A piscicultura vem se destacando no âmbito nacional, uma vez que o Brasil apresenta uma significante disponibilidade de recursos hídricos e condições geográficas e climáticas favoráveis, que permitem a criação de espécies exóticas e nativas. Devido ao intuito comercial e financeiro, os produtores utilizam o sistema de produção em cativeiro, que constitui em um ambiente favorável à disseminação de doenças, devido à maior densidade populacional dos animais, com o agravante de que o ambiente aquático propicia a proliferação de doenças infecciosas, Desta forma, o uso de medicamentos veterinários constitui-se num recurso importante para amenizar e/ou solucionar este problema, com destaque ao emprego de antimicrobianos da classe das quinolonas e sulfonamidas, por exemplo. A principal via de administração desses medicamentos é por ingestão oral através da ração. Portanto, a incorporação de fármacos na ração é um aspecto crítico e de grande importância quando se visa a garantia da dose de tratamento dos animais, bem como, os riscos relacionados à contaminação ambiental decorrentes de eventual lixiviação dos fármacos da ração para a água. Frente a isso, métodos analíticos voltados para a quantificação de fármacos na ração são imprescindíveis. Diante da vantagem de se contar com um método analítico versátil, capaz de ser aplicado à determinação simultânea de diferentes fármacos, o emprego da eletroforese capilar constitui numa promissora alternativa. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método para análise de seis quinolonas (ciprofloxacino, difloxacino, ofloxacino, ácido oxolínico, flumequina e enrofloxacino) e quatro sulfonamidas (sulfametazina, sulfadimetoxina, sulfametoxazol e sulfatiazol) simultaneamente por eletroforese capilar. Para isso, foi utilizado um capilar de sílica fundida, de 50 cm de comprimento efetivo e 75 ?m de diâmetro interno e eletrólito de corrida composto por uma solução de borato de sódio na concentração de 40 mmol L-1, 15% de metanol e pH 8,5, corrente de 60 ?A, temperatura de 35 °C e detecção em 255 nm. Nessas condições, houve a separação dos dez fármacos em menos de 20 minutos. Os parâmetros de desempenho analítico, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação, seletividade e robustez foram avaliados e estão de acordo com os requisitos preconizados pelos guias oficiais. O método foi aplicado para quantificar os fármacos na ração após a incorporação e no estudo de lixiviação dos fármacos. Após 10 minutos de exposição na água, houve uma perda significativa de CIPRO (11%) e MTZ (16%), correspondendo a 1,650 mg g-1/peixe/dia e 2,400 mg g-1/peixe/dia, respectivamente. Assim, a lixiviação mostrou ser um fator que deve ser considerado na terapêutica dos animais na piscicultura, uma vez que pode contribuir para ineficiência do tratamento, resistência bacteriana e prejudicar a qualidade da água. / Fish farming has been prominent at the national level, since Brazil has a significant availability of water resources and favorable geographical and climatic conditions that allow the creation of exotic and native species. Due to commercial and financial purposes, producers use the captive production system, which is an environment conducive to the spread of diseases, due to the greater population density of the animals, with the aggravating circumstance that the aquatic environment leads to the proliferation of infectious diseases. Thus, one of the technologies used to solve this problem is the use of veterinary drugs, in which antimicrobials of the quinolones and sulphonamides class. The main route of administration of these drugs is by oral ingestion through feed. The incorporation of drugs in feed is a critical aspect and of great importance when it comes to a guarantee of the dose of treatment of the animals, as well as the risks related to environmental contamination resulting from leaching of the drugs from the feed to a water. Therefore, analytical methods for the quantification of drugs in feed are essential. Given the advantage of having a versatile analytical method capable of being applied to the simultaneous determination of different drugs, the use of capillary electrophoresis constitutes a promising alternative. In this context, the aim of this study was to develop and validate a method for the analysis of six quinolones (ciprofloxacin, difloxacin, ofloxacin, oxolinic acid, flumequine and enrofloxacin) and four sulfonamides (sulfamethazine, sulfadethoxine, sulfamethoxazole and sulfathiazole) simultaneously by capillary electrophoresis. For this, a fused silica capillary of 50 cm in effective length and 75 ?m internal diameter and running electrolyte composed of a sodium borate solution in the concentration of 35 mmol L-1, 15% of methanol and pH 8.5, current 60 ?A, temperature of 35 ° C and detection at 255 nm. Under final conditions, all analytes were separations in less than 20 minutes. The parameters of analytical performance, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and detection, selectivity and robustness were evaluated and are in accordance with the requirements recommended by the official guides. The method was applied to quantify the drugs in the feed after the incorporation and in the study of the leaching of the drugs. After 10 minutes of exposure in the water, there was a significant loss of CIPRO (11%) and MTZ (16%), corresponding to 1,650 mg g-1/fish/day and 2,400 mg g-1/fish/day, respectively. Thus, leaching has been shown to be a factor that should be considered in the treatment of animals in fish farming, since it may contribute to inefficiency of treatment, bacterial resistance and impair water quality.

Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixa massa molecular, que tem como principal função a regulação dos níveis de metais nos organismos. A caracterização das MTs da cianobactéria Synechococcus PCC 7942 por eletroforese capilar foi feita em comparação com os padrões comerciais de MTs de rim de cavalo e de fígado de coelho. As MTs de mamíferos apresentam diferentes arranjos moleculares, classificadas em isoformas. Na aplicação da eletroforese capilar como metodologia analítica para a otimização da separação das isoformas existentes, foram investigados a influência da composição da solução eletrolítica, variações da voltagem, comprimento do capilar e diâmetro interno do capilar. Os perfis eletroforéticos das misturas das MTs purificadas a partir de rim de cavalo e fígado de coelho comparados com a de cianobactéria mostraram uma diferenciação no tempo de migração. Para a separação foram testados eletrólitos tais como fosfato, borato e TRIS-HCl, sendo que os melhores resultados foram obtidos com o tampão TRIS-HCl (70 mM, pH 8,2) com adição de 5% de metanol. A separação eletroforética foi testada em capilares de sílica fundida de 75 e 25 m d.i., comprimento de 40, 50 e 60 cm. As soluções das amostras em volume de 327 nL foram introduzidas por injeção hidrodinâmica. As diferenças de potencial testadas foram de 10, 15, 20 e 25 kV. As melhores condições de separação foram atingidas empregado TRIS-HCl com 5% metanol como solução eletrolítica, em capilar de 60 cm e diferença de potencial de 20 kV o que estabilizou a corrente de separação em 42 \'mü\'A. Os resultados mostraram que a eletroforese capilar mostrou-se eficiente para separação das MTs de mamifero e da Synechococcus devido às diferenças de carga e tamanho das moléculas / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins, which main functions are the regulation of metals levels in the body and detoxification. The capillary electrophoresis (CE) characterization of MT from Synechococcus cyanobacteria was attained by comparison with commercial standards of horse kidney and rabbit liver MTs. The influence of electrolyte, such as phosphate, borate and TRIS-HCl buffers on the separation performance were tested. Also, parameters such as voltage potential, capillary length and capillary inner diameter were investigated to attain optimized separation of mammal and Synechococcus MTs. The electrophoretic profiles of MTs revealed four abundant metallothionein isoforms for the horse kidney sample, one for rabbit liver MTII and two for cyanobacteria Synechococcus. The separation by CE of horse and cyanobacteria MTs mixtures differentiated two sets of signals, the first with four peaks corresponding to the horse sample and the last to Synechococcus. The mixture of rabbit liver MT and cyanobacteria MTs presented a first peak for rabbit MTII and a second for cyanobacteria. Tests were performed trying phosphate, borate and TRIS-HCl buffers, however the best results were attained with TRIS-HCl buffer (70 mM, pH 8.2) with addition of 5% methanol. Different capillary lengths of 40, 50 and 60 cm and two internal diameters of 75 and 25m were tested. Also, voltages of 10, 15, 20 and 25 kV were studied. The best experimental conditions were attained using a 60 cm long capillary, TRIS-HCl plus 5% methanol as electrolyte, the application of 20 kV which allowed maintaining a separation current of 42 \'mü\'A. Results demonstrated that capillary electrophoresis was efficient for separation of MTs of mammals from that of Synechoccocus due their differences on size to charge

Este trabalho de doutorado apresenta o desenvolvimento de novas tecnologias para fabricação de microsistemas analíticos e detecção eletroquímica. Primeiramente, a poliuretana elastomérica, derivada de uma fonte renovável, o óleo de mamona, foi utilizada como um novo e alternativo material para fabricação de microdispositivos. Foram avaliadas as características físicas dos microcanais formados por moldagem, a compatibilidade química com solventes e eletrólitos, as características de superfície através dos ângulos de contato, o EOF em diferentes pHs e a performance analítica em experimentos de eletroforese com detecção eletroquímica. A segunda parte do trabalho apresenta o desenvolvimento de um método para a determinação simultânea de azo-corantes comumente usados na indústria alimentícia. Amaranto, amarelo crepúsculo FCF, amarelo sólido AB, ponceu 4R e vermelho 2G, foram separados e quantificados através de eletroforese em microdispositivos com detecção eletroquímica. Foram estudados e otimizados vários parâmetros que influenciaram a separação eletroforética e detecção eletroquímica, em experimentos realizados usando microdispositivos de vidro e eletrodo de trabalho de carbono vítreo. Finalmente, a terceira parte desse trabalho apresenta o uso das propriedades magnéticas e eletrocatalíticas de nanofios de níquel no desenvolvimento de um detector adaptativo magneticamente modulável para eletroforese em microdispositivos. / The development of microfluidic analytical systems has witnessed an explosive growth during the last 15 years. Particular attention has been given to microchip electrophoresis because of their fast and efficient separation capabilities. Electrochemistry detection offers considerable promise for such microfluidic systems, with features that include remarkable sensitivity, inherent miniaturization and portability, low cost, and high compatibility with microfabrication technologies. This thesis shows the development of new fabrication technologies for miniaturized analytical systems with electrochemical detection and it is presented in four chapters, Chapter I shows an introductory view of the main aspects related to miniaturization of analytical systems and amperometric detection configurations commonly coupled to microchip electrophoresis. In Chapter II, the use of elastomeric polyurethane (PU), derived from castor oil (CO) biosource, as a new material for fabrication of microfluidic devices by rapid prototyping is presented. Including the irreversible sealing step, PU microchips were fabricated in less than 1 h by casting PU resin directly on the positive high-relief molds fabricated by standard photolithography and nickel electrodeposition. Physical characterization of microchannels was performed by scanning electron microscopy (SEM) and profilometry. Polymer surface was characterized using contact angle measurements and the results showed that the hydrophilicity of the PU surface increases after oxygen plasma treatment. The polymer surface demonstrated the capability of generating an electroosmotic flow (EOF) of 2.6 × 10-4 cm2 V-1 s-1 at pH 7 in the cathode direction, which was characterized by current monitoring method at different pH values. The compatibility of PU with a wide range of solvents and electrolytes was tested by determining its degree of swelling over a 24 h period of contact. The performance of microfluidic systems fabricated using this new material was evaluated by fabricating miniaturized capillary electrophoresis systems. We used catecholamines as model analytes that were separated in aqueous solutions and detected with end-channel amperometric detection. In Chapter III, a method based on microchip electrophoresis with electrochemical detection has been developed for the simultaneous determination of Yellow AB, Red 2G, Sunset Yellow, Ponceu 4R, and Amaranth which are azo-dyes frequently added to foodstuffs. Factors affecting both separation and detection processes were examined and optimized, with best performance achieved by using a 10 mM phosphate buffer (pH 11) as running buffer and applying a voltage of 2500 V both in the separation and in the electrokinetic injection (duration 4 s). Under these optimal conditions, the target dye analytes could be separated and detected within 300 s by applying a detection potential of -1,0 V (vs. Ag/AgCl) to the glassy carbon (GC) working electrode. The recorded peaks were characterized by a good repeatability (RSD = 1,8 - 3,2%), high sensitivity, and a wide linear range. Detection limits of 3.8, 3.4, 3.6, 9.1, 15.1 ?M were obtained for Yellow AB, Red 2G, Sunset Yellow, Ponceu 4R, and Amaranth, respectively. Fast, sensitive, and selective response makes the new microchip protocol very attractive for the quantitative analysis of commercial soft drinks and candies Finally, in Chapter IV, we demonstrate for the first time the use of adaptive functional nickel nanowires for switching on demand operation of microfluidic devices. Controlled reversible magnetic positioning and orientation of these nanowires at the microchannel outlet offers modulation of the detection and separation processes, respectively. The former facilitates switching between active and passive detection states to allow the microchip to be periodically activated to perform a measurement and reset it to the passive (\"off\") state between measurements. Fine magnetic tuning of the separation process (post channel broadening of the analyte zone) is achieved by reversibly modulating the nanowire orientation (i.e., detector alignment) at the channel outlet. The concept can be extended to other microchip functions and stimuli-responsive materials and holds great promise for regulating the operation of microfluidic devices in reaction to specific needs or unforeseen scenarios.

A crescente demanda por produtos farmacêuticos tem como consequência a necessidade de elaboração de novos procedimentos analíticos que, via de regra, apresentem características como: elevada frequência analítica, simplicidade, ausência de substâncias altamente tóxicas, e com baixo custo para o controle de qualidade dos fármacos lançados no mercado. Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de procedimentos para determinação de N-acetilcisteína (NAC), nimesulida (NMS), trimetoprima (TMP) e sulfametoxazol (SMX) em formulações farmacêuticas usando técnicas eletroanalíticas e métodos de separação. Na determinação da NAC foi usado um eletrodo de grafite pirolítico modificado com ftalocianina de cobalto (CoPc) em 0,1 mol L-1 de NaOH. Este sensor mostrou intensa catálise para NAC produzindo um aumento na corrente anódica de cerca de 700 vezes quando comparado com o eletrodo limpo. Um procedimento em FIA foi proposto usando este sensor, e a curva analítica foi linear no intervalo 5,0 × 10-5 a 1,0 × 10-3 mol L-1, com coeficiente de correlação maior que 0,999. O DPR de 1,1% (n = 13) foi obtido para uma solução contendo 5,0 × 10-4 mol L-1 de NAC. Além disso o método apresentou LD e LQ de 9,0 ×10-7 mol L-1 e 3,0 × 10-6 mol L-1, respectivamente. A determinação eletroanalítica de NMS foi conduzida em solução de 1,0 mol L-1 de NaOH usando eletrodo de carbono vítreo, meio em que não ocorre envenenamento da superfície do eletrodo. Desse modo, um método eletroanalítico usando voltametria de onda quadrada foi elaborado para análise de NMS. Nas condições ótimas de análise o método apresentou uma faixa linear no intervalo de 4,3 × 10-5 a 4,2 × 10-4 mol L-1, com limite de detecção de 3,2 × 10-6 mol L-1. A precisão do método foi avaliada em um mesmo dia de análise por sucessivas medidas voltamétricas (n = 10) em solução de hidróxido de sódio 1,0 mol L-1 contendo 1,0 × 10-4 mol L-1 de NMS, sem a necessidade de renovação da superfície do eletrodo. Os resultados para esta série de medidas foram avaliados e o DPR calculado foi somente 1,2%, indicando que nessas condições o eletrodo apresentou uma resposta estável além de não sofrer qualquer efeito de envenenamento. Para a determinação simultânea de TMP e SMX foi desenvolvido um método analítico empregando eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (C4D). Usando uma solução 10 mmol L-1 lítio-fosfato (pH 7,1 ) como tampão de corrida, a faixa linear de trabalho obtida para ambos os analitos foi de 12,5 a 200 × 10-6 mol L-1 com R > 0,999. Nas condições de análise foram obtidos LDs de 1,1 × 10-6 mol L-1 para a TMP, e 3,3 × 10-6 mol L-1 para o SMX com um tempo total de análise de 2,6 minutos. / The growing demand for pharmaceutical products has created need for developing new analytical procedures that, as a rule, exhibit characteristics like, high sampling rate, simplicity, absence of highly toxic substances, and low cost for quality control of drugs launched in market. In this work, electroanalytical and capillary electrophoresis methods for determination of N-acetylcysteine (NAC), nimesulide (NMS), trimethoprim (TMP) and sulfamethoxazole (SMX) in pharmaceutical formulations were proposed. For NAC determinations a pyrolytic graphite electrode modified with CoPc in 0.1 mol L-1 NaOH was used. This new sensor showed to be catalytic for this compound producing an anodic current increase of 700 times when compared with bare electrode. A FIA procedure was proposed using this new sensor, and the method showed a linear response in a range of 5.0 × 10-5 to 1.0 × 10-3 mol L-1 with correlation coefficient better than 0.999. RSD of 1.1% (n = 13) was obtained for a solution containing 5.0 × 10-4 mol L-1 NAC. Furthermore the method presented DL and QL of 9.0 × 10-7 mol L-1 and 3.0 × 10-6 mol L-1, respectively. NMS electroanalytical determination was conducted in a 1.0 mol L-1 NaOH solution using a glassy carbon electrode. In strongly alkaline medium it was verified that NMS does not produce poisoning of the electrode surface. Thus an electroanalytical method using square wave voltammetry was proposed for analysis of NMS. In the optimal analysis conditions proposed method showed a linear response in a range of 4.3 × 10-5 to 4.2 × 10-4 mol L-1, with detection limit of 3.2 × 10-6 mol L-1. Accuracy of the method was evaluated on the same day by successive voltammetric measurements (n = 10) in a 1.0 mol L-1 sodium hydroxide solution containing 1.0 × 10-4 mol L-1 of NMS without the needing to renew electrode surface. Results for this series of measures were calculated and standard deviation was of only 1.2%, suggesting that in these conditions the electrode showed a stable response in addition to suffer no poisoning effects. For simultaneous determination of TMP and SMX an analytical method using capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (C4D) was developed. Using a 10 mmol L-1 lithium-phosphate (pH 7.1) solution as running buffer, a linear response range for both analytes was obtained ranging through 12.5 to 200 × 10-6 mol L-1 with R> 0.999. Under these analysis conditions, DL of 1.1 × 10-6 mol L-1 for TMP, and 3.3 × 10-6 mol L-1 for SMX were obtained, with a total analysis time of only 2.6 minutes.

Os fungos filamentosos são microrganismos explorados devido ao potencial biotecnológico de seus produtos, nos quais as enzimas têm papel de destaque. Apesar de serem utilizadas em diversos segmentos industriais, as enzimas compõem um mercado que esta em franca expansão e em busca de melhores níveis de produção, de novas atividades enzimáticas, e outros. Os fungos filamentosos possuem mecanismos refinados de resposta a alterações exógenas. Sendo assim, os estudos proteômicos têm se tornado uma excelente ferramenta para explorar proteínas produzidas em resposta às variações ambientais, tais como, pH, fontes de nitrogênio e carbono, temperatura e tipos de bioprocessos. Um grupo especialmente afetado por estas variações é a produção de enzimas biotecnológicas. Neste trabalho, os perfis de proteínas intracelulares e/ou de enzimas secretadas foram identificados nos bioprocessos com Fusarium oxysporum URM 7401 e Myceliophthora thermophila, submetidos a diferentes condições de cultivo. As proteínas intracelulares de Fusarium oxysporum URM 7401, cultivado em bioprocesso submerso com diferentes pH ou fontes de nitrogênio, foram extraídas do micélio e fracionadas por eletroforese bidimensional (2DE). Os spots proteicos foram selecionados e identificados por espectrometria de massas MALDI- TOF/TOF-MS/MS. As proteínas secretadas foram avaliadas quanto às suas atividades enzimáticas utilizando substratos adequados para: peptidase, lipase, amilase, ?-glicosidase, CMCase, FPase, invertase, pectinase, xilanase e lacase. As proteínas presentes nos secretomas de Fusarium oxysporum URM 7401, cultivado em bioprocesso submerso com caseína e farinha de pena, e de Myceliophthora thermophila, cultivado em bioprocesso sólido com resíduos agroindustriais, foram identificadas por espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS e também avaliadas quanto ao potencial de sacarificação de resíduos agroindustriais (farelo de trigo, palha de arroz e palha de soja). As proteínas selecionadas e identificadas, das diferentes condições de cultivo com Fusarium oxysporum URM 7401, em conjunto com os dados de produção enzimática demonstram a influência dos parâmetros dos bioprocessos no metabolismo de compostos, crescimento celular, síntese de nutrientes, estresse oxidativo, entre outros. Além do destaque na produção de enzimas, os extratos dos cultivos com caseína e farinha de pena foram capazes de degradar resíduos agroindustriais. A capacidade lignocelulolítica, conjugada a indução da via das fosfopentoses, sugerem que Fusarium oxysporum URM 7401 também tem potencial para a realização de bioprocesso consolidado e, consequentemente, para a produção de bioetanol. As proteínas do secretoma de Myceliophthora thermophila, quantificadas em ensaios enzimático e identificadas por espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS, reforçaram o potencial hidrolítico e oxidativo deste microrganismo, com destaque especial para o grande número de enzimas ativas sobre carboidratos (CAZy) e oxirredutases. A ação deste arsenal enzimático também foi confirmada nos ensaios de degradação com resíduos agroindustriais; e indicaram um elevado potencial para sacarificação de resíduos ii lignocelulósicos. A compreensão dos mecanismos de produção e/ou secreção de proteínas pode ser auxiliada pela proteômica. Estes mecanismos, complementados pela identificação de enzimas biotecnológicas, podem elucidar as rotas metabólicas desencadeadas pelo microrganismo; e também na elaboração de estratégias que propiciem resultados satisfatórios nos bioprocessos. / Filamentous fungi are very exploited due to biotechnological potential of their products, which enzymes play a prominent role. Although they have been using in several industrial segments, the enzymes belong to an expansion market, that looking for a better levels of production, novel enzymatic activities and other. Filamentous fungi have a refined mechanisms for response to exogenous alterations. Thus, the proteomic studies have been become an excellent tool to explore proteins, which are produced in response to environmental changes, such as pH, nitrogen and carbon sources, temperature and kind of bioprocesses. A protein group that can be influenced by these variations is biotechnological enzymes. In this work, the profiles of intracellular proteins and/or of secreted enzymes were identified in the bioprocesses with Fusarium oxysporum URM 7401 and Myceliophthora thermophila, submitted to different culture conditions. The intracellular proteins from Fusarium oxysporum URM 7401, cultured in submerged bioprocess with various pH values or nitrogen sources, were extracted from mycelium and fractionated by bidimentional electrophoresis (2DE). The spots were selected and identified by MALDI-TOF/TOF-MS/MS mass spectrometry. The secreted proteins were evaluated, for their enzyme activities, using suitable substrates for peptidase, lipase, amylase, ?-glucosidase, CMCase, FPase, invertase, pectinase, xylanase and laccase. The proteins in secretomes from Fusarium oxysporum URM 7401, cultured in submerged bioprocess with casein and feather meal, and from Myceliophthora thermophila, cultured in solid state bioprocess with agroindustrial residues, were identified by LC-ESI-MS/MS mass spectrometer and they were also evaluated for saccharification potential of the agroindustrial residues (wheat bran, rice straw and soybean straw). The selected and identified proteins from Fusarium oxysporum URM 7401, obtained from different culture conditions, in addition to the enzyme production showed that bioprocess parameters influence the metabolism of compounds, cell growth, synthesis of nutrient, oxidative stress, among other. Besides this prominence in enzymes production, the extracts with casein or feather meal were able to degrade agroindustrial residues. The lignocellulolytic ability, conjugated to induction of the phosphopentoses pathways, suggest that Fusarium oxysporum URM 7401 also has potential for performing consolidated bioprocess and, consequently, for bioethanol production. The secretome proteins from Myceliophthora thermophila, quantified in enzymatic assays and identified by mass spectrometer LC-ESI-MS/MS, reinforce the hydrolytic and oxidative potential from this microorganism, with special emphasis for a great number of carbohydrate-active enzymes (CAZy) and oxidoreductases. The action of this enzymatic arsenal was also confirmed by agroindustrial residue degradation assays; and indicated a high potential for lignocellulosic residue saccharifications. The understanding about protein production and/or secretion mechanisms can be supported by proteomics. These mechanisms, complemented by the identification of biotechnological enzymes, can elucidate the metabolic pathways triggered by the microorganism; and can help to design better performing bioprocesses

A eletroforese capilar em microchips (µCE ou MCE) é uma forma diferente de eletroforese capilar que tem se desenvolvido muito nos últimos anos. Essa técnica usa microdispositivos feitos em placas que podem ser de vidro ou polímero contendo canais de dimensões micrométricas ao invés de um capilar de sílica. Ganhos significativos têm sido obtidos em termos de tempo de análise, volume manipulado, dimensões físicas, consumo energético e integrabilidade com outros sistemas. Neste trabalho foi empregada uma técnica diferente de microfabricação, usando toner de impressora laser e folhas de transparência para a construção de dispositivos para microfluídica. A técnica se mostra simples, rápida e excelente para prototipagem. Visando a aplicação desses microchips de toner-poliéster, esse trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de instrumentação para separações químicas usando microdispositivos de toner-poliéster. Fontes de alta-tensão e de corrente foram desenvolvidas usando módulos conversores de baixa para alta-tensão elétrica. As programações das fontes foram feitas usando tensões elétricas geradas por uma placa de aquisição de dados ou por um conversor digital-analógico (DAC) com uma interface de comunicação I2C. Todo o controle foi desenvolvido em sistema GNU/Linux. Um sistema de injeção hidrodinâmico também foi desenvolvido usando um compressor de ar de diafragma juntamente com um sistema de amortecimento pneumático de pulsações e tendo sua pressão interna estabilizada por uma coluna d\'água. Um medidor de pressão eletrônico foi desenvolvido, usando um sensor de pressão, e calibrado com um manômetro de coluna d\'água. Registros de pressão de -10, -1, +1 e +10cm de coluna d\'água em função de diferentes tempos de injeção foram feitos usando um software controlando o acionamento do injetor hidrodinâmico e efetuando leituras do medidor de pressão eletrônico. Os dados mostram que colunas d\'água de 10cm e tempos de injeção maiores que 3 segundos exibem um desvio padrão relativo (RSD) de aproximadamente 0,5% em módulo. uUma proposta diferente de construção de reservatórios é apresentada. Tal proposta usa mantas de silicone e um bloco de acrílico para a definição dos reservatórios. Observou-se que essa configuração promove o estrangulamento dos canais nas microestruturas de toner-poliéster. Assim, a configuração de colagem de reservatórios por pedaços de tubos, mostrou-se melhor para uso com dispositivos de toner-poliéster descartáveis. Uma nova forma de confecção de eletrodos para detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente (C4D) foi desenvolvida usando placas de circuito impresso (PCB). Após a confecção dos eletrodos pelo processo de corrosão de PCB a placa foi recoberta com uma resina para que os espaços entre os eletrodos ficassem da mesma altura da camada de cobre. Essa configuração é simples e permite uma maior integração de circuitos eletrônicos. Testes de separação eletroforética foram feitos usando a instrumentação desenvolvida neste trabalho. Soluções de 100µM dos cloretos de K+, Na+ e Li+ dissolvidos em tampão HLac/His 2mM foram usadas para os testes. Essas espécies foram injetadas eletrocineticamente e separadas usando tampão HLac/His 20mM. A quantificação não foi possível por apresentar irreprodutibilidade no processo de injeção devido ao uso de espécies de elevada mobilidade, juntamente com longos canais de injeção. Também foram realizados testes com amostras de sangue permitindo a separação de K+ e Na+ sem pré-tratamento. Separações isotacoforéticas de 1mM dos cloretos de K+, Na+ e Li+ e 1mM de HCl, como eletrólito líder, e 1mM de cloreto de tetrametilamônio, como terminador, foram realizadas para demonstrar a funcionalidade do sistema em sistemas isotacoforéticos. / The Microchip Capillary Electrophoresis (µCE or MCE) is a different kind of capillary electrophoresis that has been growing. This technique uses devices made with small plates of glass or polymer with a microchannel instead of a silica capilar. Improvements in time analysis, sample volumes, physical dimensions, power consume, and integrability with diferent systems have been archieved. A diferent microfabrication technique using laser printer toner and polyester sheets was used to build devices for microfluidic devices. This tecnique is simple, fast and suitable for prototyping. In this work were developed instruments for use with these toner-polyester microdevices. High-voltage and current sources were developed using high-voltage conversors (DC/HVDC). The programming was obtained by electric voltages from a data acquisition board and a digital-analogic conversor (DAC) with a I2C interface communication. Its control was made in a GNU/Linux System. An hidrodynamic injector was developed using an air compressor with a pulse dumper. The internal pressure was regulated by water column. An electronic manometer was built and calibrated with a water manometer. Recording of pressure using -10, -1, +1, and +10cm water column using different injection times were acquired with a data acquisition system. The data show that when water columns of ca. 10cm and injection times greater than 3 seconds are used, the relative standard deviation (RSD) is about 0.5% in modulus. A different way to build vials is presented. This method uses a silicone mantle and plastic glass block with holes. As a result, channels are stragled due to the poliester sheets. A new way to build electrodes for capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) using printed circuit boards (PCB) is shown. After the corrosion of the copper board, varnish is applied on the board to planify its surface. This configuration is simple and allows good integrability with the electronic circuit. Electrophoretic tests using the instrumentation developed was performed by separation of 100µM K+, Na+ and Li+ solutions in 2mM HLac/His buffer. This solutions were injected by electrokinetic method and separated using 20mM HLac/His buffer under high-voltage. The three species were detected but not quantified due to irreprodutibilities of the electrokinetic injection with high mobility ions. Demonstrative separations of K+ and Na+ were made with the same chemical system and blood samples without pretreatment. Isotacophoretic separations of 1mM K+, Na+, and Li+ in 1mM HCl (leader electrolyte) and 1mM tetramethylammonium (terminate electrolyte) were carried outto demonstrate the system functionality.

A combinação sinérgica da análise por injeção em fluxo com eletroforese capilar, FIA-CE, é um novo campo em rápida expansão, que se estende da simples justaposição de equipamentos (FIA-CE at-line) ao verdadeiro interfaceamento ou hifenação (FIA-CE in-line ou on-line). Tipicamente, circuitos FIA construídos nos laboratórios são interfaceados com equipamentos comerciais de eletroforese capilar providos com detecção espectrofotométrica UV-Vis, e operam sob injeção (ou melhor, transferência) eletrocinética de amostra do circuito FIA para o capilar, vez que esta é mais simples para implementar que a transferência hidrodinâmica. Um novo sistema FIA-CE que combina a detecção condutométrica sem contato elétrico, DCSC, com transferência hidrodinâmica ou eletrocinética de amostra foi projetado e construído no laboratório utilizando-se material de baixo custo, além de uma fonte de alta tensão, uma bomba peristáltica e um microcomputador. No circuito FIA, utilizou-se um único solenóide na construção de injetor multicanal com válvulas de estrangulamento de dimensões reduzidas. O DCSC foi anteriormente desenvolvido por outros componentes do grupo. A interface FIA-CE consiste de uma agulha hipodérmica de aço inoxidável conectada à saída do circuito FIA, atuando como eletrodo aterrado, traspassada pelo capilar. Quatro diferentes eletrólitos podem ser chaveados por intermédio do microcomputador para alimentar o circuito FIA. Na CE, três níveis de pressão podem ser aplicados ao reservatório contendo o eletrodo ao qual se aplica a alta tensão, correspondente ao extremo do capilar mais próximo do detetor: a) potente aspiração, durante o procedimento de limpeza rápida; b) pequena pressão sub-ambiente (ajustada com um pressiostato simples) para a transferência sincronizada de amostra da interface; e c) pressão ambiente, durante a aquisição de dados do eletroferograma. O sistema opera sob controle de um flexível software de código aberto, aceitando procedimentos FIA usuais. As avaliações mostraram, afora a comodidade de uso do sistema, freqüência analítica maior, limites de detecção similares e melhor repetibilidade da área e posição dos picos em comparação a CE operada manualmente. / The synergistic combination of flow injection analysis with capillary electrophoresis, FIA-CE, is a new and rapidly evolving field, comprising juxtaposition of equipments (at-line FIA-CE) and true interfacing or hyphenation (in-line or on-line FIA-CE). Typically, FIA circuits assembled in the laboratory are interfaced to commercial electrophoresis equipments provided with UV-Vis detection and operated under electrokinetic sample injection (or better, transfer from the FIA circuit), that is simpler to implement than hydrodynamic transfer. A new FIA-CE system that combines contactless conductivity detection, CCD, with hydrodynamic and electrokinetic sample transfer was designed and constructed in the laboratory from low cost parts, besides a high voltage supply, a peristaltic pump and a PC. In the FIA circuit, a solenoid actuated multi-channel pinch-valve injector was downsized from a previous prototype. The oscillometric CCD was formerly developed by other components of the group. The interface consists of a hypodermic needle, connected to the FIA circuit and serving as grounded electrode, trespassed by the capillary. Four different electrolytes can be switched by the PC and three levels of pressure can be applied to the vial with the HV electrode and the tip of the capillary near the detector (opposite to the FIA-CE interface): a) strong aspiration, during fast cleansing procedure; b) slightly sub-ambient pressure (adjusted with a simple pressurestat) for synchronized sample transfer at the interface; and c) ambient pressure, during data acquisition of the electropherogram. The system runs under control of flexible, open-code software, accepting usual FIA procedures. Evaluations showed, besides convenience of use, higher analytical frequency, similar detection limits and better repeatability of peak positions and areas in comparison with manually operated CE.

As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes capazes de sobreviver em ambientes com condições adversas, inclusive na presença de metais pesados tal como o cádmio (Cd). Alguns mecanismos celulares de tolerância a metais pesados são o efluxo de íons e destoxificação intracelular. A proteína metalotioneína, a qual foi purificada e seqüenciada na cianobactéria Synechococcus sp. PCC7942, possui a capacidade de quelar alguns metais. A análise do produto gênico (RNAm e/ou proteínas) têm trazido informações interessantes sobre o metabolismo de células submetidas a situações estresse. Esse estudo teve como objetivo analisar as respostas das células da cianobactéria Synechococcus leopoliensis PCC7942 ao Cd. Para isto, foi analisado o padrão de crescimento das culturas, o acúmulo de Cd e a expressão de proteínas da cianobactéria na presença do metal. A concentração máxima de Cd tolerável pela cianobactéria de 3 µM foi determinada através do monitoramento do crescimento de culturas submetidas a diferentes concentrações do metal através da análise de DO750nm. As culturas crescidas nessa concentração do Cd apresentaram um prolongamento na fase de adaptação e maior tempo de duplicação comparando-se as culturas controles (sem metal). O cádmio acumulado pelas células analisado usando GFAAS apresentou valores variando entre 1,0 e 95 µg Cd•g-1 massa fresca, dependendo da fase de crescimento. A análise da especiação do Cd no meio de cultura BG-11 mostrou que havia disponível para as células 0,69 µM de Cd+2 quanto se utilizava a quantidade máxima tolerável (3 µM). A análise de expressão diferencial de proteínas foi feita em culturas expostas a duas concentrações do metal, 3 µM (tolerável) e 100 µM (letal), durante 1 hora, as quais mostraram acúmulo de 15 e 30 µg Cd•g-1 massa fresca, respectivamente. A maioria das proteínas da cianobactéria separadas por eletroforese bidimensional (pH 3-10 e 4,5-5,5) mostrou pontos isoelétricos ácidos, entre a faixa de pH 4 e 6, e a presença de várias isoformas. Trinta proteínas foram expressas diferencialmente, sendo que no tratamento com 3 µM de Cd, duas proteínas foram induzidas e 11 reprimidas, e no tratamento com 100 µM, duas proteínas foram induzidas e 20 reprimidas. Entre as proteínas reprimidas, duas foram comuns em ambos os tratamentos, enquanto que as duas proteínas induzidas em cada tratamento foram diferentes. Algumas dessas proteínas identificadas através de MALDI-TOF foram a rubisco, a qual foi reprimida em 3 µM de Cd; uma proteína da capa do carboxissoma, a qual foi induzida na presença de 100 µM de Cd; a proteína ligadora a DNA (Dpsa) e a isoleucil t-RNA sintetase, ambas induzidas em 3 µM de Cd e reprimidas em 100 µM de Cd. Dessa forma, esses dados mostraram que duas das proteínas afetadas pelo Cd são componentes do sistema fotossintetizante (rubisco e capa protéica do carboxissoma), uma é expressa em condições de estresse oxidativo (Dpsa) e a outra está relacionada com a síntese de proteínas contendo isoleucina (isoleucil-tRNA sintetase). / Cyanobacteria are photosynthetic prokaryotes capable of surviving in adverse environmental conditions, including the presence of heavy metals such as cadmium (Cd). Some cellular mechanisms of heavy metal tolerance are ion efflux and intracellular detoxification. The metallothionein protein, which was purified and sequenced in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942, possesses the ability to bind some metals. The analysis of gene products (mRNA and/or proteins) has provided interesting information about cell metabolism under stress conditions. The aim of this study was to analyze the Cd response of the cyanobacterium S. leooliensis PCC7942 cells. For this purpose, the pattern of culture growth, cadmium accumulation, and cyanobacterial protein expression in the presence of the metal was analyzed. The maximum tolerable Cd concentration of 3 µM by the cyanobacterium was determined by monitoring culture growth submitted to different concentrations of the metal using OD750nm analysis. The cultures grown in this Cd concentration had an extended lag phase and a higher doubling time compared to the control cultures (without metal). Cadmium accumulated by the cells analyzed using GFAAS showed values varying between 1.0 and 95 µg Cd•g-1 fresh matter, depending on the growth phase. Speciation analysis of Cd in the growth medium BG-11 showed that 0.69 µM of Cd2+ was available to the cells when the maximum tolerable amount was used (3 µM). Analysis of the proteins with differential expression was done using cultures exposed for 1 hour to two metal concentrations, 3 µM (non-lethal) and 100 µM (lethal), which showed accumulation of 15 and 30 µg Cd•g-1 fresh matter, respectively. The majority of the cyanobacterial proteins separated by two-dimensional electrophoresis (pH 3-10 and 4,5-5,5) showed pI between pH 4 and 6, and the presence of several isoforms. Thirty proteins were differentially expressed, where two proteins were up-regulated and 11 down-regulated in the treatment with 3 µM of Cd and two proteins were up-regulated and 20 down-regulated in the treatment with100 µM of Cd. Among the down-regulated proteins, two were common in both treatments while the two up-regulated proteins from each treatment were different. Some of the proteins identified by MALDI-TOF were rubisco, which was down-regulated in 3 µM of Cd; a carboxysome shell protein, which was up-regulated in100 µM of Cd; the DNA-binding protein, Dpsa, and a isoleucyl-tRNA sinthetase, both up-regulated in 3 µM of Cd and down-regulated in100 µM of Cd. Thus, these data showed that the two proteins affected by Cd are components of the photosynthetic system (rubisco and carboxysome shell protein), one is expressed under oxidative stress condition (Dpsa) and the other one is related to protein synthesis containing isoleucine (isoleucyl-tRNA sinthetase).

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.

A proteína ligada à vitamina D (VDBP) é a principal responsável pelo transporte dos metabólitos da vitamina D e a sua presença na urina pode indicar lesão tubulointersticial, conforme observado em ratos e humanos. A determinação urinária da proteína ligada ao retinol (RBP), responsável por carrear o retinol do fígado para os tecidos periféricos, por sua vez, está associada à fibrose intersticial dos rins. A albuminúria pode estar relacionada a lesões glomerulares e/ou tubulares (não reabsorção). A proteína de Tamm-Horsfall (THP) normalmente é observada na urina, sendo sintetizada exclusivamente pelas células epiteliais da alça de Henle e do túbulo contornado distal, entretanto quando não detectada, pode indicar lesão nestes segmentos do néfron e/ou diminuição do número de néfrons. Em cães, há poucos estudos sobre as referidas proteínas na urina, especialmente nos casos de doença renal crônica (DRC). A hipótese deste estudo seria de que a avaliação da razão proteína:creatinina urinária (RPC) em cães com DRC per si não forneceria informações suficientes, pois não identificaria os segmentos dos néfrons comprometidos, mas que a determinação de proteínas específicas, pela análise conjunta da eletroforese e do Western blotting, sinalizariam a presença de lesões glomerulares e/ou tubulares, e que a THP poderia estar ausente ou presente em menor intensidade nos estágios avançados da DRC, indicando lesão tubular distal e/ou perda importante do número de néfrons. O presente estudo objetivou avaliar a presença de albumina, VDBP, RBP e THP na urina de cães com DRC, nos estágios 1 ao 4 (IRIS), pela análise conjunta da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blotting. O total de 49 cães compuseram os grupos: grupo C clinicamente normal (n= 9), grupo E1 (estágio 1; n=10), grupo E2 (estágio 2; n=10), grupo E3 (estágio 3; n=10) e grupo E4 (estágio 4; n=10). Houve o predomínio de bandas de proteínas de baixo peso molecular (PM <60kDa) em todos os grupos de cães com DRC (E1, E2, E3 e E4), e especificamente para o grupo E4 que apresentava média da RPC de 4,37 e, portanto, esperar-se-ia o predomínio de proteínas de alto PM (PM> 60kDa). Neste grupo, além da imunodetecção da albumina, também foi identificada, em grande intensidade, proteínas de baixo PM (VDBP e RBP). No grupo E3 também foram imunodetectadas a VDBP e RBP, com média da RPC de 1,51 e de 3 a 7 bandas de proteínas de baixo PM. Ainda, a imunodetecção da VDBP e RBP foi constatada nos estágios inicias (E1 e E2) da DRC frente a valores da RPC normais (não proteinúricos), sendo este achado considerado como marcador precoce de lesão renal. A VDBP e RBP não foram identificadas em cães clinicamente normais. A menor intensidade de imunodetecção da THP nos estágios mais avançados pode sugerir mau prognóstico. Conclui-se que o valor da RPC per si não foi capaz de indicar a origem da proteinúria, se glomerular e/ou tubular, sendo necessário, portanto, a análise conjunta da eletroforese (PM) e do Western blotting (albumina, VDBP, RBP e THP) e que, assim, permitiu identificar o segmento do néfron comprometido que acarretou na perda ou na diminuição urinária de proteínas. / Vitamin D-binding protein (VDBP) is the main carrier of the Vitamin D metabolites and its presence in urine is associated with the development of tubulointersticial injury, according to previous studies in rats and humans. Retinol-binding protein (RBP) carries retinol from liver to peripheral tissues, and its urinary detection is also associated with tubulointersticial injury. Albuminuria suggests glomerular lesion, but also may indicate tubular dysfunction (impairment of reabsorption). The presence of Tamm-Horsfall protein (THP) is expected in the urine of clinically normal people and animals, because it is synthesized exclusively by the epithelial cells of the distal segment of nephron, and when it is not detected it may indicate distal tubular injury and/or massive nephrons loss. However in dogs, there are few studies about these urinary proteins especially in cases of chronic kidney disease (CKD). The hypothesis of the present study was to investigate that not only urinary protein-to-creatinine ratio (UPC) measurements would be enough to localize properly the injury to a specific nephron site, but also the evaluation of specifics urinary proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting could provide information regarding to the presence of glomerular and/or tubular injury; in addition, less excretion of THP, or its absence in urine, could be associated with advanced stages of CKD. The aim of the present study was to evaluate albumin, VDBP, RBP e THP in the urine of 40 CKD dogs, on stages 1 to 4 (IRIS), by using of electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. Forty-nine dogs were subdivided into: C group healthy dogs (n= 9), E1 group (stage 1; n=10), E2 group (stage 2; n=10), E3 group (stage 3; n=10) e E4 group (stage 4; n=10). The predominance of low molecular weight proteins (MW <60kDa) was detected in all CKD groups, mainly in E4 group that the mean of UPC was 4.37, and then it would be expected high MW proteins findings (MW >60 kDa). In fact, in E4 group, albumin was immunodetected, however low molecular weight proteins (VDBP and RBP) were also detected and in high intensity. VDBP and RBP were also observed in E3 group (mean UPC = 1.51) and 3 to 7 bands of low molecular weight were detected. In the early stages of CKD (E1 and E2 groups), VDBP and RBP were also identified but UPC values were normal (non-proteinuric), which may suggest the role of these proteins as an early marker of renal injury. VDBP and RBP were not detected in healthy dogs. THP was observed in less intensity in the advanced stages of CDK that may suggest bad prognosis. In conclusion, UPC measurement per se was not able to indicate adequately the injury to a specific nephron site (e.g. glomerular and/or tubular), and therefore the additional information of electrophoresis (MW) and Western blotting (VDBP, RBP and THP) testing could allow the identification of the nephron site injured that caused loss (proteinuria) or decrease in urinary proteins.