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Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Department of Power Engineering. Vysoká Skola Chemicko-Technologická V Praze, Praga. 2009

La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el desarrollo y funcionalización de diversos materiales carbonosos para su posterior aplicación como elemento transductor en sensores y biosensores electroquímicos. En este trabajo se ha evaluado el efecto de emplear diferentes materiales carbonosos como elementos transductores en sensores voltamétricos y cronoamperométricos para la cuantificación de ácido ascórbico y ácido úrico en fluidos fisiológicos humanos (e.g., orina, sudor, suero y sangre). Se han empleado materiales carbonosos basados en grafito, grafeno, óxido de grafeno y nanotubos de carbono con estructura de espina de pescado (herringbone), siendo los tres primeros funcionalizados con nanopartículas metálicas (platino y oro), mientras que los nanotubos de carbono herringbone han sido sometidos a una funcionalización electroquímica covalente con ácido 4-aminobenzoico. Dispersiones acuosas de los materiales carbonos han sido empleadas para modificar, mediante la técnica drop-casting, unas redes de microelectrodos interdigitados de oro. Los electrodos preparados basados en grafeno y en nanotubos de carbono han sido empleados en el desarrollo de sensores voltamétricos para la detección de ácido ascórbico y ácido úrico, mostrando resultados prometedores. Por otra parte, los electrodos basados en óxido de grafeno y nanotubos de carbono herringbone, estando ambos materiales funcionalizados, han sido evaluados para cuantificar simultáneamente ácido ascórbico y ácido úrico mediante cronoamperometría. El electrodo basado en nanotubos de carbono proporciona mejores sensibilidades, lo que es indicativo de las excepcionales propiedades que presentan estos materiales. Ambos sensores han sido empleados para el análisis de muestras reales, resaltando nuevamente las extraordinarias propiedades que presenta el sensor basado en nanotubos de carbono ya que permite el análisis de matrices complejas como sangre, suero u orina, mediante la simple dilución de la muestra y haciendo uso de una calibración externa. Finalmente, se ha desarrollado un biosensor basado en grafito decorado con nanopartículas de platino y sobre el cual se ha inmovilizado la enzima glucosa oxidasa para la cuantificación de glucosa en muestras de sudor humano. Este biosensor ha sido preparado mediante la impresión manual de tintas flexibles sobre un sustrato que también presenta una elevada flexibilidad, de modo que puede ser fijado en la piel humana. La sensibilidad y límite de detección alcanzados con el dispositivo desarrollado ha permitido la cuantificación de glucosa en muestras reales de sudor humano.

Se puede dividir la presente memoria en dos grandes partes interconectadas entre sí y cuyo fin será la obtención de un diseño de reactor más eficiente, que los fabricados hasta el momento en la Universidad de Alicante, obtenido a través de diversos métodos de optimización que evitarán la construcción de muchos prototipos de prueba disminuyendo significativamente los recursos económicos que se deberán destinar para alcanzar este objetivo. Por otro lado, a lo largo de la presente memoria se irán empleando diversas técnicas y herramientas que serán puestas a punto para desarrollar la tarea de conseguir una optimización más rápida, eficiente y barata de esta clase de reactores.

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Ciências de Engenharia, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Prof. Doutor Fernando Jorge Monteiro

La creciente demanda de metodologías analíticas simples, selectivas y de bajo coste para el análisis cuantitativo o semicuantitativo de analitos de variada naturaleza en muestras complejas ha favorecido el desarrollo de alternativas analíticas a los métodos clásicos de análisis. En este contexto, en la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de biosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional, para la detección descentralizada y fiable de compuestos de interés en la seguridad alimentaria y en el control medioambiental. Debido a la experiencia de nuestro grupo de trabajo y a las demostradas ventajas del material grafito-epoxi (GEC) como transductor electroquímico, se dirigieron los esfuerzos hacia la construcción de nuevos transductores basados en compósitos rígidos grafito-epoxi. Así, se abordaron dos líneas distintas de investigación: la primera, dirigida hacia la construcción de transductores biocompósitos grafito-epoxi (GEB) modificados en volumen con biomoléculas de afinidad universal, para la inmovilización de enzimas, anticuerpos, u oligonucleótidos y, la segunda, en el desarrollo de nuevos protocolos para la detección electroquímica de biomoléculas inmovilizadas en partículas magnéticas, mediante el diseño de un sensor con propiedades magnéticas, m-GEC. Abordando el primer eje de esta tesis, se estudiaron diferentes moléculas de afinidad universal para la preparación de biocompósitos, tales como la proteína A y la proteína G (para la inmovilización de anticuerpos de diferentes especificidades a través del Fc) y la estrept(avidina), para la inmovilización de prácticamente cualquier analito biotinilado, sea este enzimas, oligonucleótidos o anticuerpos. Así, se construyeron exitosamente biocompósitos de avidina (Av-GEB) capaces de inmovilizar con una excelente orientación, oligonucleótidos, enzimas y anticuerpos. Del mismo modo se diseñaron y construyeron plataformas universales para la inmovilización de anticuerpos basados en biocompósitos grafito-epoxi de proteína A (ProtA-GEB). Usando esta plataforma se consiguieron inmovilizar anticuerpos de las más variada naturaleza a través de su fracción constante para la detección de diferentes analitos como, por ejemplo, atrazina en zumo de naranja o en aguas embotelladas, alcanzando límites de detección por debajo del límite de 0.1 ?g L-1 fijado por la legislación europea. Además de estas plataformas electroquímicas de afinidad universal, se construyeron con éxito inmunocompósitos grafito-epoxi de afinidad específica (Ab-GEB), en concreto inmunocompósitos anti-atrazina para la determinación de este analito en muestras reales con una alta sensibilidad. Resultados muy prometedores se han obtenido también con el segundo eje de la presente tesis, mediante ensayos llevados a cabo con un nuevo sensor magnético basado en compósito grafito-epoxi (m-GEC) y esferas magnéticas modificadas con bioespecies. Las partículas magnéticas representan una nueva estrategia para bioanálisis que aportan numerosas ventajas adicionales. Después de un estudio exhaustivo de la inmovilización de biomoléculas sobre diferentes tipologías de esferas magnéticas funcionalizadas por diferentes grupos químicos (tosil y carboxilo) o moléculas biológicas (proteína A), se consiguió inmovilizar con éxito anticuerpos para la determinación de una familla de antibióticos (sulfonamidas) en muestras alimentarias y de anticuerpos para la determinación de atrazina en muestras alimentarias y medioambientales. Con esta estrategia se consiguió detectar atrazina en muestras tales como agua de consumo y zumo de naranja, y sulfonamidas en leche fresca o UHT entera, desnatada y semidesnatada. En este último caso, se ha conseguido rebajar en un factor de 100 los límites de detección fijados por la legislación europea. Por último, y para concluir, con el objetivo final de desarrollar en un futuro un sistema de detección de DNA de E. coli patógenas basado m-GEC y detección electroquímica, para la aplicación en seguridad alimentaria en cuanto a bacterias patógenas, se ha desarrollado un sistema de primers específicos basados en experimentos de RT-PCR. / The increasing interest in simple, selective and cost-effective analytical methodologies for quantitative analysis in different complex samples is related with the development of analytical alternatives beside instrumental methods of analysis. This thesis is focused on the development of robust, low-cost, user-friendly biosensors, for the accurate detection of compound related with food safety and environmental monitoring. One of the main expertise area in our group is the construction of conducting and rigid graphite-epoxy composites. Due to our experience as well as the improved properties of this transducer material, the research was focused on the construction of novel transducers based on rigid graphite-epoxy composite (GEC). On one hand, this thesis was focused on the construction of graphite-epoxy biocomposite (GEB) transducer bulk-modified with universal affinity biomolecules for the improved immobilization of enzymes, antibodies and oligonucleotides. On the other hand, the development of novel strategies for the electrochemical detection of biomolecules previously immobilized on magnetic beads was also performed, by the construction of a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC). In order to design graphite-epoxy biocomposite based-transducers, different universal affinity molecules such as protein A and G -for the immobilization of antibodies through the Fc region-, and strept(avidin) -for the immobilization of almost any biotinylated biomolecules such as enzymes, DNA or antibodies- were studied. Avidin graphite-epoxy biocomposite transducers -Av-GEB- with improved immobilizing properties for biotinylated DNA, antibodies and enzymes were constructed and electrochemically evaluated. In a similar way, protein A graphite-epoxy biocomposite (ProtA-GEB) transducers for the improved immobilization of antibodies with different specificities were also constructed. Atrazine in bottled water samples as well as orange juices were determined by immunosensing with this strategy, reaching the maximum residues limits established by the European Commission (0.1 ?g L-1). Beside these universal affinity platforms, graphite-epoxy immunocomposite transducers (Ab-GEB) with specific affinity were constructed for the specific detection of atrazine in real samples with high sensitivity. On the other hand, very promising results were also achieved with a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC) and magnetic beads modified with biomolecules. Magnetic beads provide further improvement to a bioassay, such as better and easier separation of the biomolecule from the complex sample. After a carefully study of the different modified magnetic beads (such as tosyl, carboxilate and Protein A modified magnetic beads), a class specific antibodies for the determination of sulfonamides as well as the specific anti-atrazine antibody were immobilized on tosyl modified magnetic beads. The detection of atrazine in water samples and orange juices, as well as sulfonamides in skimmed, semi-skimmed and full cream UHT and raw full cream milk samples was achieved following this strategy with remarkable sensitivity and reaching by far the maximum residues limits established by the European Commission. Finally, the design of a set of specific primers for the detection of pathogenic E. Coli by RT-PCR has been described. This system will be used in the electrochemical genosensing based on m-GEC of pathogenic bacteria in a near future.

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Esta Tesis Doctoral trata sobre la funcionalización de materiales carbonosos con elevado contenido de microporosidad con grupos funcionales nitrogenados y su uso como electrodos de supercondensadores y electrocatalizadores de la reacción de reducción de oxígeno. De este modo, este trabajo describe la incorporación de grupos funcionales nitrogenados mediante distintas metodologías en materiales carbonosos de elevada microporosidad (carbones activados y materiales carbonosos nanomoldeados), su caracterización química y electroquímica en distintos electrolitos (orgánicos, acuosos y líquidos iónicos) y su comportamiento en las aplicaciones propuestas.

a gestió dels residus nuclears de vida llarga i alta activitat és una de les principals preocupacions al voltant de l’energia nuclear. En el marc del projecte europeu IP EUROTRANS (EURATOM 6th Framework Programme) i dels projectes espanyols COMETA (ENE2005-08611-C02-02) i COPLOGEN (ENE2009-14223-C02-02) s’ha proposat utilitzar reactors ADS (Accelerator Driven Systems) per a transmutar aquest tipus de residus. En aquest tipus de residus, protons d’alta energia, col•lisionarien amb el blanc d’espal•lació produint neutrons ràpids que serien capaços de transmutar elements radioactius de vida llarga en altres de vida curta. En aquests reactors, es proposa utilitzar l’eutèctic plom - bismut (44.5% Pb – 55.5 % Bi) com a refrigerant degut al seu punt de fusió baix i a què pot ser utilitzat com a blanc d’espal•lació per a produir neutrons ràpids. No obstant, aquest aliatge és altament corrosiu dels materials estructurals, especialment els acers inoxidables. Per això es fa necessària una capa d’òxid de passivació que els protegeixi. En aquest entorn, s’haurà de controlar l’oxigen del medi, que ha ser suficient per a formar la capa de passivació però inferior al de formació de PbO. Ha de tenir-se en compte que el plom - bismut, en les condicions d’operació, serà un líquid en moviment i que no convé tenir partícules sòlides d’òxid que pugin erosionar o bloquejar parts del reactor. Amb l’objectiu de poder mesurar pressions parcials d’oxigen de l’ordre de 10-20 bar, en aquesta Tesi Doctoral, es proposa utilitzar sensors potenciomètrics d’oxigen amb electròlit sòlid de ZrO2 dopat amb Y2O3, YSZ, conductor del ió O2-. Per al seu ús en circuits experimentals és necessari establir un mètode de calibratge de sensors durant la seva operació i desenvolupar prototips que puguin ser usats en condicions dinàmiques. Per altra banda, degut a què a temperatures baixes (T<400ºC) l’ electròlit sòlid utilitzat perd la seva capacitat conductora d’oxigen s’han adaptat els sensors per a la seva possible utilització a temperatures de l’ordre de 300ºC. Per a estudiar la corrosió del material estructural i controlar la química de l’eutèctic en aquests reactors s’ha determinat la solubilitat i la difusió d’oxigen en el metall fos i la influència d’ impureses metàl•liques (In, Ni, Cr i Fe) en la solubilitat d’oxigen en plom - bismut. A més, com que centres d’investigació de diversos països participen en el projecte IP EUROTRANS, s’ha comparat la resposta de dos sensors d’oxigen fabricats per diferents laboratoris, amb diferent sistema de referència i fabricació de l’electròlit sòlid en les mateixes condicions experimentals. / La gestión de los residuos nucleares de vida larga y alta actividad es una de las mayores preocupaciones acerca de la energía nuclear. En el marco del proyecto europeo IP EUROTRANS (EURATOM 6th Framework Programme) y de los proyectos españoles COMETA (ENE2005-08611-C02-02) y COPLOGEN (ENE2009-14223-C02-02) se ha propuesto utilizar reactores ADS (Accelerator Driven Systems) para transmutar este tipo de residuos. En estos reactores, protones de alta energía colisionarían con el blanco de espalación produciendo neutrones rápidos que, a su vez, serían capaces de transmutar elementos radioactivos de vida larga en otros de vida corta. En estos reactores, se propone usar el eutéctico plomo-bismuto (44.5 % Pb – 55.5 % Bi) como refrigerante debido a su bajo punto de fusión y a que puede ser usado como blanco de espalación para producir neutrones rápidos. No obstante, esta aleación es altamente corrosiva de los materiales estructurales, especialmente los aceros inoxidables. Por ello, se hace necesaria una capa de óxido de pasivación que los proteja. En este entorno, se deberá controlar el oxígeno del medio, que tiene que ser suficiente para formar la capa de pasivación pero inferior al de formación de PbO. Debe tenerse en cuenta que el plomo-bismuto, en las condiciones de operación, será un líquido en movimiento y no conviene tener partículas sólidas de óxido que puedan erosionar o bloquear partes del reactor. Con el objetivo de poder medir presiones parciales de oxígeno del orden de 10-20 bar, en esta Tesis Doctoral, se propone utilizar sensores potenciométricos de oxígeno con electrolito sólido de ZrO2 dopado con Y2O3, YSZ, conductor del ión O2-. Para su uso en circuitos experimentales es necesario establecer un método de calibración de sensores durante su operación y desarrollar prototipos que puedan ser usados en condiciones dinámicas. Por otro lado, debido a que a temperaturas bajas (T<400ºC) el electrolito sólido utilizado pierde su capacidad conductora de oxígeno se han adaptado los sensores para su posible utilización a temperaturas del orden de 300ºC. Para estudiar la corrosión del material estructural y controlar la química del eutéctico en estos reactores se ha determinado la solubilidad y la difusión de oxígeno en el metal fundido y la influencia de impurezas metálicas (In, Ni, Cr y Fe) en la solubilidad de oxígeno en el plomo-bismuto. Además, dado que centros de investigación de diversos países participan en el proyecto IP EUROTRANS se ha comparado la respuesta de dos sensores de oxígeno fabricados por distintos laboratorios, con diferente sistema de referencia y fabricación del electrolito sólido en las mismas condiciones experimentales. / The management of long-lived and high activity nuclear waste is one of the major concerns related with nuclear energy. In the framework of the European Project IP EUROTRANS (EURATOM 6th Framework Program) and Spanish Projects COMETA (ENE2005-08611-C02-02) and COPLOGEN (ENE2009-14223-C02-02), accelerator driven system (ADS) reactors have been proposed for transmutating the long-lived nuclear waste. In this type of reactors, protons of high energy collide with a spallation target and fast neutrons are produced. These fast neutrons, in turn, can be used in subcritical reactors, where radioactive elements of long life can be transmuted to elements of short life. Lead – bismuth eutectic alloy, LBE. (44.5% Pb – 55.5% Bi) is proposed as a coolant for ADS reactors. The advantages of using this alloy are its low melting point and that it can also be used as spallation target for producing fast neutrons. However, this alloy is highly corrosive. For this reason, it is important to maintain a passivation layer on the structural material. In this type of reactors molten LBE is flowing then solid particles could erode or block parts of the circuit. In order to maintain this passivation layer avoiding PbO formation, it is necessary controlling and monitoring the oxygen content in LBE between these two limits. In this work, a potentiometric oxygen sensor with ZrO2 / Y2O3 solid electrolyte (YSZ) is used to measure oxygen partial pressure inside LBE. In order to improve the reliability of these sensors it is necessary to improve its design in order to use them in experimental circuits under dynamic conditions and to develop a method for checking its condition during operation. On the other hand, at low temperatures (T<400ºC), YSZ loses its ionic conductivity, so sensors have been adapted to be used at temperatures around 300ºC In order to study structural material corrosion and to control eutectic chemistry in this type of reactors, solubility and diffusivity of oxygen in the molten metal have been determined. The effect of metallic impurities (In, Fe, Cr, Ni) in oxygen solubility in lead bismuth is also studied. Furthermore, in order to compare sensors from different institutions in the framework of the European project, two prototypes of oxygen sensors have been studied under same stagnant conditions. One of the sensors was proposed by KIT and the second one was proposed by IQS. Different reference systems and YSZ suppliers have been compared.