transduction de protéines effectrices dans le cytoplasme de la cellule hôte afin d'initier l'invasion de la cellule et de former la vie intracellulaire de Salmonella. Plusieurs effecteurs forment la SCV et induisent un réseau de tubules qui est impliqué dans la stabilisation de la SCV. Il consiste de trois différents genres de tubules. Nous avons pu montrer que les protéines effectrices SseF et SseG sont responsables pour la formation d'un genre de ces tubules, les LAMP-1 negative tubules (LNTs). Leur fonction est importante puisque des souches de Salmonella qui induisent que des LNTs et ne pas d'autres tubules sont apte de créer une SCV stable. Ceci améliore la réplication et virulence in vivo comparé à des souches qui ne peuvent pas induire des tubules. En utilisant les LNTs comme modèle, nous avons essayé de comprendre la contribution des tubules à la formation de la SCV et aussi leurs interaction avec les endosomes tardives et les lysosomes (LE/lys). Nous avons découvert une contribution essentielle de la petite GTPase Arl8B à la fusion de tubules avec les LE/lys. Ainsi, le knockdown d'Arl8B réduit la capacité de reproduction de Salmonella dans la cellule hôte. Nous avons pu démontrer qu'une interaction entre l'effecteur SifA et Arl8B est responsable pour ces observations. / Salmonella is an intracellular pathogen, whose virulence relies on the function of two type three secretion systems (T3SSs). The T3SSs are responsible for the delivery of effector proteins into the host cell cytoplasm in order to mediate invasion of the cell and to shape Salmonella's intracellular life.Salmonella's intracellular survival and replication depends on its niche, the Salmonella containing vacuole (SCV), a compartment that is derived from host plasma membrane. Several effectors shape the SCV and give rise to a tubular network, which is implicated in the SCV's stabilization and consists of three different kinds of tubules. We were able to show that the effector proteins SseF and SseG play in concert to form one kind of tubules, the recently discovered LAMP-1-negative tubules (LNTs). Their function is important to Salmonella, as strains having only LNTs but none of the other tubules are able to create a stable SCV, which leads to better replication and virulence in vivo compared to a strain that lacks in tubule formation. Starting from these LNTs as working model, we tried to understand the contribution of tubules to the formation of the SCV and their interactions with the late endosomal / lysosomal compartment (LE/lys). We deciphered the small GTPase Arl8B to play an essential role in the fusion of tubules with LE/lys. Thereby, the knockdown of Arl8B reduced Salmonella's capability to replicate within host cells. We were able to show that an interaction between the effector SifA and Arl8B was responsible for our observations.

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La majorité des infections par le VIH sont acquises hétérosexuellement surtout chez les femmes en Afrique subsaharienne. Le tractus génital féminin (TGF) est la principale porte d’entrée pour le VIH et joue un rôle important dans la défense de l’organisme. De concert avec les cellules épithéliales, les cellules dendritiques (DC) aident à maintenir une balance immunitaire entre tolérance et inflammation. Dans un groupe de travailleuses du sexe (CSW) à Cotonou, au Bénin, des femmes (CSW ≥ 8 ans) ont été identifiées comme hautement exposées séronégatives (HESN). La fréquence de populations cellulaires myéloïdes de type Monocytes-Derived Dendritic Cells (MoDC) présentant un potentiel antiviral et « tolérogénique/régulateur » est augmentée au niveau du TGF des HESNs et les monocytes pourraient être impliqués dans leur génération. Les résultats de RNA-seq sur les monocytes totaux permettent de constater une augmentation de gènes associés à des fonctions effectrices, de protection/contrôle de l’infection et de régulation chez les HESNs comparé aux contrôles (2,5-5 années CSWs HIV- « early HESN », CSWs HIV+ et des femmes de la population générale Non CSWs HIV-). Les résultats de cytométrie en flux (FACS) démontrent une proportion élevée de non-classiques comparé aux autres sous-populations de monocytes sanguins, exprimant davantage de molécules effectrices et régulatrices, suggérant un lien avec les MoDCs tolérogéniques observées. Cinq individus ont séroconverti et ont présenté des modifications bien avant la séroconversion, soit une diminution de β-chimiokines et des IgG anti-gp41 dans le compartiment sanguin et mucosal du TGF. Un bris du profil « tolérogénique/régulateur » pourrait donc favoriser la séroconversion. / Most HIV infection are acquired through heterosexual intercourse, mostly in women in subsaharian Africa. The female genital tract (FGT) is the principal portal of entry for HIV and plays a critical role in host defense. Together, epithelial cells and dendritic cells (DC) help maintain immunological balance between inflammation and tolerance. In a group of commercial sex worker (CSW) from Cotonou, in Benin, women (CSW 8 ≥ years) have been identified as HIV-1 highly exposed seronegative (HESN). The frequency of myeloid cell populations alike to Monocytes-Derived Dendritic Cells (MoDC) presenting an antiviral potential and a tolerogenic/regulating profile were increased in FGT of HESNs and their monocytes could be implied in their generation. The RNA-seq results on total blood monocytes show an increase expression of genes associated with effector, protection/control of HIV infection and regulation functions in HESNs compared with control groups (2,5-5 years CSWs HIV- « early HESN », CSWs HIV+ and women from general population Non CSWs HIV-). Our flow cytometry (FACS) results show an elevated frequency of non-classical compared with other sub-populations in blood monocytes, expressing more effector and regulator molecules, suggesting a link with observed tolerogenic MoDCs. Moreover, five individuals have seroconverted and presented modifications before seroconversion such as lower levels of β-chemokines and anti-gp41 IgG in blood and mucosal compartments in the FGT. A break of this “tolerogenic/regulating” profile could favor seroconversion.

Il a été établi que la majorité des plantes vasculaires abritent des micro-organismes endophytes bactériens et fongiques, qui peuvent coloniser les tissus végétaux et former des associations allant du mutualisme à la pathogénèse. Les symbioses végétales mutualistes les plus communes impliquent les champignons endo-mycorhiziens arbusculaires (AMF). Ces champignons s’associent aux racines des plantes et leur permettent d’améliorer leur nutrition minérale, tandis qu’ils bénéficient des composés produits par l'hôte. Toutefois, les plantes de la famille Ericaceae s’engagent plutôt dans des associations mutualistes avec les champignons mycorhiziens éricoïdes (ErMF). Ces derniers sont morphologiquement et taxonomiquement mal définis, en apparence distribués aléatoirement parmi les espèces issues des grandes divisions taxonomiques des Ascomycota et Basidiomycota. En raison de cette incohérence taxonomique et de l'absence d'une histoire évolutive explicative, la diversité réelle de ces champignons est mal caractérisée. De ce fait, ce projet vise à étudier le microbiote associé à la plante Ericaceae Vaccinium macrocarpon Aït (canneberge), axant la recherche sur les angles morphologiques, génomiques et transcriptomiques des champignons de type ErMF et autres endophytes capables de contrôler la croissance des agents phytopathogènes et de stimuler la croissance des plantes. Notre première démarche présentée dans le chapitre 2 s’est focalisée sur la caractérisation du microbiote endophyte bactérien et fongique de la canneberge, une plante vivace principalement produite en Amérique du Nord, notamment au Québec. Nous avons isolé et identifié 180 micro-organismes à partir de plantes de cultivars variés, collectées de champs différents, et avons démontré l'existence d'une variabilité dans le microbiote selon les tissus, les cultivars, et même entre les champs d'une même ferme. Parmi les endophytes d’intérêt identifiés, l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 a stimulé la croissance des cultivars de canneberge Stevens et Mullica Queen et a formé des structures intracellulaires similaires à celles des ErMF à l’intérieur des cellules racinaires de la canneberge. De plus, l’isolat EB37 identifié Bacillus velezensis s’est révélé être un puissant agent antifongique, montrant cependant une tolérance particulière au champignon Lachnum sp. EC5, lors des tests de confrontation. Ce volet sera détaillé avec plus de précision dans le chapitre 4. Le chapitre 3 a porté sur l’analyse génomique comparative de l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 avec plusieurs espèces de champignons Leotiomycetes ErMF, saprophytes et pathogènes. Nous avons analysé le sécrétome protéique prédit de ces champignons et mis en évidence que les gènes codant pour les enzymes de dégradation des parois végétales ne sont pas corrélés au mode de vie fongique (mycorhizien, pathogène ou saprophyte). A l’inverse, 10 protéines effectrices de Lachnum sp. EC5 prédites pour cibler spécifiquement un compartiment intracellulaire chez les cellules végétales ont des similarités avec celles d’espèces mutualistes comme Meliniomyces variabilis et Oidiodendron maius. Aussi, la protéine effectrice putative Zn-MP, prédite pour cibler, potentiellement, les chloroplastes végétaux nous permet de proposer un rôle dans le renforcement de l’immunité végétale. Le chapitre 4 s’est intéressé aux mécanismes de régulation d'expression de gènes induits lors de l’interaction entre le champignon Lachnum sp. EC5 et la bactérie B. velezensis EB37. Ces mécanismes ont été comparés à ceux activés chez la bactérie en présence de champignons pathogènes. Nous avons démontré une physiologique cellulaire bactérienne distincte en présence de Lachnum sp. EC5, dénotée par une faible expression des gènes induits lors du stress nutritif associé aux processus de sporulation, de formation du biofilm, de secretion de CAZymes et de lipopeptides. Nous avons suggéré que la sous-régulation de ces mécanismes serait essentiellement explicable par une disponibilité plus importante en glucose ou en d’autres sources de carbone préférentielles pour la bactérie. En réponse, le champignon Lachnum sp. EC5 a vécu différents changements morphologiques. Il aurait détoxifié ses environnements intra et extra-cellulaires et surexprimé sa voie de production de carbone dépendante du cycle du glyoxylate, générant ainsi des conditions favorisant un contact physique entre les deux micro-organismes. En conclusion, nous avons argumenté et documenté que la définition des ErMF basée uniquement sur des critères morphologiques est mal adaptée à catégoriser ces champignons. Notre approche multidisciplinaire a mis en évidence la diversité du microbiote de la canneberge, a étendu la notion d’ErMF à d'autres champignons jusqu'ici exclus de ce groupe, et a souligné l'importance des associations interspécifiques sur l’interaction ErMF-plantes. Ces avancées permettront d’améliorer nos connaissances sur le microbiote des plantes éricacées contribuant, au développement de solutions environnementales éco-responsables pour l’industrie de la canneberge. / It has been established that the majority of vascular plants harbour bacterial and fungal endophytes that colonize plant tissues, and thus form associations that range from mutualism to pathogenesis. Mycorrhizal fungi are a particular class of endophytes that associate with plant roots and enhance plant mineral uptake. The most common type of mutualistic plant symbiosis involves arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), whereas plants of the Ericaceae family instead engage in mutualistic associations with ericoid mycorrhizal fungi (ErMF). The ErMF group, in its current definition, includes both ascomycete and basidiomycete species, yet is morphologically, taxonomically and evolutionarily poorly defined, which implies that the group’s true diversity is not well understood. The objective of this project is to complement morphological information with genomic and transcriptomic data to better understand the role of ErMF in 1) controlling the negative effects of pathogenic infections, and 2) the potential plant growth stimulation for the Ericaceous plant Vaccinium macrocarpon Ait. Our first approach presented in Chapter 2 focused on the characterization of the bacterial and fungal endo-symbiotic microbiota of the Ericaceous plant, Vaccinium macrocarpon Ait (cranberry), a perennial plant mainly in North America, particularly in Quebec. We isolated ~180 distinct bacterial and fungal endophytes collected from roots, stems, and leaves of cranberry plants cultivated in Quebec, Canada. We show that the cranberry microbiome varies substantially between tissues, cultivars, and across fields of the same farm. Among the isolated endophytes, the fungus Lachnum sp. EC5 was found to promote the growth of cranberry cultivars Stevens and Mullica Queen, and to form intracellular structures resembling those other ErMF inside the cortical root cells. In addition, the bacterium Bacillus velezensis (EB37) has been found to be a potent antifungal agent. Interestingly, a confrontation test between EB37 and the fungus Lachnum sp. EC5 revealed a mutual tolerance, which we will describe later in chapter 4. In chapter 3, our project focused on the comparative genomic analysis of the fungus Lachnum sp. EC5 with several Leotiomycete ErMF, saprophytes and pathogens. We analyzed fungal secretomes and demonstrated that genes encoding plant cell wall degradation enzymes are conserved between the tested fungi which suggests that such proteins are not indicative of a particular fungal lifestyle. On the other hand, 10 effector proteins identified in Lachnum sp. EC5 were also only found in mutualistic fungi, such as Meliniomyces variabilis, Oidiodendron maius and have been reported to target the plant intracellular compartments. Also, the identification of the putative effector protein Zn-MP, specific to Lachnum sp. EC5 and predicted to target plant chloroplasts, suggest a role in the reinforcement of plant immunity. Chapter 4 focuses on the patterns of gene expression regulation induced in the biocontrol bacterium B. velezensis EB37 in interaction with the potentially mutualistic fungus Lachnum sp. EC5. These mechanisms were then compared to those activated when the bacterium is in the presence of pathogenic/saprophytic fungi. We demonstrated that in co-culture with Lachnum sp. EC5, EB37expresses fewer genes related to stress, and fewer related to the stationary phase which often involves production of bacterial biofilms and lipopeptides, such as mycosubtilin. We suggest that the lessened response to stress is related to an increased availability of glucose or other preferential sources of carbons for the bacterium. Conversely, Lachnum sp. EC5 in the presence of EB37 underwent morphological changes by a higher lateral branching., detoxified its external and internal environment by expressing both a catalase activity and efflux pumps, and overexpressed its glyoxylate cycle-dependent carbon production pathway, and thus promoting favourable conditions for close physical contact with the bacterium. In conclusion, we demonstrated that the morphological-based definitions are poorly adapted to the categorization of ErMF fungi. Our multidisciplinary approach highlighted the diversity of the cranberry microbiota, extended the notion of ErMF to other fungi hitherto excluded from this fungal group and underlined the importance of interspecific associations on the ErMF-plant interaction. These advances enhance our understanding of the Ericaceous plant microbiota and contributes to the development of sustainable solutions for the cranberry industry.