Zusammenfassung Einleitung: Eimeria tenella ist ein obligat intrazellulärer Parasit und Erreger der Blinddarmkokzidiose beim Huhn. Aufgrund des verbreiteten Einsatzes von Antikokzidia sind seit langem Resistenzentwicklungen bekannt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind komplex und nicht genau bekannt. Für den Nachweis von Resistenz gilt der Tierversuch als „Goldstandard“, er ist aber aufwändig, zeitraubend und ethisch problematisch. Ziele der Arbeit: Es sollte ein für die Erstellung von Sensitivitätsprofilen und Wirksamkeitsprüfungen geeignetes In-vitro-Modell für E. tenella entwickelt und validiert werden. Weiterhin sollte auf mit Antikokzidiaresistenz assoziierte Änderungen im Proteom von Kokzidien untersucht werden. Material, und Methoden: Monolayer von MDBK (Madin-Darby bovine kidney cells) dienten zur Kultivierung von E. tenella für den in vitro ASA (anticoccidial sensitivity assay). Als Parameter wurden die Inhibition (%ISIA, %IRIA) der Invasion durch Sporozoiten (SIA = sporozoite invasion inhibition assay) und der Erregerreproduktion (RIA = reproduction inhibition assay) mittels quantitativer PCR (qPCR) für E. tenella beurteilt. Die minimale Hemmkonzentration (MIC = minimal inhibitory concentration) wurde anhand einer Referenz (sensitiver Laborstamm Houghton, Ref-1) für Monensin (Mon), Salinomycin (Sal), Maduramicin (Mad), Lasalocid (Las) und Toltrazuril (Tol) bestimmt. Auf dieser Basis wurden ein zweiter Laborstamm (Wisconsin, Ref-2) und vier Feldstämme (T-376, FS-1, FS-2 und FS-3) im SIA und RIA getestet. 1.0 × 105 (SIA) und 5.0 × 104 (RIA) Sporozoiten/Well wurden verwendet. Die in vitro Ergebnisse wurden mit den in vivo Daten verglichen. Alle in vitro Versuche wurden in vier Replikaten durchgeführt. Insgesamt wurden 420 Hühner (1. Lebenstag: LT, Cobb-500) in fünf Tierversuche verwendet, um die Empfindlichkeit der E. tenella-Stämme gegen verschiedene Antikokzidia zu untersuchen. In jedem Tierversuch wurden 84 Tiere (12. LT) in 7 Gruppe (n = 12) eingeteilt. Hühner wurden mit 7,5 × 104 Oozysten je Tier am 14. LT infiziert. Die Wirksamkeitsprüfung für den alternativen Naturstoff Allicin erfolgte mittels RIA am Stamm Ref-1. Kontinuierlich in vitro als Tachyzoiten kultivierte T. gondii des RH-Stammes (Sen-RH) wurden unter ansteigenden Mon-Dosen in HFF-Zellen (human foreskin fibroblasts) über 8 Monate auf Resistenz (MonR-RH) selektiert. Es erfolgte eine stabile Isotopenmarkierung (SILAC). Für E. tenella wurden die sensitivenReferenzstämme ebenso wie die Feldstämme variabler Sensitivität isoabarisch-chemisch markiert (Tandem-Massenmarkierung, TMT). Die quantitativen Proteomanalysen erfolgten mit dem nanoUPLC-MS/MS. Ergebnisse: Für Ref-1 betrugen die MIC95 (MIC für eine 95%ige Inhibition) 0,25 (Mon), 0,5 (Sal), 1,0 (Mad), 0,5 (Las) und 5,0 (Tol) μg/ml. Die in vitro Sensitivitätsprofile für Ref-2, FS-1, FS-2, und FS-3 stimmten für die Ionophoren mit den Ergebnissen des Tierversuchs gut überein, für Tol war das aber nicht der Fall. Signifikante Korrelationen wurden für die %IRIA-Werte mit dem Oozystenindex (OI, r = 0,290-0,507; p < 0,05), dem lesion score (LS, r = 0,279-0,345; p < 0.05, für Ref-1, Ref-2 und FS-1) und der Gewichtszunahme im Tierversuch (WGNNC, r = 0.284-0.419; p < 0.05, für Ref-1 und FS-1) festgestellt. Allicin in einer Konzentration von 1,8 mg/ml ergab einen %IRIA von 99,0%, was einer guten Wirkung entspricht. Mittels SILAC wurden 1820 Proteine identifiziert, von denen 1024 Proteine in mehr als vier biologischen Replikaten quantifizierbar waren. Bei 52 Proteinen wurden signifikante Unterschiede zwischen Sen-RH und MonR-RH festgestellt (p < 0,05). Actin, beta-Tubulin cofactor D, Perforin-like Protein 1 (PLP1), und kleine GTPase-vermittelte Signaltransduktionsproteine (GTPases) wurden in T. gondii MonR-RH hochreguliert (p < 0,05). Insgesamt waren 42 Proteine bei der resistenten Mutante MonR-RH hochreguliert. Für E. tenella wurden 97 Proteine identifiziert und 25 Proteine wurden in allen drei biologischen Replikaten quantifiziert. Mon-resistente E. tenella zeigten signifikant hochreguliertes Actin (p < 0,05). Mikronemenproteine wurden in resistenten Toxoplasma (MIC8) und Eimeria (MIC4) herunter reguliert. Schlussfolgerungen: Das entwickelte In-vitro-Verfahren in Kombination mit der qPCR eignet sich zur Bewertung der Sensitivität von E. tenella gegenüber ionophoren Antikokzidia und erbringt Ergebnisse, die mit dem Tierversuch korrelieren. Das Modell kann Tierversuche zum Screening von Wirkstoffen reduzieren, aber nicht vollständig ersetzen, vor allem, wenn die Wirkung (auch) späte Entwicklungsstadien im Zyklus von E. tenella betrifft. Letzteres könnte die mangelnde Aussagekraft für Tol erklären. In T. gondii lässt sich Resistenz in vitro induzieren. Die Proteom-Analyse zeigte eine Verminderung der Invasion (↑ Actin, ↓ MIC8) und des Austritts (↓ PLP1), und eine Aktivierung der Replikation (↑ Actin, ↑ beta-Tubulin cofactor D, und ↑ GTPases proteine). Mon führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Na+ gefolgt von einer Erhöhung der Ca++ Konzentrationen. Die Reduzierung der Expression von Proteinen in MonR-RH, die mit Invasion- und Austrittsaktivitäten zusammenhängen, zeigt an, dass dieser Stamm höhere Konzentrationen von Mon verträgt, indem er die ktitische Schwelle der zytosolischen Ca++ Konzentration erhöht ist, die erforderlich ist, um diese Prozesse zu provozieren.

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Coccidiosis in chicken causes great economic losses. Increasing resistance of Eimeria species to anticoccidials has forced the search for alternative methods of control. The present study evaluates the anticoccidial activity of some anti-Eimeria tenella antibody fragments expressed in pea plants. Both in vitro and in vivo infection assays including indirect immunofluorescence, in vivo evaluation of antibody neutralization and cell culture invasion-inhibition assays were used to study the inhibitory effect of these antibody fragments on E. tenella sporozoites. Seven of nine antibody fragments (Ab1, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 and Ab9) showed binding to sporozoites of E. tenella in an indirect immunofluorescence test. Only two antibodies (Ab4 and Ab5) cross reacted with sporozoites of E. maxima, E. acervulina and E. brunetti. The localization of specific fluorescence differed between species. Ab binding with sporozoites was seen in the area of both anterior and posterior refractile bodies in case of E. tenella, E. brunetti, and E. maxima but was only observed in the posterior refractile body in case of E. acervulina. No antibody binding was observed on merozoites. The suitability of antibody fragments to alter the infectivity of E. tenella sporozoites to Madin Darby Bovine Kidney cells (MDBK) was examined in vitro and the invasion-inhibition rates were quantified by flow cytometry. To assess the inhibitory effect on parasite reproduction, the in vivo antibody neutralization assay was done by retrograde infection of chicken with sporozoites previously incubated with antibody fragments. In vitro invasion rates were reduced by incubation with antibody fragments by approximately 24 to 45 %, with Ab6 and Ab7 showing the most distinct effect. However, proliferation rates (PR) of the respective MDBK cultures were also clearly reduced by 15 to 26 %. PR of MDBK cells treated with 1:1000, 1:100, 1:10 and undiluted mixed antibody fragments were reduced by 1%, 10%, 16%, and 26% with a reduction of invasion rates by 0%, 9%, 15% and 18%, respectively. Immune sera reduced the invasion rates by 16% to 70% and increased PR of the host cells. It appeared that the preparations of the antibody fragments contained compounds cytotoxic to MDBK cells and thus invasion inhibition could not be unequivocally evaluated in vitro. However, after incubation with antibody fragments sporozoites displayed a reduced ability to reproduce after intracloacal application to chicken (especially Ab1, Ab3, Ab5 and Ab9). Other antibody fragments (Ab2, Ab4, Ab6, Ab7 and Ab8) were less capable to reduce sporozoite infectivity and reproduction. More investigations are still required to study the possible use of antibody fragments and their application to infected chicken exposed to coccidiosis.

In diese Dissertation, Ich konzentriere mich insbesondere darauf, wie die Artbestimmung in der Gattung Eimeria mit der Wirtsspezifität bei Nagetierarten zusammenhängt. Zunächst bietet diese Arbeit eine Reihe von Methoden zur Beurteilung der Prävalenz auf der Ebene der Parasitenarten in Mus musculus. Als Ergebnis war es möglich, drei verschiedene Eimeria-Spezies zu identifizieren, Mäuse mit Doppelinfektionen zu erkennen und die artenspezifische Prävalenz in Abhängigkeit von der Wirtsdichte vorherzusagen. Zur Identifizierung von Eimeria spp. über verschiedene Wirtsarten hinweg wurde eine neuartige Hochdurchsatz-Multi-Locus-Genotypisierungsmethode etabliert und mit der auf zuvor etablierten Markern basierenden Einzelmarker-Genotypisierung verglichen. Dies bestätigte, dass die Art E. falciformis in einer einzigen Wirtsart, der Hausmaus, vorkommt. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breitem Wirtsspektrum hindeutet. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breiter Wirtsverwendung in einem phylogenetischen Artkonzept schließen lässt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hohe Wirtsspezifität, die traditionell für Eimeria-Parasiten angenommen wird, fragwürdig ist und dass die Identifizierung von Arten durch Wirtsassoziation vermieden werden sollte. Durch molekulare Amplifikation, Sequenzierung, Genotypisierung und phylogenetische Analyse war es möglich, Eimerien auf Artniveau zu identifizieren und die Wirtsspezifität in Isolaten aus natürlichen Systemen in Frage zu stellen. In einer breiteren Perspektive betonte diese Arbeit die Notwendigkeit, Strategien bei der Erkennung, Quantifizierung und Identifizierung von Parasiten zu standardisieren und zu kombinieren, um ein besseres Verständnis auf evolutionärer und ökologischer Ebene zu erlangen. / This PhD thesis combines different approaches for parasite identification to assess the diversity of parasites in natural systems. Particularly, I focus on how species identification in the genus Eimeria is linked to its host specificity in rodent species. First, this thesis provides a set of methods to assess prevalence at the species level in Mus musculus systems. The approach integrates morphological description with molecular methods for detection, niche approximation and phylogenetic reconstruction. As a result, three different Eimeria species were identified, mice with double infections were detected and species-specific prevalence were predicted to be host density-dependent. For identification of Eimeria spp. across different host species, a novel high-throughput multi-locus genotyping was established and compared with single-marker genotyping. The multi-locus genotyping approach provided a higher resolution to distinguish closely related Eimeria isolates. This confirmed the species E. falciformis to have a single host species, the house mice. However, E. vermiformis and E. apionodes could not be distinguished suggesting a single species with broader host usage in a phylogenetic species concept. These findings show that the high host specificity traditionally assumed for Eimeria parasites is questionable, and that identification of species by host association should be avoided. The approaches for identification of Eimeria spp. Developed here allowed differentiation of closely related isolates with indistinguishable morphology. Molecular amplification, sequencing, genotyping and phylogeny allowed the identification of Eimeria at species level and to question host specificity in isolates from natural systems. In a broader perspective, this work emphasised the necessity to standardise and combine strategies in parasite detection, quantification and identification to gain better understanding at an evolutionary and ecological level.

Los complejos ciclos de vida que tienen muchos parásitos permiten utilizarlos como indicadores de la biología y del comportamiento de sus hospedadores. Los parásitos en los peces de aguas continentales constituyen un grupo muy interesante para realizar estudios poblacionales y comunitarios. Uno de los peces que posee mayor importancia económica en los ambientes acuáticos continentales de Argentina, es el pejerrey bonaerense, Odontesthes bonariensis. Su explotación se basa principalmente en la pesca deportiva, constituyendo un gran atractivo turístico. La disminución numérica del pejerrey en diversos cuerpos de agua, ha motivado el desarrollo de la aterinicultura, cuyos orígenes se remontan a principios del siglo pasado. El objetivo principal de este trabajo fue ampliar el conocimiento de los aspectos sistemáticos, biológicos y ecológicos de las especies parásitas que afectan a O. bonariensis. Se seleccionaron dos cuerpos de agua de la provincia de Buenos Aires; las lagunas Salada Grande y Lacombe, en las que se realizaron muestreos estacionales durante dos años consecutivos. Se realizaron las descripciones de 10 taxa parásitos en O. bonariensis, de los cuales, tres fueron citados previamente para este hospedador (Austrodiplostomum mordax, Cangatiella macdonaghi y Contracaecum sp.) y los siete restantes, constituyen nuevas citas para el pejerrey (Thometrema bonariensis, Saccocoelioides sp., Hysterothylacium rhamdiae, Wolffhugelia matercula, Eimeria sp., Ascocotyle (Phagicola) diminuta y Ascocotyle (Ascocotyle) tenuicollis. En los pejerreyes de los ambientes estudiados predominaron los parásitos generalistas con ciclos de vida heteroxenos. El número de especies parásitas con ciclos de vida autogénicos y alogénicos fue similar. Se estudió la dieta de los pejerreyes capturados y su relación con los parásitos hallados. La dieta estuvo constituida principalmente por plancton y los alimentos ocasionales (Palaemonetes argentinus, Heleobia parchappei, restos de peces, ostrácodos, larvas de chironómidos y restos de vegetación), se hallaron en escasa proporción (<5%). El espectro trófico de los pejerreyes fue más variado en la laguna Salada Grande que en la laguna Lacombe. La modalidad de dieta planctófaga se encontró asociada positivamente con la presencia de C. macdonaghi, Contracaecum sp., Eimeria sp., A. mordax, A. (P.) diminuta y A. (A.) tenuicollis. Sin embargo, en los casos de las últimas tres especies, la asociación positiva podría estar relacionada con las elevadas prevalencias de estos parásitos y la dieta casi exclusivamente planctónica de los hospedadores examinados. En los casos de C. macdonaghi, Contracaecum sp. y Eimeria sp., esta asociación podría indicar la intervención de crustáceos en su ciclo de vida. La presencia de H. parchappei se encuentra asociada directamente a Saccocoelioides sp. y a T. bonariensis, dado que el pejerrey es parasitado por estos digeneos al ingerir moluscos infestados. Se estudió la distribución de las metapoblaciones parásitas en la población hospedadora y se observó que todos los parásitos presentan distribución agregada, la cual puede ser descripta por el modelo binomial negativo. Se describió el patrón estacional de las metapoblaciones parásitas halladas; Eimeria sp., A. (P.) diminuta y A. (A.) tenuicollis, se mantuvieron estables durante los dos años de muestreo y las demás especies presentaron variaciones estacionales significativas, aunque en la mayoría no se pudo detectar un claro patrón estacional. La ausencia de claros patrones estacionales podría estar relacionada con el rol que cumple O. bonariensis en los ciclos de vida de los parásitos hallados, dado que actúa como hospedador intermediario de especies generalistas (A. mordax, Contracaecum sp., H. rhamdiae), que se encuentran dispersas en varias especies de peces del ecosistema lagunar. Se estudio el patrón de infección C. macdonaghi, el reclutamiento de nuevos individuos y la formación de huevos se produce durante todas las estaciones del año, sin embargo no todos los individuos llegan a la madurez sexual. Se considera que la competencia intraespecífica y la deficiente fijación de los individuos al intestino, constituyen los factores más importantes que intervienen en la pérdida de los individuos inmaduros y maduros. Se analizó el hábitat preferencial de las especies localizadas en el tracto digestivo, en los casos de infecciones intestinales monoespecíficas, los individuos de C. macdonaghi y T. bonariensis se ubican preferentemente en el sector anterior del intestino y los individuos de W. matercula y Saccocoelioides sp. se distribuyen en el sector medio y posterior del intestino. En los hospedadores donde se detectaron infecciones mixtas se mantuvo la misma distribución de los helmintos. La ausencia de fenómenos de desplazamiento puede relacionarse con las bajas prevalencias y abundancias medias de T. bonariensis, W. matercula y Saccocoelioides sp. en el pejerrey. Se analizó la relación entre la prevalencia, la intensidad media y la abundancia media de las metapoblaciones parásitas y la talla y el sexo del hospedador; se observó una correlación positiva (A. mordax, Eimeria sp., A. (P.) diminuta) o ausencia de correlación (C. macdonaghi y A. (A.) tenuicollis) con respecto a la talla del hospedador y en la mayoría de las metapoblaciones parásitas no se encontraron diferencias significativas en ambos sexos. El análisis de los efectos de las metacercarias de A. mordax en la población hospedadora, indicó que no existen evidencias para afirmar que estas metacercarias provoquen alteraciones en la alimentación ni deformaciones en la columna vertebral. Se estudió la estructura y dinámica de las comunidades parásitas en O. bonariensis, tanto a nivel de comunidad componente como de infracomunidad. Las comunidades parásitas de las lagunas Salada Grande y Lacombe tienen una similitud del 60%. La riqueza específica, el número de especies de especies centrales, la diversidad, la predictibilidad, el número medio y máximo de especies por infracomunidad fueron superiores en los pejerreyes de la laguna Salada Grande. Estas diferencias pueden relacionarse con la mayor talla de los ejemplares capturados en la laguna Salada Grande, su mayor espectro trófico y con características del ambiente (mayor tamaño y mayor abundancia de aves y moluscos). La estructura comunitaria no experimentó diferencias significativas relacionadas con la talla y el sexo del hospedador, excepto en el caso de los porcentajes de dominancia de C. macdonaghi en la laguna Lacombe, los cuales fueron mayores en los machos. Estos resultados coinciden con los obtenidos al analizar la dinámica estacional de esta especie y se relacionan con fenómenos fisiológicos y con la distribución diferencial durante la época reproductiva de los machos y hembras en el cuerpo de agua. Las comunidades parásitas del pejerrey de las lagunas Lacombe y Salada Grande presentan características que las acercan a las comunidades aislacionistas.